(Luận văn) nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex pcr phát hiện nhanh và đồng thời tụ cầu vàng (staphylococcus aureus) và trực trùng mủ xanh (psedomonas aeruginosa)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM lu an n va tn to gh NGUYỄN KHẮC KHÁNH p ie Tên đề tài: d oa nl w Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát nhanh đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) Trực trùng mủ xanh (Psedomonas aeruginosa) ll u nf va an lu KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC : oi m Hệ đào tạo Chính quy z at nh Cơng nghệ Sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2012-2016 z Chuyên ngành/ngành: m co l gm @ an Lu n va Thái Nguyên - 2016 ac th si i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM lu NGUYỄN KHẮC KHÁNH an n va Tên đề tài: tn to NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN VÀ TRỰC TRÙNG MỦ XANH (Psedomonas aeruginosa) p ie gh NHANH VÀ ĐỒNG THỜI TỤ CẦU VÀNG (Staphylococcus aureus w d oa nl KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC an lu : Chính quy u nf va Hệ đào tạo Chuyên ngành/Ngành: Công nghệ Sinh học ll m : K44-CNSH oi Lớp z at nh : CNSH & CNTP Khóa học : 2012-2016 z Khoa @ BS NGUYỄN THỊ HUYỀN gm Giảng viên hƣớng dẫn: m co l TS NGUYỄN VĂN DUY an Lu Thái Nguyên, năm 2016 n va ac th si ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi hướng dẫn tận tình tơi q trình thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến BS Nguyễn Thị Huyền, Trưởng khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên, lu KTV Nguyễn Thị Thủy, CN Trần Trung Anh, Khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện an n va Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên hỗ trợ,giúp đỡ cung cấp gh tn to chủng sinh vật để thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn cán phịng thí nghiệm thuộc khoa p ie Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm w Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa luận tốt oa nl nghiệp d Tôi xin chân thành cảm ơn người bạn bên cạnh động lu ll u nf va an viên giúp đỡ học tập làm việc hồn thành khóa luận Thái Ngun, ngày tháng năm 2016 m oi Sinh viên z at nh Nguyễn Khắc Khánh z m co l gm @ an Lu n va ac th si iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.2 Các hóa chất sử dụng đề tài nghiên cứu 23 Bảng 3.3 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 4.1 Kết thử nghiệm phản ứng multilplex PCR mẫu thu thập Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên 40 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh hiển tế bào Staphylococcus aureus Hình 2.2 Hình ảnh khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa Hình 4.1 Kết điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số chủng S aureus (A) chủng P aeruginosa (B) 29 Hình 4.2 Kết điện di kiểm tra khả khuếch đại gen mục tiêu cặp mồi sử dụng nghiên cứu 31 lu Hình 4.3 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR điều kiện phản ứng an khác 33 va n Hình 4.4 Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR sử gh tn to dụng khuôn chủng S aureus P aeruginosa 35 ie Hình 4.5 Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR p nồng độ DNA pha loãng khác 37 oa nl w Hình 4.6 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng khuôn khác 38 d ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si v MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài: 1.3 Ý nghĩa đề tài lu 1.3.1 Ý nghĩa khoa học an n va 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2.1.Giới thiệu chung Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa4 gh tn to PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU p ie 2.1.1 Giới thiệu chung Staphylococcus aureus w 2.1.2 Giới thiệu chung Pseumonase aeruginosa oa nl 2.2 Tình hình nghiên cứu Staphylococcus aureus Pseudomonas d aeruginosa nước giới 12 lu an 2.2.1 Tình hình nghiên cứu Staphylococcus aureus 12 u nf va 2.2.2 Tình hình nghiên cứu Pseudomonas aeruginosa 14 ll 2.3 Các phương pháp phát Staphylococcus aureus Pseudomonas m oi aeruginosa 17 z at nh 2.3.1 Phương pháp phát Staphylococcus aureus 17 2.3.1.3 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) 18 z gm @ 2.3.2 Các phương pháp xác định Pseudomonas aeruginosa 19 2.4.Tổng quan kỹ thuật multiplex PCR 20 l m co PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 an Lu 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 22 n va ac th si vi 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 22 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 22 3.2.1.Địa điểm nghiên cứu 22 3.2.2.Thời gian nghiên cứu 22 3.3 Vật liệu nghiên cứu 22 3.3.1 Các cặp mồi sử dụng đề tài 22 3.3.2 Hóa chất sử dụng đề tài 23 lu 3.3.3 Dụng cụ thiết bị sử dụng qua trình thực đề tài 24 an 3.4 Nội dung nghiên cứu 24 va n 3.5 Phương pháp nghiên cứu 25 gh tn to 3.5.1 Phương pháp tách chiết DNA 25 p ie 3.5.2 Phản ứng multiplex PCR phát nhanh đồng thời Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa 26 nl w 3.5.3 Phương pháp xác định nồng độ tế bào 27 d oa 3.5.3 Phương pháp xác định ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR an lu 27 u nf va 3.5.4 Xác định độ đặc hiệu phản ứng multiplex PCR 28 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 ll oi m 4.1 Kết tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn nghiên cứu 29 z at nh 4.2 Kết xây dựng quy trình phát nhanh đồng thời S aureus P aeruginosa kỹ thuật multiplex PCR 30 z 4.2.1 Kết thử nghiệm khả khuếch đại gen mục tiêu cặp mồi gm @ sử dụng nghiên cứu 30 l m co 4.2.2 Kết xác định điều kiện chung phản ứng PCR sử dụng cặp mồi riêng rẽ 32 an Lu n va ac th si vii 4.2.3 Kết thử nghiệm khả khuếch đại phản ứng multiplex PCR 35 4.2.4 Kết xác định ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR 36 4.2.5 Kết xác định độ đặc hiệu phản ứng multiplex PCR 38 4.3 Kết thử nghiệm phát nhanh đồng thời S aureus P aeruginosa từ mẫu thu thập bệnh viện 39 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 lu 5.2 Kiến nghị 41 an TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) thách thức mối tuân tâm hàng đầu Việt Nam toàn giới Những nghiên cứu gần cho thấy NKBV làm tăng tỷ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện, tăng việc sử dụng kháng sinh, tăng đề kháng kháng sinh tăng chi phí điều trị Thống kê cho thấy tỷ lNKBV khoảng 5-10% nước phát triển lu số nước phát triển tỷ lệ lên đến 25% [30] tỷ lệ cao an n va khoa Hồi Sức Tích Cực NKBV làm gia tăng tỷ lệ tử vong 37.000 ca/năm [14] , Mỹ tỷ lệ lên tới 99.000 ca/năm Các bệnh gh tn to bệnh viện Tại Cộng đồng Châu Âu, tỷ lệ tử vong nhiễm trùng bệnh viện p ie nguyên gây NKBV có mức độ đề kháng kháng sinh cao với bệnh nguyên gây nhiễm khuẩn cộng đồng, đồng thời NKBV có thời gian nằm oa nl w viện trung bình dài hơn, từ 7-14 ngày Do đó, chi phí cho NKBV thường tăng d gấp 2-4 lần so với trường hợp khơng NKBV Chi phí phát sinh NKBV lu an Anh quốc khoảng tỷ USD Mỹ 28-45 tỷ USD[11] u nf va Staphylococcsu aureus Pseudomonas aeruginosa hai tác ll nhân gây nhiễm trùng bệnh viện phổ biến Ngoài việc thực m oi quy trình phát S aureus P aeruginosa chủ yếu z at nh phương pháp vi sinh Phương pháp thực phức tạp qua nhiều công đoạn nuôi cấy kiểm tra sản phẩm thu gặp khó khăn có khả z gm @ nhầm lẫn loại vi sinh vật với Trong việc xác định nhanh xác loại vi sinh vật góp phần giảm nguyên nhân lây lan cộng m co l đồng Với trình độ khoa học kỹ thuật ngày đại kéo theo người an Lu ngày am hiểu giải thích rõ ràng quan điểm kỹ thuật n va ac th si sinh học phân tử Qua việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào lĩnh vực đời sống ngày rộng rãi, đặc biệt sinh học phân tử ứng dụng mạnh mẽ vào lĩnh vực y khoa mang lại chẩn đốn xác nhanh chóng xác định vi sinh vật gây bệnh Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng rộng rãi : kỹ thuật PCR, kỹ thuật multiplex PCR, ELISA kỹ thuật PCR với độ đặc hiệu cao thời gian cho kết nhanh chóng ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác Xuất phát từ tình hình thực tiễn dựa điều kiện sở vật chất lu khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm trường Đại Học Nông an Lâm Thái Nguyên tiến hành thực đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu va n ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát nhanh đồng thời Tụ cầu gh tn to vàng (Staphylococcus aureus) Trực trùng mủ xanh (Psedomonas ie aeruginosa).” p 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài nl w 1.2.1 Mục tiêu đề tài d oa Xây dựng quy trình phát nhanh đồng thời Tụ cầu vàng an lu (Staphylococcus aureus) Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) u nf va kỹ thuật multiplex PCR 1.2.2 Yêu cầu đề tài: ll oi m - Tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn S aureus P z at nh aeruginnosa - Tối ưu phản ứng multiplex PCR phát nhanh đồng thời S z @ aureus P aeruginosa m co khuẩn phân lập Bệnh viện l gm - Thử nghiệm thành công phản ứng multiplex PCR mẫu vi an Lu n va ac th si 33 lu an Hình 4.3 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR điều kiện phản va n ứng khác tn to Đường chạy M Thang chuẩn DNA 100 bp (Enzynomic), đường 1-16: ie gh phản ứng PCR sử dụng cặp mồi OPRLF-OPRLR; đường chạy 17-32: phản p ứng PCR sử dụng cặp mồi NucF-NucR đường chạy: 17: mẫu kiểm chứng nl w âm tính d oa Ghi đường chạy hình 4.3 MgSO4 mM gắn mồi Đường chạy độ lượng gắn MgSO4 u nf chạy độ va lượng Nhiệt Hàm an Đường Nhiệt lu Hàm mồi mM o Đường lượng chạy MgSO4 mM o ( c) ll ( c) Hàm 53 10 59 1,6 55 11 1,6 57 12 1,6 59 1,6 lượng chạy MgSO4 mM o ( c) độ gắn mồi (oc) 17 1,6 53 25 57 18 1,6 53 26 59 61 19 1,6 55 27 61 2,4 53 20 1,6 57 28 2,4 53 13 2,4 55 21 59 29 2,4 55 61 14 2,4 57 22 1,6 61 30 2,4 57 53 15 2,4 59 23 53 31 2,4 59 55 16 2,4 61 24 55 an Lu 1,6 mồi 2,4 61 1,6 l gắn Đường m co 57 độ Nhiệt gm @ z 53 oi 1,6 Hàm z at nh m Nhiệt 32 n va ac th si 34 Dựa vào kết điện di sản phẩm hình 4.3 cho thấy nhiệt độ gắn mồi hàm lượng MgSO4 khác cho băng sản phẩm có cường độ khác So sánh khả khuếch đại cặp mồi OPRLFOPRLR (hàng trên, hình 4.3.) cho thấy: Các đường chạy từ 7-11 có cường độ sáng nhất, giảm dần đường chạy từ 2-6 từ 12-16, đường chạy số 10 tương ứng với điều kiện hàm lượng MgSO4 2,0mM nhiệt độ gắn mồi 59oC cho cường độ rõ nét Điều chứng tỏ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi OPRLF-OPRLR phù hợp điều kiện lu kiện hàm lượng MgSO4 2,0mM nhiệt độ gắn mồi 59oC an Tương tự vậy, so sánh hiệu khuếch đại cặp mồi NucF-NucR va n (hàng dưới, hình 4.3.) cho thấy, thay đổi hàm lượng MgSO4 thành gh tn to phần phản ứng nhiệt độ gắn mồi phản ứng có khác ie hiệu khuếch đại phản ứng PCR không rõ ràng Ở đường chạy p số 26, tương ứng với điều kiện hàm lượng MgSO4 2,0mM nhiệt độ gắn oa nl w mồi 59oC cho hiệu hình thành sản phẩm PCR cao Trong nghiên cứu sử dụng enzyme Taq DNA polymerase d an lu High Fidelity hãng Biobasic, Canada với ion Mg2+ dạng muối u nf va MgSO4 Theo hướng dẫn nhà sản xuất, hàm lượng MgSO4 tối ưu 2,0 mM phần lớn phản ứng PCR Trong kết nghiên cứu cho thấy ll oi m hàm lượng MgSO4 phù hợp 2,0 mM z at nh Từ kết nghiên cứu này, lựa chọn nồng độ MgSO4 2,0 mM nhiệt độ gắn mồi 59oC để thử nghiệm phản ứng multiplex PCR sử z dụng cặp mồi NucF-NucR OPRLF-OPRLR phát nhanh đồng m co l gm @ thời S aureus P aeruginosa an Lu n va ac th si 35 4.2.3 Kết thử nghiệm khả khuếch đại phản ứng multiplex PCR Trong nghiên cứu này, DNA chủng S aureus chủng P aeruginosa trộn lẫn sử dụng làm khuôn cho phản ứng multiplex PCR Phản ứng thực điều kiện hàm lượng MgSO4 2,0mM nhiệt độ gắn mồi 59oC Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR gel agarose 1,5% thể hình 4.4 lu an n va p ie gh tn to nl w d oa Hình 4.4 Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex an lu PCR sử dụng khuôn chủng S aureus P aeruginosa u nf va Dường chạy M Thang chuẩn DNA 100bp; đường chạy Mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy 2-4: mẫu sử dụng khn S aureus P ll oi m aeruginosa z at nh Kết điện di hình 4.4 cho thấy đường chạy số mẫu đối chứng không suất sản phẩm PCR phù hợp với phản ứng kiểm chứng âm tính z Cả đường chạy số 2, xuất , hai băng sản phẩm PCR rõ nét @ l gm với kích thước khác nhau, băng có kích thước khoảng 439bp m co băng có kích thước 483bp tương ứng với kích thước sản phẩm PCR cặp mồi NucF-NucR cặp mồi OPRLF-OPRLR theo lý thuyết an Lu n va ac th si 36 Như vậy, xây dựng điều kiện phù hợp cho phản ứng multplex PCR phát nhanh đồng thời S aureus P aeruginosa với độ đặc hiệu cao Thành phần phản ứng điều kiện chu trình nhiệt phản ứng multiplex cụ thể sau: Thành phần phản ứng gồm: lu an n va p ie gh tn to 10X PCR buffer: 2,5 µl - MgSO4 (20mM): 2,5 µl - dNTPs (2,5 mM): 2,0 µl - Mồi NucF (10 μM): 1,0 µl - Mồi NucR (10(μM): 1,0 µl - Mồi OPRLF (10μM): 1,0 μl - Mồi OPRLR (10μM): 1,0 μl - Taq DNA polymerase (5U/μl): 0,2 µl - DNA khuôn: 2,5 µl - H2O khử ion, khơng chứa Dnase: 11,3 µl nl w - d oa Điều kiện chu trình nhiệt phản ứng là: an lu - Giai đoạn biến tính ban đầu: 95oC phút u nf va - Giai đoạn khuếch đại 40 chu kỳ gồm bước: + Biến tính: 95oC 45 giây ll oi m + Gắn mồi: 53oC 45 giây z at nh + Kéo dài mồi: 72oC 45 giây - Giai đoạn kéo dài cuối cùng: 72oC phút z - Giai đoạn ủ bảo quản: 8oC lấy sản phẩm PCR @ l gm 4.2.4 Kết xác định ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR m co Để xác định ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR, tiến hành nuôi cấy S aureus P aeruginosa riêng rẽ môi trường lỏng an Lu để thu dịch nuôi cấy Tiến hành xác định mật độ tế bào dịch nuôi cấy n va ac th si 37 đồng thời tiến hành tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn DNA tồng số chủng trộn lẫn với sau pha loãng nồng độ khác cách 10 lần sử dụng làm khuôn cho phản ứng multiplex PCR Kết điện di kiểm tra sản phẩm multiplex PCR thể hình 4.5 lu an n va p ie gh tn to PCR nồng độ DNA pha loãng khác oa nl w Hình 4.5 Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex d Đường chạy 1: Mẫu kiểm chứng âm tinh; đường chạy – 10: nồng độ va an lu DNA độ pha loãng từ 10-2 đến 10-10 u nf Kết điện di cho thấy nồng độ DNA thấp dần độ sáng ll băng sản phẩm mờ dần Ở đường chạy số 7, tương ứng với nồng độ m oi DNA pha loãng 10-7, xuất băng DNA tương rõ nét, kích thước z at nh theo lý thuyết hoàn toàn nhận biết mắt thường Ở đường chạy z số 8, tương ứng với độ pha loãng 10-8, băng DNA mờ, khó gm @ nhận biết mắt thường, từ nồng độ pha loãng 10-9 trở (đường chạy số l 9) hồn tồn khơng xuất băng sản phẩm PCR nhận biết mắt m co thường Điều lý giải nồng độ DNA khuôn thấp nên lượng an Lu sản phẩm PCR tạo ít, khơng đủ hình thành băng nhận biết n va ac th si 38 Theo tính tốn mật độ tế bào dịch nuôi cấy ban đầu phương pháp đếm khuẩn lạc, nồng độ DNA độ pha lỗng 10-7 tương đương với có 2,1.102 CFU S aureus 1,3.102 CFU P aeruginosa/ml dịch nuôi cấy Như vậy, phản ứng multiplex PCR xây dựng nghiên cứu cho phép phát S aureus P aeruginosa mật tế bào dung dịch vi khuẩn thấp 210 CFU 130 CFU/ml dịch nuôi cấy 4.2.5 Kết xác định độ đặc hiệu phản ứng multiplex PCR lu Kết kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng multplex PCR thể an hình 4.6 n va p ie gh tn to d oa nl w an lu u nf va Hình 4.6 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng ll khuôn khác oi m Đường chạy Mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy Mẫu S z at nh aureus P aeruginosa; đường chạy Mẫu P aeruginosa; đường chay Mẫu S aureus; đường chạy 6-12 mẫu E coli, S epidermidis; S z Hemophilus spp l gm @ capidis, Salmonella typhi, Steptococcus pneumonia, Klebsiella pneumonia m co Từ kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR cho thấy, sử dụng khuôn hỗn hợp chủng S aureus P aeruginosa an Lu (đường chạy 5), sản phẩm PCR gồm băng DNA phù hợp với kích n va ac th si 39 thước sản phẩm PCR theo lý thuyết Khi sử dụng riêng rẽ khuôn chủng S aureus P aeruginosa, sản phẩm PCR xuất băng DNA kích thước theo lý thuyết Khi sử dụng khn chủng vi khuẩn kiểm định S aureus P aeruginosa (đường chạy từ số đến số 12), khơng có băng sản phẩm PCR hình thành Kết nghiên cứu cho thấy phản ứng multiplex PCR xây dựng đặc hiệu cho việc phát nhanh đồng thời S aureus P aeruginosa phát riêng rẽ loài lu 4.3 Kết thử nghiệm phát nhanh đồng thời S aureus P an aeruginosa từ mẫu thu thập bệnh viện va n Kết thử nghiệm phản ứng multilplex PCR mẫu thu thập gh tn to Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên thể bảng 4.2 p ie Từ kết thử nghiệm thể bảng 4.2 cho thấy, tất mẫu không oa nl w chứa vi khuẩn S aureus P aeruginosa cho kết âm tính (khơng có sản phẩm PCR hình thành) d an lu Trong tổng số 12 mẫu xác định kiều hình có chứa vi khuẩn u nf va S aureus, phản ứng multiplex PCR phát xác mẫu (hình thành sản phẩm PCR tương ứng với chủng S aureus), chiếm 66,66% mẫu âm tính ll oi m giả (chiếm 33,33%) Trong số mẫu xác định ni cấy có chứa z at nh P aeruginosa, phản ứng PCR phát xác mẫu (chiếm 75,0%) mẫu cho kết âm tính giả, chiếm 25,0% z Các kết âm tính giả giải thích có nguyên nhân mật @ m co có chứa chất ức chế phản ứng PCR l gm độ tế bào vi khuẩn không đủ lớn để hình thành sản phẩm PCR mẫu an Lu n va ac th si 40 Bảng 4.1 Kết thử nghiệm phản ứng multilplex PCR mẫu thu thập Bệnh viện Đa khoa Trung ƣơng Thái Nguyên Kết kiểm tra STT Mẫu PCR Nuôi cấy - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 8 9 10 10 S aureus S aureus 11 11 - P aeruginosa 24 12 12 - S aureus 25 13 13 P aeruginosa 26 lu Steptococcus Kết kiểm tra STT Mẫu PCR Nuôi cấy 14 14 S aureus S aureus 15 15 - S aureus 16 16 P P aeruginosa aeruginosa 17 17 - S aureus E coli 18 18 S aureus S aureus S aureus S aureus 19 19 S aureus S aureus S aureus S aureus 20 20 - P aeruginosa 21 21 22 23 pneumonia Klebsiella pneumonia Hemophilus an spp n va Enterobacter p ie gh tn to spp P aeruginosa P d oa nl w lu va P P aeruginosa aeruginosa 22 S aureus S aureus 23 - S aureus 24 - an aeruginosa P P aeruginosa ll u nf aeruginosa oi m z at nh P gm aeruginosa aeruginosa 26 S aureus @ 25 l S aureus m co aeruginosa aeruginosa P z P P an Lu Ghi chú: (-): kết kiểm tra âm tính n va ac th si 41 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã tách chiết thành công DNA tổng số chủng vi khuẩn thu thập, DNA tách chiết có độ tinh hàm lượng đủ để tiến hành thí nghiệm Đã xây tối ưu thành công phản ứng multiplex PCR phát nhanh đồng thời tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) trực trùng mủ xanh lu (Pseudomonas aeruginosa) Phản ứng PCR cho phép phát xác an Đã thử nghiệm phản ứng multiplex PCR phát nhanh đồng thời n va 100% phát chủng gh tn to mẫu thu thập Bệnh viên Đa khoa Trung ương Thái Nguyên Phản p ie ứng cho phép phát xác 66,66% số mẫu chứa S aureus w 75% số mẫu chứa P aeruginosa oa nl 5.2 Kiến nghị d - Nên sử dụng kỹ thuật multiplex PCR xây dựng nghiên cứu an lu để phát nhanh S aureus P aeruginosa mẫu chủng u nf va - Tiếp tục thử nghiệm tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR phát ll Tụ cầu vàng Trực trùng mủ xanh mẫu bệnh phẩm để làm tăng tính oi m đặc hiệu phản ứng phát trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt [1] Nguyễn Thị An, Nguyễn Thị Kim Hoàng, Phạm Thị Thùy Dương, Võ Thị Huỳnh Mai, Lê Thị Thu Trúc (2011), Staphylococcus aureus điều cần biết chúng Trường Đh Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM Khoa Môi Trường Và Công Nghệ Sinh Học [2] Hồng Dỗn Cảnh cộng (2014), Tình hình kháng kháng sinh Pseudomonas aeruginosa phân lập bệnh phẩm Viện lu Pasteur , TP Hồ Chí Minh, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Sư an va phạm Thành phố Hồ Chí Minh, (61) n [3] Nguyễn Văn Duy, Phạm Văn Phúc Đỗ Bích Duệ (2014) Ứng dụng kỹ to gh tn thuật PCR đa mồi phát nhanh đồng thời Staphylococcus p ie aureus Salmonella typhi Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển w nông thôn, số tháng năm 2014, trang 152-159 oa nl [4] Nguyễn Trần Hải Hoàng, (2010), Tổng quan Staphylococcus aureus d đề xuất biện pháp phòng ngừa lây nhiễm thực phẩm, Khóa an lu Luận Tốt Nghiệp, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghiệp u nf va TP.HCM, Khoa Môi Trường Và Công Nghệ Sinh Học [5] Lê Bảo Huy, Lê Đức Thắng, Khảo sát tác nhân gây viêm phổi bệnh viện ll m oi tình hình kháng kháng sinh khoa ICU bệnh viện Thống Nhất z at nh 2004-2005, Tập thể khoa hồi sức cấp cứu – Khoa vi sinh bệnh viện Thống Nhất, Tài liệu hội thảo khoa học z gm @ [6] Võ Thị Chi Mai Nhận xét tính kháng thuốc in vitro bệnh viện Chợ Rẫy năm 1997 Bộ môn Vi Sinh, Khoa Y, Đại Học Y Dược – Khoa l m co Vi Sinh, Bệnh viện Chợ Rẫy, 1997 Tài liệu hội thảo khoa học an Lu n va ac th si [7] Trần Thị Xuân Mai (2011), “ phát nhanh salmonella spp., Salmonella Enterica diện thực phẩm băng kỹ thuật PCR đa mồi (Mutiplex PCR)” , tạp chí khoa học 20, tr 198-208 [8] Hồ Việt Mỹ (2004) Nghiên cứu tình trạng nhiễm khuẩn bệnh viện; đề xuất, áp dụng đánh giá biện pháp phòng chống bệnh viện đa khoa tỉnh BVĐK khu vực Bồng Sơn từ năm 2003-2004 Sở y tế Bình Định II Tài liệu tiếng Anh lu [9] Agarwal A., Makker A., Goel S K (2002), “Application of the PCR an technique for a rapid, specific and sensitive detection of Salmonella va n spp in foods”, Mol Cell Probes, 16, pp 243-250 gh tn to [10] Anton Y.P, David C Hooper (2010), “Hospital-Acquired Infections Due to Gram-Negative Bacteria”, N Engl J Med, 362(19), 1804- p ie 1813][ Bush, K., G A Jacoby (2010), “Update functional oa nl w classification of -lactamases”, Antimicrob Agents Chemother, 54, 969-976 d Ayesha Mirza, Haidee T Custodio; Hospital- an lu [11] u nf va AcquiredInfections.Availableathttp://emedicine.medscape.com/artic le/967022-overview.Accessed 20/6/2010 ll oi m [12] Baird R.M, Lee W.H (1995), “Media used in the detection and 26(1):15-24 z at nh enumeration of Staphylococcus aureus”, Int J Food Microbiol, z [13] Berke A., Tilton R C (1986), “Evaluation of Rapid Coagulase Methods @ Staphylococcus aureus”, Journal of clinical microbiology, 23(5), pp 916-919 m co l gm for the Identification of [14] European Center for Disease Prevention and Control.Annual Report on an Lu Epidemiological Communicable n va ac th si DiseasesinEurope.Availableat:http://ecdc.europa.eu/en/files/pdf/Pu blications/081215_AER_long_2008.pdf Accessed July 2009 [15] Freitas C G., Santana A P., Silva P H., Goncalves V S., BarrosMde A., Torres F A., Murata L S., Perecmanis S (2010), “PCR multipex for detection of Salmonella Enteritidis, typhi and typhimurium and occurrence in poultry meat”, Int J Food Microbiol, 139(1-2), pp 15-22 [16] Fueyo M., Martin M.c., Gonzalez- Hevia M.A and Mendoza M.C., lu (2000), “Enterotoxin production and DNA fingreprinting in an Staphylococcus.aureus isolated from human and food samples va n Relations between genetic types and enterotoxins” International to gh tn Journal of Food Microbiology, 67: 139-145 p ie [17] Gales, A C., R N Jones,1 J Turnidge,2 R Rennie,3 and R Ramphal Characterization of Pseudomonas aeruginosa Isolates: Occurrence oa nl w rates, antimicrobial susceptibility patterns, and molecular typing in the global SENTRY antimicrobial surveillance program, 1997– d an lu 1999 Clinical Infectious Diseases, 2001, 32(Suppl 2): S146–55 Mechanisms u nf va [18] Guardabassi L, Courvalin P (2006), Modes of Antimicrobial Action and of Bacterial Resistance, 1-18 In Aarestrup F ll oi m (ed), Antimicrobial Resistance in Bacteria of Animal Origin ASM z at nh Press, Washington, DC [19] Hirose K., Itoh K I., Nakajima H., Kurazono T., Yamaguchi M., Moriya z @ K., Ezaki T., Kawamura Y., Tamura K., Watanabe H (2002), l gm “Selective Amplification oftyv (rfb E), prt (rfb S), viaB, and ficC m co Genes by Mutiplex PCR for Identification of Salmonella enterica Serovars typhi and paratyphi A”, Journal of Clinical Microbiology, an Lu 40(2), pp.633-636 n va ac th si [20] Hirulkar N.B , Bhavna Soni, (2011), Incidence of Antibiotic Resistant Pseudomonas aeruginosa Isolated from Drinking Water, nternational Journal of Pharmaceutical & Biological Archives 2011; 2(2):724-733 [21] Lateef A., Oloke J K., Gueguimkana E B The prevalence of bacterial resistance in clinical, food, water and some environmental samples in Southwest Nigeria Environmental Monitoring and Assessment, 2005, 100: 59–69 lu [22] Malorny B., Bunge C., Helmuth R (2007), “A real-time PCR for the an detection of Salmonella enteritidis in poultry meat and va n consumption eggs”, J Microbiol Methods, 70, pp 245-251 gh tn to [23] Michael R Mulvey, PhD and Andrew E Simor, MD (2009), p ie Antimicrobial resistance in hospitals: How concerned should we be?, CMAJ 2009 Feb 17; 180(4): 408–415 oa nl w [24] Mirakhur A., Gallagher M.J., Ledson M.J., Hart C.A., Walshaw M.J Fosfomycin therapy for multiresistant Pseudomonas aeruginosa in d an lu cystic fibrosis J Cyst Fibros., 2003 Mar, 2(1):19-24 ][Monden u nf va K., Ando E., Iida M., Kumon H Role of fosfomycin in a synergistic combination with ofloxacin against Pseudomonas aeruginosa ll oi m growing in a biofilm J Infect Chemother., 2002 Sep, 8(3):218-26 z at nh [25] Oguntibeju OO1 & Nwobu RAU2, Occurrence of Pseudomonas aeruginosa in post-operative wound infection, Pak J Med Sci July- z gm @ September 2004, Vol 20 No 3: 187-191 [26] Pui C F., Wong W C., Chai L C., Lee H Y., Noorlis A., Zainazor T l m co C T., Tang J Y H., Ghazali F M., Cheah Y K., Nakaguchi Y., Nishibuchi M., Radu S (2011), “Mutiplex PCR for the concurrent an Lu n va ac th si dectection and differentiation of Salmonella spp, Salmonella typhi and Salmonella typhimurium”, Trop Med Health, 39(1), pp 9-15 [27] Sandel M.K., McKillip J.L., (2002), “virulence and recovery of staphylococcus aureus to the food industry using improvement on traditional approaches”, Food control, 15, pp 5-10 [28] Samira Aghamiri, Nour Amirmozafari, Jalil FallahMehrabadi, Babak Fouladtan, and Hossein Samadi Kafil (2014), “Antibiotic Resistance Pattern and Evaluation of Metallo-Beta Lactamase lu Genes Including bla-IMP and bla-VIM Types in Pseudomonas an aeruginosa Isolated from Patients in Tehran Hospitals” ISRN va n Microbiolog, yolume 2014, Article ID 941507, pages gh tn to p ie [29] Taniuchi M., Verweij J J., Houpt E R (2011), “ Mutiplex PCR method to detect Cyclospora, Cystoisospora, and Microsporidia in stool oa nl w samples”, Diagnostic microbiology and infection disease, 71(4), pp.386-390 d an lu [30] WHO World Alliance for Patient Safety Global Patient Safety u nf va Challenge Program 2005-2006 Geneva Switzerland [31] Yves Le Loir, Florence Baron and Michel Gautier (2003), ll oi m Staphylococcus aureus and food poisoning Genetic and Molecular z at nh Research 2, pp 63-76 [32] Zhu Q., Lim C K., Chan Y N (1996), “Detection of Salmonella typhi z by polymerase chain reaction”, J Appl Bacteriol, 80, pp 244-251 l gm @ III Tài liệu internet m co [33] http://medicare.health.vn/cong-dong/tai-lieu/truc-khuan-mu-xanh [34] https://vi.scribd.com/doc/55372088/BAO-CAO-STAPHYLOCOCCUS- an Lu 2(lịch sử phát s) n va ac th si [35].http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:http://repository tnu.edu.vn/bitstream/123456789/2171/1/5155_document_1130638 1135.pdf [36] Wikipedia, https://vi.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus [37] http://luanvan.co/luan-van/tong-quan-ve-staphylococcus-aureus-2021/ [38] https://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_aeruginosa [39].https://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_aeruginosa#Danh_ph.C3.A1p [40].http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:http://repository lu tnu.edu.vn/bitstream/123456789/2171/1/5155_document_1130638 an 1135.pdf va n [41].https://vi.scribd.com/doc/89582184/Phan-L%E1%BA%ADp- to gh tn Staphylococcus-Aureus-T%E1%BB%AB-M%E1%BA%ABu- p ie Mau-B%E1%BB%87nh-Nhan d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si