(Luận văn) phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa (oryza sativa l )

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRƯƠNG KIM OANH lu an n va gh tn to PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA p ie PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN TỪ d oa nl w CÂY LÚA (Oryza sativa L.) ll u nf va an lu oi m LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC z at nh z m co l gm @ an Lu Thái Nguyên - 2019 n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRƯƠNG KIM OANH lu an PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA va n PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN TỪ tn to p ie gh CÂY LÚA (Oryza sativa L.) oa nl w Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học d Mã số ngành: 8420201 ll u nf va an lu oi m LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC z at nh z m co l gm @ Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Tiến Dũng an Lu Thái Nguyên – 2019 n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập riêng tơi nhóm nghiên cứu hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Tiến Dũng Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa công bố hình thức trước Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Thái Nguyên, ngày 02 tháng 11 năm 2019 lu an Học viên n va p ie gh tn to Trương Kim Oanh d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN si ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, lời tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Tiến Dũng tận tình hướng dẫn dìu dắt tơi suốt q trình nghiên cứu thực luận văn Tôi xin cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên thầy cô giáo trường giảng dạy tạo điều kiện cho học tập thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh lu học – Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm truyền dạy kiến an va thức kỹ cho tơi suốt q trình học tập trường, tạo điều kiện n thuận lợi để tơi thực tốt đề tài nghiên cứu to gh tn Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp p ie tập thể lớp Công nghệ sinh học K25, nhóm sinh viên phịng thí nghiệm Sinh học phân tử - Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ thực phẩm, oa nl w người sát cánh bên tôi, giúp đỡ, động viên góp ý cho tơi d suốt q trình học tập hồn thành đề tài an lu Tơi xin chân thành cảm ơn! u nf va Thái Nguyên, ngày 02 tháng 11 năm 2019 Học viên ll oi m z at nh Trương Kim Oanh z m co l gm @ an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN si iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa luận văn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU lu 1.1 Vai trò lúa an va 1.2.Tổng quan promoter n 1.2.1 Khái niệm promoter gh tn to 1.2.2 Phân loại promoter p ie 1.2.3 Điều hòa gene sinh vật nhân chuẩn 1.2.4 Ứng dụng promoter công nghệ gene thực vật 13 oa nl w 1.2.5 Vai trò yếu tố điều hòa Cis 15 d 1.3 Vai trò hạt phấn nghiên cứu chọn tạo giống trồng thích ứng với an lu biến đổi khí hậu 16 u nf va 1.4 Phương pháp chuyển gene thực vật qua Agrobacterium 18 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 ll oi m 2.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 21 z at nh 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 21 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 21 z gm @ 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 21 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 21 l m co 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 21 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 21 an Lu 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 21 http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN n va 2.3.2 Hóa chất 22 si iv 2.3.3 Thiết bị thí nghiệm 23 2.4 Nội dung nghiên cứu 23 2.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn 23 2.4.2 Nội dung 2: Tách dòng promoter chuyên biệt hạt phấn thiết kế vector chuyển gene 23 2.4.3 Nội dung 3: Đánh giá hoạt động promoter mơ hình Arabidopsis 23 2.5 Phương pháp nghiên cứu 23 2.5.1 Nghiên cứu sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn 23 lu an 2.5.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 24 n va 2.5.3 Phương pháp khuyếch đại DNA tổng số kỹ thuật PCR 25 tn to 2.5.4 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 26 gh 2.5.5 Phương pháp thiết kế vector tách dòng promoter 26 p ie 2.5.6 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 27 w 2.5.7 Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp 27 oa nl 2.5.8 Phương pháp tách chiết plasmid 28 d 2.5.9 Phương pháp định lượng DNA 29 lu va an 2.5.10 Phương pháp xác định trình tự 30 u nf 2.5.11 Thiết kế vector biểu GUS 30 ll 2.5.12 Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium 31 m oi 2.5.13 Phương pháp chuyển gene Arabidopsis 32 z at nh 2.5.14 Phương pháp đánh giá hoạt động promoter 33 z CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 gm @ 3.1 Sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn lúa 34 l 3.2 Tách dòng thiết kế vector 36 m co 3.3 Kết nghiên cứu chuyển gene phân tích biểu gen GUS 38 an Lu CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 4.1 Kết luận 42 n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN si v 4.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC 43 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT TỪ VIẾT TẮT VIẾT ĐẦY ĐỦ lu an CaMV Cauliflower mosaic virus ARN pol RNA polymerases TF Transcription factor TBP TATA box binding protein CRE Cis regulatory element IME Intron mediate enhancement ARF Auxin response factors n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN si vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đáp ứng điều kiện bất lợi 16 Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 2.3 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 28 Bảng 3.1 Các gene chuyên biệt hạt phấn lúa vùng promoter tương ứng nghiên cứu 35 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái hoa hạt phấn Arabidopsis điều kiện stress nhiệt độ cao 18 Hình 2.1 Sơ đồ miêu tả phản ứng BP ghép nối gene vector tách dịng 27 Hình 2.2 Sơ đồ miêu tả phân tử DNA tham gia vào phản ứng LR 31 Hình 3.1 Bản đồ nhiệt thể mức độ biểu gene RMP hạt phấn 36 lu an Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc gel agarose 1% để n va sàng lọc khuẩn lạc tái tổ hợp với vector tách dòng pDONR201 vector tn to chuyển gene pKGWFS7 38 gh Hình 3.3 Cấu trúc vector chuyển gene mang promoter RMP 38 p ie Hình 3.4 Kết phân tích chuyển gene PCR với cặp mồi GUS- F/GUS-R 39 w d oa nl Hình 3.5 Biểu gene GUS cụm hoa chuyển gene 41 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN si 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn lúa Dựa vào kết phân tích 64 liệu công bố microarray database (http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/) với gene biểu hạt phấn lúa xác định 1.080 gene chuyên biệt cho hạt phấn (gen biểu hạt phấn), có 410 gene biểu giai đoạn đầu hình thành bào tử (early-microspore) 672 gene giai đoạn hạt phấn trưởng thành (late pollen) Từ liệu chúng tơi lựa chọn 10 gene ứng viên có biểu lu mạnh hạt phấn lúa, ký hiệu RMP (rice microspore preferred gene) từ an n va đến 10 (Hình 3.1 Bảng 3.1) Mức độ biểu gene thể mức độ biểu gene từ thấp đến cao (Hình 3.1) Phân tích vai trò gene gh tn to màu sắc đồ nhiệt (heat map), dải màu từ đen đến vàng cho biết p ie liên quan đến hạt phấn nhận thấy : Gene RMP1 ( Os01g0533400) w mã hóa cho protein Glycoside hydrolase 35 (GH35) có vai trị quan trọng oa nl hình thành cấu trúc tế bào [43] Hiện có khoảng 15 gene mã hóa d protein nhóm GH35 xác định lúa, có số gene liên lu va an quan đến biểu hạt phấn OsBgal10, OsBgal11, OsBgal15, AtGAL7 AtGAL15 [32] Gene RMP2 (Os04g0561900) mã hóa Peptidase S9A u nf ll protein thuộc nhóm prolyl oligopeptidase (POPs) liên quan đến trình tổng m oi hợp hormone tăng cường tính chống chịu tế bào điều kiện stress z at nh [42] Cho tới có 23 gene mã hóa cho nhóm protein oligopeptidase tìm thấy Arabidopsis lúa [45] Gene RMP3 z gm @ (Os12g0637100) mã hóa purple acid phosphatase thuộc nhóm protein l mettallophosphoesterase Một số gene mã hóa protein OsPAPhyla, m co OsPAPhylB, NtPAP12 AtPAP10 chứng minh có vai trị đến biểu gene trình phát triển hạt phấn lúa, thuốc an Lu Arabidopsis [22] Gene RMP4 (Os12g0605900) mã hóa kinase protein có vai n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si 36 trị quan trọng kiểm sốt q trình phát triển ống phấn biểu mạnh suốt trình phát triển hạt phấn, xác định gene RLKs mã hóa protein kinase Arabidopsis gene biểu cao hạt phấn [16] Gene RMP5 (Os06g0681100) mã hóa protein tetratricopetide liên quan đến nảy mầm hạt phấn chứng minh biểu mạnh giai đoạn phát triển hạt phấn ngô Arabidopsis [39] Gene RMP6 ( Os12g0637900) mã hóa CHCH protein, vai trị protein nghiên cứu thực vật đặc biệt hạt phấn [20] Gene RMP7 (Os03g0381000) mã hóa Aldose 1- epimerase protein chứng minh biểu hạt phấn lu an Arabidopsis giai đoạn trưởng thành [37] Tuy nhiên lúa chưa có n va nghiên cứu cơng bố Gene RMP8 (Os01g0899100) mã hóa tn to peptidase C1A có vai trị khác nhau, nhiên chưa chứng minh hạt gh phấn lúa trồng khác Gene RMP9 (Os04g0650200) mã hóa p ie lipolytic protein có vai trị khác trình phát triển hạt phấn Gene RMP10 (Os07g0664600) mã hóa glucose/ribitol dehydrogenease w d hạt oa nl protein có vai trị chủ yếu tăng cường khả chịu mặn giai đoạn nảy mầm an lu Bảng 3.1 Các gene chuyên biệt hạt phấn lúa vùng promoter tương ứng ll u nf va nghiên cứu Protein mã hóa khuếch đại z at nh hàng gene Kích thước vùng promoter oi Mã số ngân m STT Os01g0533400 Glycoside hydrolase, family 35 protein 1,343 bp (-18 to -1,360) RMP2 Os04g0561900 Peptidase S9A, prolyl oligopeptidase family 754 bp (-97 to -850) RMP3 Os12g0637100 Similar to Purple acid phosphatase 1,420 bp (-14 to -1,433) RMP4 Os12g0605900 Similar to Kinase like protein 1,294 bp (-98 to -1,391) RMP5 Os06g0681100 Tetratricopeptide-like helical domain containing protein RMP6 Os12g0637900 CHCH domain containing protein RMP7 Os03g0381000 Similar to Aldose 1-epimerase-like protein RMP8 Os01g0899100 Peptidase C1A, papain family protein RMP9 Os04g0650200 Lipolytic enzyme, G-D-S-L family protein RMP10 Os07g0664600 Glucose/ribitol dehydrogenease family protein z RMP1 gm @ 1,514 bp (-144 to -1,657) l 1,962 bp (-19 to -1,980) m co 2,046 bp (-5 to -2,051) 2,053 bp (-2 to -2,054) an Lu 1,934 bp (-5 to -1,939) 1,924 bp (-22 to -1,946) n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si 37 lu an n va Hình 3.1 Bản đồ nhiệt thể mức độ biểu gene RMP hạt phấn Mức độ biểu gene thể màu sắc từ màu đen đến màu vàng gh tn to Ghi : p ie 3.2 Tách dòng thiết kế vector Lựa chọn gen RMP1 RMP2 để tách dòng promoter thiết kế nl w vector chuyển gene nhằm đánh giá khả hoạt động promoter hạt d oa phấn thông qua gene thị GUS Toàn vùng promoter (5’upstream) an lu gene khuyếch đại PCR đưa vào vector nhân dòng pDONR201 u nf va theo phương pháp Gateway Promoter đưa vào vector pDONR201 phản ứng BP sau biến nạp vào chủng Ecoli DH5α chọn lọc môi ll oi m trường LB đặc bổ sung 50mg/l kháng sinh kanamycin Kết sàng lọc tế z at nh bào tái tổ hợp PCR sử dụng cặp mồi RMP/attB2 Kết cho thấy promoter RMP1, kiểm tra ngẫu nhiên khuẩn lạc môi trường chọn z @ lọc kháng sinh kanamycin với cặp mồi đặc hiệu RMP1-F/attB2 Kết l gm điện di gel thu khuẩn lạc dương tính hiển thị băng đặc hiệu có m co kích thước khoảng 1,34 kb tương ứng với kích thước mong muốn promoter (Hình 3.2a) Để kiểm tra kết tách dịng, ni tăng sinh chủng số an Lu , tách plasmid gửi giải trình tự gene cơng ty COSMOGENETECH http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN n va (http://www.cosmogenetech.com/main.jsp) Hàn Quốc Kết giải trình si 38 tự gene kiểm tra ngân hàng gene NCBI công cụ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) phần mềm Bioedit (http://bioedit software.informer.com/7.2/) Kết cho thấy tồn trình tự promoter RMP1 tách dịng trùng khớp với trình tự promoter gene ngân hàng gene Tương tự tiến hành tách dòng promoter RMP2, kiểm tra ngẫu nhiên khuẩn lạc mơi trường có kháng sinh chọn lọc PCR với cặp mồi đặc hiệu RMP2-F/attB2 thu khuẩn lạc cho kích thước khoảng 754 bp, tương ứng với kích thước vùng promoter RMP2 (Hình 3.2d) Tiến hành ni tăng sinh khuẩn lạc số 1, tách plasmid giải trình tự gene thu lu an kết trùng khớp với promoter gene RMP2 ngân hàng gene NCBI n va Từ kết chứng tỏ tách dịng thành cơng promoter RMP1 tn to RMP2, ký hiệu pDORMP1-1 pDORMP2-1 Để đánh giá khả gh hoạt động, promoter RMP1 RMP2 gắn vào vector chuyển gene p ie pKGWFS7 theo phương pháp Gateway Bằng phản ứng LR tồn trình tự w promoter chèn vào phần ccdB giới hạn hai đầu attR1 attR2 để oa nl điều khiển gen thị GFP GUS hoạt động Kết kiểm tra khuẩn lạc tái d tổ hợp PCR cho thấy, khuẩn lạc dương tính với promoter lu va an RMP1 sử dụng cặp mồi RMP1-F RMP1-R (Hình 3.2b ), điều chứng u nf tỏ phản ứng ghép nối promoter RMP1 với vector pKGWFS7 thành công ll Tương tự, kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi RMP2-F RMP2-R cho thấy m oi khuẩn lạc (1,2,3) cho kích thước khoảng 754 bp tương ứng với chiều dài z at nh promoter RMP2, khuẩn lạc số có kích thước lớn 754 bp nên loại bỏ z (Hình 3.2c ) Kết chứng tỏ promoter RMP1 RMP2 gắn gm @ thành công vào vector chuyển gene pKGWFS7 điều khiển gene thị GFP m co GFP/GUS (Hình 3.3) l GUS Ký hiệu pKG7-RMP1 :: GFP/GUS pKG7-RMP2 :: an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si 39 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc gel agarose 1% để sàng lọc khuẩn lạc tái tổ hợp với vector tách dòng pDONR201 vector chuyển gene pKGWFS7 lu Ghi : an (a,b) Sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi RMP1-F/attB2 (a), va n RMP1-F/R (b) cho kích thước tương ứng 1,34kb, (c,d) Sản phẩm PCR khuẩn tn to lạc với cặp mồi RMP2-F/R (c), RMP2-F/attB2 (d) cho kích thước tương p ie gh ứng 754 bp M : thang chuẩn 1kb ; 1-4 : thứ tự khuẩn lạc kiểm tra d oa nl w ll u nf va an lu z at nh Ghi : oi m Hình 3.3 Cấu trúc vector chuyển gene mang promoter RMP (a) Cấu trúc vector pKG7-RMP1 :: GFP/GUS (b) Cấu trúc vector z @ pKG7-RMP2 :: GFP/GUS ; LB : Left border, RB : right border, T35S : trình m co l gm tự kết thúc, Kam : vùng gene chọn lọc kanamycin 3.3 Kết nghiên cứu chuyển gene phân tích biểu gen GUS an Lu Để đánh giá hoạt động promoter RMP1 RMP2, tiến http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN n va hành chuyển cấu trúc RMP1 ::GFP/GUS RMP2 ::GFP/GUS vào si 40 Arabidopsis thaliana 21 ngày tuổi thông qua vi khuẩn A.tumefaciens Kết thu 25 chuyển gene RMP1 20 RMP2 hệ T1, khác phát triển môi trường kháng sinh kanamycin Những chuyển gen chuyển trồng chậu đất để thu hoạch hạt cho thí nghiệm sâu Đồng thời để khẳng định có mặt gen thị GUS `các dòng chuyển gen tiến hành phân tích ngẫu nhiên 14 chuyển gene PCR với cặp mồi GUS-F GUSR PCR cho phép nhân số lượng lớn nguyên đoạn DNA thời gian ngắn Đây phương pháp thường dùng phân lu an tích dịng chuyển gen độ tin cậy cao Theo lí thuyết ta cung cấp cặp n va mồi đặc hiệu nhân xác đoạn gen nằm hai mồi Khi tn to tiến hành PCR DNA tách từ chuyển gen, cho kết gh đặc hiệu với cặp mồi ta kết luận mang đoạn gen p ie cần chuyển gen GUS có gắn promoter đặc hiệu RMP1 RMP2 Sau w tách chiết DNA, tiến hành điện di gel agarose 2% để kiểm tra thu d oa nl kết cho thấy tất cho kết dương tính (Hình 3.4) ll u nf va an lu oi m z at nh Hình 3.4 Kết phân tích chuyển gene PCR với cặp mồi GUS- z F/GUS-R gm @ Ghi : m co l M : marker 1kb ; (+) đối chứng dương tính ; (-) đối chứng âm tính ; từ đến : chuyển gene RMP1 ; từ 8-14 : chuyển gene RMP2 an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN si 41 Phân tích biểu gene GUS cụm hoa cho thấy mức độ biểu khác chuyển gene RMP1 RMP2 Gene GUS biểu mạnh tất giai đoạn phát triển hạt phấn điều khiển promoter RMP1 (Hình 3.5) Ở chuyển gene RMP2 mức độ biểu gene GUS yếu (Hình 3.5) Đồng thời đối chứng khơng chuyển gen hạt phấn khơng biểu màu xanh đặc trưng khơng có gen thị RMP1 ::GFP/GUS RMP2 ::GFP/GUS Mặt khác phận khác lá, thân chuyển gen không biểu màu xanh gen lu an thị GUS hạt phấn Kết phân tích biểu gene GUS cụm hoa n va chuyển gene hoàn toàn phù hợp với kết phân tích biểu tn to gene RMP1 RMP2 dựa sở liệu heat-map (Hình 3.1) Điều gh khẳng định promoter RMP1 RMP2 hoạt động chuyên biệt hạt phấn p ie d oa nl w va an lu RMP1 RMP2 ll u nf Đ/c khơng chuyển gen oi m Hình 3.5 Biểu gene GUS cụm hoa chuyển gene Ghi : z at nh Màu xanh (mũi tên) biểu gene GUS z m co l gm @ an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN si 42 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu kết luận : - Đã sàng lọc 10 gene có biểu chuyên biệt hạt phấn lúa dựa đồ nhiệt heat-map, ký hiệu RMP1 đến RMP10 - Tách dòng thiết kế thành công vector chuyển gene mang promoter RMP1 RMP2 có kích thước 1343 bp 734 bp, ký hiệu pKG7-RMP1 :: GFP/GUS pKG7-RMP2 :: GFP/GUS lu - Chuyển thành công vector chuyển gene vào Arabidopsis để đánh an va giá hoạt động promoter Phân tích 14 chuyển gene PCR cho n kết dương tính với gene GUS Phân tích biểu gene GUS Cả hai gh tn to promoter hoạt động hạt phấn chuyển gene RMP1 RMP2 p ie 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu đánh giá toàn diện khả hoạt động oa nl w promoter RMP1 RMP2 lúa mở rộng đối tượng trồng d khác trước đưa vào ứng dụng điều khiển gene mục tiêu ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gene Việt Nam Bộ sách chuyên khảo, NXB Khoa học Công nghệ, Hà Nội Bộ Nông nghiệp PTNT (2014), Báo cáo kết thực kế hoạch tháng 12 năm 2014 ngành Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Trung tâm tin học thống kê, Hà Nội Chu Đức Hà, Lê Tiến Dũng (2015), “Vai trò yếu tố điều hòa Cis đáp ứng thực vật với điều kiện bất lợi” , Báo tạp chí sinh học, lu 37(3), tr 370-383 an va Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), “Promoter n ứng dụng cơng nghệ gen thực vật”, Tạp chí cơng nghệ sinh to gh tn học, 5(1), tr.118 p ie Nguyễn Ánh Hồng (2000), Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gene thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội oa nl w Võ Thị Thương Lan (2011), Sinh học phân tử tế bào ứng dụng, NXB d Giáo Dục Việt Nam an lu Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa u nf va học kỹ thuật, Hà Nội Lê Duy Thành, Tạ Đoàn, Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2007), Di truyền ll oi m học , NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội z at nh Nguyễn Thị Thúy Quỳnh , Nguyễn Huy Hoàng , Hao Jen Hoang (2016) ‚“Nghiên cứu hoạt động promoter LRR-RLK VIII điều khiển tính chống z 14(3), tr 499-505 l gm @ chịu arsenic mơ hình Arabidopsis”, tạp chí Cơng nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội m co 10 Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy (1998), Hệ thống học thực vật, NXB an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si 44 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 12 Aida M., Ishida T., Fukaki H., Fujisawa H., Tasaka M (1997), “Genes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cupshaped cotyledon mutant, Plant Cell, 9, pp 841 - 857 13 Bae HK, Kang HG, Kim GJ, Eu HJ, Oh SA, Song JT, Chung IK, Eun MY, Park SK (2010), “Transgeneic rice plants carrying RNA interference constructs of AOS (allene oxide synthase) genes show severe male sterility”, Plant Breed , 129, pp 647 – 651 14 Benfey P N., Chua N H (1990), “ The cauliflower mosaic virus 35S lu an promoter: combinatorial regulation of transcription in plants”, Science, va n 250(4983), pp 959966 tn to 15 Bevan M., Walsh S (2005), “The Arabidopsis Genome: a foundation for ie gh plant research”, Genome Reseearch, 15(12), pp 1632 -1642 p 16 Chang F., Gu Y., Ma H., Yang Z (2013), “ AtPRK2 promotes ROP1 nl w activation via RopGEFs in the control of polarized pollen tube growth”, d oa Mol Plant, 6, pp 1187-1201 an lu 17 Christensen A.H & Quail P.H (1996), “ Ubiquitin promoter-based va vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker ll u nf genes in monocotyledonous plants”, Transgenic Research, 5, pp 213 oi m - 218 z at nh 18 Conkling M A., C L Cheng, Y T Yamamoto and H M Goodman (1990), “ Isolation of transcriptionally regulated tobacco”, Plant z Physiology, 93(3), pp 1203 -1211 @ l gm 19 Clough (1998), “ Floral dip: a simplified method for Agrobacteriummediated transformation of Arabidopsis thaliana ”, lant J., 16(6), pp m co 735 - 743 of coiled-coil helix n http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN coiled-coil va mechanism an Lu 20 Darshi M.,Trinh K., Murphy A., Taylor S (2012), “Targeting and import si 45 helix domain-containing protein (ChChd3) into the mitochondrial intermembrane space”, J Biol Chem, 287, pp 39480-39491 21 Davis D L., Nielsen M T (1999), Tobaco Production, Chemistry and technology B Blackwell Science, 467 22 Dionisio G., Madsen C K., Holm P B., Welinder K G., Jorgenesen M., Stoger E., Arcalis E., Brinch – Pedersen H (2011), “Cloning and characterization of purple acid phosphatase phytases from wheat (Triticum aestivum L.), barley(Hordeum vulgage L.), maize (Zea maize lu an L.) and rice (Oryza sativa L.)”, Plant Physiol, 156, pp 1087-1100 n va 23 Ditt R F., Nester E W and Comai L (2005), “ The plant cell defense tn to andAgrobacterium tumefaciens” , FEMS Microbiology letters, 247, pp gh 207-213 p ie 24 Gelvin S B (2003), “Agrobacterium - mediated plant transformation t he w biology behind the “Gene - jockeying” Tool”, Microbiology and oa nl Molecular Biology Reviews, 67 (1), pp 16 - 37 d 25 Grierson C S., Barnes S R., Chase M W., Clarke M., Grierson D., lu va an Edwards K J., Jellis G J., Jones D J., Knapp S., OldroydG., Poppy G., u nf Temple P., Williams R., and Bastow R., (2011), “One hundred ll important questions facing plant science research”, New Phytologist, oi m 192, pp –12 z at nh 26 Grover A., Twell D & Schleiff E (2016) Pollen as a target of changes, Plant Reprod, z environmental 29, @ https://doi.org/10.1007/s00497-016-0285-7 gm l 27 Hays J B (2002), “Arabidopsis thaliana, a versatile model system for an Lu pp 579- 600 m co study of eukaryotic genome-maintenance functions”, DNA repair , 1(8), n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si 46 28 Ho M W., A Ryan and J Cummins (1999), “ Cauliflower mosaic viral promoter-a recipe for disaster?”, Microbial Ecology in Health and Disease, 11(4), pp 194-197 29 Honys D., Oh S A., Renak D., Donders M., Solcova B., Johnson J A., Boudova R., Twell D (2006), “ Identification of microspore-active promotes that allow targeted manipulation of gene expression at early stages of microgametogenesis in Arabidospsis” , BMC Plant Biol, 6, pp 31 30 Hohn T., Futterer J (1992), Transcriptional and translational control of lu an gene expression in cauliflower mosaic virus”, Current opinion in n va genetics & development, 2(1), pp 90 - 96 tn to 31 Huang J W, J T Chen, W P Yu, L F Shyur, A Y Wang, H Y Sung synthase isogenes and differential regulation of their expressions”, p ie gh and J C Su (1996), “ Complete structures of three rice sucrose Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 60(2), pp 233-239 w beta-galactosidase and d of oa nl 32 Huraba P., Honys D., Twell D., Capková V., Tupý J (2005), “Expression beta-xylosidase genes lu u nf 931-940 va an 332 during microspore and pollen development” , Planta , 220, pp ll 33 Jefferson R (1987) GUS: Histochemical Staining with X-Gluc, m oi http://stockingerlab.osu.edu, ngày 26/11/2001 z at nh 34 Liu L., Y Zhou, M W Szczerba, X Li and Y Lin (2010), z “Identification and application of a rice senescence-associated gm @ promoter”, Plant physiology, 153(3), pp 1239 -1249 l 35 Nakashima K., Tran L.S., Van Nguyen D., Fujita M., Maruyama K., m co Todaka D., Ito Y., Hayashi N Shinozaki K., Yamaguchi – Shinozaki an Lu K (2007), “Functional analysis of a NAC – type transcription factor n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si 47 OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress – responsive gene expression in rice”, Plant J, 1(4), pp 617-630 36 Noad R J., D S Turner and S N Covey (1997), “ Expression of functional elements inserted into the 35S promoter region of infectious cauliflower mosaic virus replicons”, Nucleic acids research, 25(6), pp 1123 – 1129 37 Noir S., Brautigam A., Colby T., Schmidt J., Panstruga R (2005), “A reference map of the Arabidospsis thaliana mature pollen proteome”, Biochem Biophys Res Commun, 337, pp 1257-1266 lu an 38 Paupiere M J., van Heusden A W., Bovy A G (2014), “The metabolic n va basis of pollen thermo-tolerance: perspectives for breeding”, tn to Metabolites, 4, pp 889-920 calmodulinbinding protein with tetratricopeptide repeats”, J Biol Chem, p ie gh 39 Safadi F., Reddy V S., Reddy A S (2000), “A pollen-specific novel 275, pp 35457-35470 w oa nl 40 Swapna L., Khurana R., Kumar S.V., Tyagi A.K., Rao K.V (2011), d “Pollen – specific expression of Oryza sativa indica pollen allergene lu va an gene (OSIPA) promoter in rice and Arabidospsis transgenneic u nf systems”, Mol Biotechnol, 48 49-50, 10.1007/s 12033-010-9347-5 ll 41 Tan H., Liang W., Hu J., Zhang D (2012), “ MTR1 encodes a secretory m oi fasciclin glycoprotein required for male reproductive development in z at nh rice”, Dev Cell, 22, pp 1127-37 z 42 Tan C M., Chen R J , Zhang J H., Gao X L., Li L H., Wang P R., gm @ Deng X J., Xu Z J (2013), “ OsPOP5, a prolyl oligopeptidase family m co J Mol Sci , 14, pp 20204-20219 l gene from rice confers abiotic stress tolerance in Escherichia coli”, Int an Lu 43 Tanthanuch W., Chantarangsee M., Maneesan J., Ketudat-Cairns J (2008), “ Genomic and expression analysis of glycosyl hydrolase n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si 48 family 35 genes from rice (Oryza sativa L.)”, BMC Plant Biol, 8, pp 84 44 The Arabidopsis Genome Initiative (2000), “Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana”, Nature, 408, pp 796 - 815 45 Tripathi L., Sowdhamini R (2006), “ Cross geneome comparisons of serine proteases in Arabidospsis and rice, BMC Geneomics, 7, pp 200 46 Turner D S., D G McCallum and S N Covey (1996), “ Roles of the 35S promoter and multiple overtapping domains in the pathogenicity of the lu an pararetrovirus cauliflower mosaic virus”, Journal of virology, 70(8), n va 4514 tn to 47 Yin Y., L Chen and R Beachy (1997), “ Promoter elements required for The Plant Journal, 12 (5), pp 1179-1188 p ie gh phloem- specific gene expression from the RTBV promoter in rice”, w 48 Yu W P., A Y Wang, R H Juang, H Y Sung and J C Su (1992), “ oa nl Isolation and sequences of rice sucrose synthase cDNA and genomic d DNA”, Plant molecular biology, 18(1), pp 139 -142 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si 49 PHỤ LỤC ( Bài báo khoa học ) BÁO CÁO KHOA HỌC PROCEEDINGS HỘI NGHỊ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC TỒN QUỐC 2018 “ SÀNG LỌC VÀ TÁCH DỊNG MỘT SỐ PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa L.)” Nguyễn Tiến Dũng*, Trần Thị Mai, Trương Kim Oanh, Nguyễn Thị Tình, Nguyễn Văn Duy, Nguyễn Xuân Vũ, Nguyễn Hữu Thọ, Ngơ Xn Bình Khoa Cơng nghệ sinh học – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN si