Đang tải... (xem toàn văn)
Nội dung và phương pháp nghiên cứu Phần 1 MỞ ĐẦU 1 1 Đặt vấn đề Escherichia coli (E coli) là một trong những vi khuẩn phổ biến trong đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng Hầu hết các dòng E co[.]
1 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Escherichia coli (E coli) vi khuẩn phổ biến đường tiêu hóa người động vật máu nóng Hầu hết dịng E coli tồn cách tự nhiên không gây hại đường tiêu hóa Tuy nhiên, số trường hợp, sinh lý thể thay đổi, stress, loạn khuẩn xảy ra, …thì số dịng E coli độc gây bệnh người số lồi động vật Dựa vào đặc điểm gây bệnh, người ta chia E coli thành nhiều nhóm Mỗi nhóm có yếu tố độc lực khác quy định gen độc lực khác Một số gen độc lực quan trọng E coli như: gen ehxA, stx1, stx2, uid nhóm STEC (Shiga toxigenic E coli); gen eae nhóm STEC EPEC (Enteropathogenic E coli); … Nhìn chung, E coli phân lập dễ dàng khắp nơi môi trường nhiễm phân Ngồi ra, E coli cịn phân lập từ vùng nước ấm, không bị ô nhiễm hữu cơ; vi sinh vật tồn phát triển lâu môi trường Với phân bố rộng rãi vậy, E coli dễ dàng vấy nhiễm vào nguyên liệu thức ăn hay nguồn nước quy trình sản xuất khơng đảm bảo vệ sinh nghiêm ngặt Từ đó, gây nên bệnh rối loạn đường tiêu hóa, nhiễm trùng đường tiết niệu, có trường hợp gây tử vong cho người gia súc Do vậy, việc xác định gen độc lực E coli phân gia súc bình thường tiêu chảy cần thiết, góp phần việc chẩn đoán bệnh động vật đánh giá nguy truyền lây sang người qua đường thực phẩm Từ đó, có biện pháp phịng ngừa hữu hiệu nhằm bảo vệ sức khỏe cho người vật nuôi Những tiến công nghệ sinh học với phương pháp PCR giúp chẩn đốn xác, hiệu thời gian ngắn so với phương pháp truyền thống (nuôi cấy, phân lập, …) Vì vậy, đề tài tiến hành sử dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát đồng thời gen độc: stx1, stx2, eae, ehxA, uid E coli phân lập từ phân bò, heo tiêu chảy thịt bò Hy vọng tương lai, đề tài ứng dụng vào thực tiễn chẩn đoán tầm soát bệnh cho gia súc cho người qua đường thực phẩm 1.2 Mục tiêu – yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu - Phát gen độc lực stx1, stx2, eae, ehxA uid E coli, đặc biệt nhóm STEC 1.2.2 Yêu cầu - Phân lập E coli từ phân, thịt số loại môi trường chọn lọc (MAC, SMAC, CT - SMAC) - Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR phát số gen độc lực E coli phân lập Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi khuẩn E coli Vi khuẩn E coli sống bình thường ruột người động vật, nhiều ruột già Vi khuẩn theo phân mơi trường bên ngồi gây nhiễm cho nước, đất, khơng khí, dụng cụ giết mổ, ngun liệu sử dụng chế biến thực phẩm, … 2.1.1 Đặc điểm sinh học Phân loại: vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia Hình thái: trực khuẩn, gram âm, di động, khơng bào tử, giáp mơ, có lơng tơ xung quanh Kích thước: khoảng 0,5 m – m Đặc tính ni cấy: vi khuẩn hiếu khí yếm khí tùy nghi Có thể sinh trưởng nhiệt độ 15 - 400C nhiệt độ thích hợp 37 0C, pH từ 6,4 – 7,4 Mọc tốt môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 hình thành khuẩn lạc trịn, ướt, trắng đục, khoảng – mm Đặc tính sinh hóa: E coli lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrate thành nitrite Để phân biệt E coli với vi khuẩn đường ruột khác, người ta thường sử dụng thử nghiệm IMViC E coli cho kết IMViC là: + + - - hay - + - - (FAO, 1992) 2.1.2 Yếu tố kháng nguyên Vi khuẩn đường ruột E coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp Dựa vào tính chất kháng nguyên, người ta phân chia vi khuẩn loại thành tuýp huyết (serotype) khác (Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, 1996): Kháng nguyên thân O (somatic antigen) kháng nguyên vách tế bào, cấu tạo lipopolysaccharide, có 150 loại khác Đặc tính kháng nguyên O là: Chịu nhiệt, khơng bị hủy đun nóng 100oC Kháng cồn, không bị hủy tiếp xúc với cồn 50% Bị hủy formol 5% Rất độc, cần 0,05 mg đủ để giết chuột nhắt sau 24 Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết tương ứng xảy phản ứng ngưng kết O Kháng nguyên O giữ vai trò định khả gây bệnh dịng vi khuẩn có tính chất chun biệt cho lồi vật chủ Kháng ngun lơng H (flagellar antigen): có 50 loại khác nhau, cấu tạo protein có tính chất khơng chịu nhiệt, bị hủy cồn 50% proteinase, không bị hủy formol 5% Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tương ứng xảy tượng ngưng kết H Kháng ngun giáp mơ K (capsular antigen): có 100 loại khác nằm kháng nguyên O Kháng nguyên K polysaccharide protein Nếu kháng nguyên K che phủ hoàn toàn thân vi khuẩn ngăn cản phản ứng ngưng kết O Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen) giúp E coli bám vào tế bào biểu mô trước xâm lấn đường tiêu hóa hay đường tiết niệu Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): có dạng hình sợi, dài khoảng m, thẳng hay xoắn, đường kính 2,1 – nm, giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc ruột nên quan trọng khả gây bệnh vi khuẩn Hiện có 700 tuýp huyết E coli từ tổ hợp nhóm kháng nguyên O, H, K, F Dựa vào đó, người ta định danh vi khuẩn 2.1.3 Phân loại E coli Để phân loại E coli gây bệnh, người ta dựa vào đặc điểm sinh bệnh như: gen độc lực mã hóa protein gây bệnh cho vật chủ, tác động khác lên màng nhầy ruột, hội chứng lâm sàng khác mặt dịch tễ bệnh Có nhóm E coli gây bệnh (Keskimaki, 2001): (1) E coli sinh độc tố Shiga (STEC- Shiga toxigenic E coli hay VTECVerotoxigenic E coli EHEC Enterohemorrhagic E coli ) (2) E coli gây bệnh đường ruột (EPEC- Enteropathogenic E coli) (3) E coli sinh độc tố đường ruột (ETEC- Enterotoxigenic E coli) (4) E coli bám dính kết tập ruột (EAEC hay EaggEC- Enteroaggregative E coli) (5) E coli công hay xâm lấn đường ruột (EIEC- Enteroinvasive E coli) 2.2 Shiga toxigenic E coli (STEC) Nhóm STEC kết tội liên quan đến nhiều đợt dịch bệnh viêm dày, đe dọa sức khỏe cộng đồng Vào năm đầu thập niên 1980, dòng STEC gây đợt dịch liên quan đến hội chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC) hội chứng huyết niệu (HUS) HUS biểu ba triệu chứng điển hình suy thận cấp, giảm tiểu cầu thiếu máu tan huyết tổn thương mao mạch Bao gồm nhiều serotype khác O26, O111, O113, O124, O145, O157, … (Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, 1996) Hiện nay, người ta cơng nhận dịng STEC gây bệnh nghiêm trọng cho người, đặc biệt O157:H7 serotype STEC gây nhiều ổ dịch lớn khắp giới (Smith ctv, 1988) 2.2.1 Thuật ngữ Những hướng khác nghiên cứu đưa thuật ngữ khác để gọi tên cho nhóm E coli Thuật ngữ Verotoxigenic E coli hay Verocytotoxigenic E coli (VTEC) Konowalchuk ctv (1977) đặt cho nhóm phát việc sản xuất độc tố gây độc dòng tế bào Vero (ở thận khỉ mặt xanh châu Phi) Thuật ngữ Enterohemorrhagic E coli ( EHEC) dòng E coli gây HC HUS (Nataro Kaper, 1998) Và thuật ngữ Shiga toxin-producing E coli (STEC) serotype E coli sản sinh độc tố gây độc tế bào giống độc tố vi khuẩn Shigella (Calderwood ctv, 1996) STEC VTEC hai thuật ngữ tương đương nhau, hai đề cập đến E coli sản sinh hay nhiều độc tố gây độc tế bào Tuy nhiên, khơng phải có gen sản sinh độc tố gây bệnh khơng có yếu tố độc lực khác Những dịng E coli mang gen sản sinh độc tố diện ruột gia súc khỏe mạnh với số lượng ít, dòng thiếu hay vài yếu tố độc lực khác STEC (Beutin ctv, 1995) Do đó, khơng phải tất STEC có khả gây bệnh (Nataro Kaper, 1998) 2.2.2 Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh STEC 2.2.2.1 Độc tố Shiga (Stx) Shigella dysenteriae Kiyoshi Shiga phát năm 1897, sản sinh độc tố thường gọi Shiga Và sau người ta phát STEC sản xuất độc tố tác động tương tự Shiga (Shiga-like toxin) (Nataro Kaper, 1998) Stx ngoại độc tố không bền với nhiệt, tác động lên ruột lẫn hệ thần kinh trung ương Ở ruột, E coli gây tiêu chảy, đồng thời ức chế hấp thu đường axit amin ruột non Ở hệ thần kinh, gây biểu lâm sàng trầm trọng tử vong (Bộ mơn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, 1996) Trong số 200 serotype E coli sản sinh độc tố Stx có 50 serotype gây HC hay HUS người (Nataro Kaper, 1998) Cấu trúc tổ chức gen stx: họ độc tố Stx STEC gồm hai nhóm khơng phản ứng chéo với Stx1 Stx2 Trong Stx1 có tính bảo tồn cao Stx2 thay đổi trình tự, tạo nhiều biến chủng Stx2c, Stx2hp, Stx2e Một dòng STEC sản sinh Stx1 hay Stx2, Stx1 lẫn Stx2, chí nhiều dạng Stx2 Những nghiên cứu đầu thập niên 80 xác định Stx1 Stx2 mã hóa thực khuẩn thể thực khuẩn thể chèn vào nhiễm sắc thể E coli (O’Brien ctv, 1984) Bảng 2.1 Danh pháp thành viên họ Stx Tên gọi Tên gọi trước Gen Protein Shiga toxin (Stx) stx Stx Shiga like toxin I (SLT_I) hay Verotoxin (VT1) stx1 Stx1 SLT_II hay VT2 stx2 Stx2 STL_II c hay VT2c stx2c Stx2c STL_II e hay VT2e stx2e Stx2e (Nguồn: Calderwood ctv, 1996) Tất độc tố Stx gồm hai thành phần cấu tạo (Paton Paton, 1998): - Tiểu đơn vị A , 32 kDa, gồm peptide A 28 kDa peptide A2 kDa nối với cầu nối disulfit Peptide A1 có hoạt tính enzyme peptide A2 có nhiệm vụ gắn kết tiểu đơn vị A vào tiểu đơn vị B - Năm tiểu đơn vị B, có trọng lượng phân tử 7,7 kDa Các tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với thụ thể đặc hiệu Vai trị Stx sinh bệnh: Để gây bệnh, trước tiên Stx phải tiếp nhận thụ thể đặc hiệu Các nghiên cứu cho thấy Stx có tính chất gây độc trực tiếp lên tế bào ruột chúng nhắm đến thụ thể Gb (globotriaosylceramide), dạng thụ thể glycolipid, nhung mao tế bào biểu mô ruột động vật (Stx2e có thụ thể Gb4) Gb3 Gb4 cịn tìm thấy tế bào nội mô thận, tế bào Vero, tế bào Hela Nhờ tính đặc hiệu tương tác phân bố thụ thể thay đổi theo loại tế bào ảnh hưởng đến cách sinh bệnh (Lingwood, 1996) Sau làm hư hại tế bào biểu mô, Stx xuyên qua hàng rào biểu mơ, xâm nhập vào dịng máu tiến đến mơ đích khác có chứa thụ thể glycolipid, gây tổn thương tế bào nội mạch, tế bào thận … Cụ thể tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với thụ thể đặc hiệu Sau chuyển vào bên tế bào, tiểu đơn vị A đến tế bào chất tác động lên tiểu phần 60S ribosome, cắt gốc adenin khỏi rRNA 28S ribosome, gây trở ngại cho tổng hợp protein Vì không tổng hợp protein, tế bào bị Stx tác động chết Hậu gây tiêu chảy, viêm kết tràng xuất huyết (HC) hội chứng huyết niệu (HUS) Trong đó, hậu Stx2e tượng phù thủng heo sau cai sữa (trích dẫn Lê Thị Mai Khanh, 2004) Ảnh hưởng loại Stx sinh bệnh: Các nghiên cứu dịch tễ dòng STEC sản sinh Stx2 gây bệnh trầm trọng so với dòng STEC sản sinh Stx1, bệnh nặng dòng STEC sản sinh Stx1 lẫn Stx2, chẳng hạn HUS (Paton Paton, 1998) 2.2.2.2 Enterohemolysin (haemolysin) Enterohemolysin tồn nhiều dạng (, …) E coli xâm lấn hay sinh độc tố đường ruột (Manil Daube, 2005) Độc tố tìm thấy hầu hết dịng O157:H7 dịng STEC khơng phải O157:H7 Enterohemolysin thuộc nhóm độc tố RTX (Repeats in toxin), gây dung giải tế bào tạo thành lỗ chân lông (RTX family of pore-forming cytolysin) (Paton Paton, 1998) Và RTX diện E coli gây bệnh đường huyết niệu (uropathogenic E coli), Pasteurella haemolytica tác nhân khác gây bệnh cho người, động vật (Bauer Welch, 1996) Haemolysin gen ehxA nằm plasmid 60 MDa pO157 mã hóa Gen ehxA có 60% tương đồng với hlyA; hlyA gen cấu trúc mã hóa haemolysin E coli gây bệnh đường huyết niệu cho kiểu dung huyết -haemolysin (-Hly) Ngoài ra, gen cấu trúc ehxA có nhiều biến thể, chia thành hai nhóm: nhóm gồm nhiều loại EHEC phổ biến O157:H7, O26, O111; đó, nhóm gồm nhiều serotype khác cịn lại có tính chất gây bệnh Gần đây, nghiên cứu di truyền học gen ehxA dịng STEC có trình tự giống 98%, có khác lớn số đoạn trình tự chuyên biệt (Feng Monday, 2000) Beutin ctv (1989) khảo sát khẳng định đa số dòng STEC cho kiểu dung huyết alpha (-Hly) Các dòng sản sinh độc tố khơng gây dung huyết thạch máu tạo thành vòng dung huyết nhỏ, mờ thạch máu cừu (có bổ sung Ca2+) sau ủ qua đêm Hiện tại, phương thức tham gia gây bệnh enterohaemolysin chưa biết rõ Chính dung huyết trở thành nguồn cung cấp Fe kích thích phát triển STEC ống tiêu hoá (Law Kelly, 1995) 2.2.2.3 Yếu tố bám dính Yếu tố bám dính STEC chứng minh đóng vai trị quan trọng định vị vi khuẩn ruột Đó intimin, protein màng ngồi có trọng lượng phân tử 94-97 kDa Intimin mã hóa gen eae (E coli attaching and effacing) Intimin gây tổn thương dạng bám dính phá hủy, gọi bệnh tích A/E (attaching and effacing) ruột già vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg ctv, 1993) Có loại intimin, kí hiệu , , , Trong đó: -intimin thường tìm thấy dịng E coli thuộc nhóm EPEC người chó -intimin có dịng E coli thuộc nhóm EPEC EHEC người thỏ -intimin chủ yếu nhóm STEC người động vật, EPEC người -intimin diện dịng E coli thuộc nhóm EHEC bị người (Oswald ctv, 2000) Có liên quan chặt chẽ gen eae khả gây bệnh trầm trọng dòng STEC người HC HUS Nhiều nghiên cứu tỉ lệ dòng mang gen eae bệnh phẩm người cao gia súc Hơn nữa, diện dòng STEC mang gen eae gia súc thường liên quan đến dòng vi khuẩn E coli độc lực người mà khoa học biết, chúng thuộc serotype O157, O26, O111, … (Sandhu ctv, 1996) Ngồi cịn có yếu tố liên quan đến bám dính tác nhân khác gây bệnh đường ruột bao gồm fimbriae, OMPs (outer membrance proteins) LPS (lipopolysaccharide) 2.2.3 Cách sinh bệnh Cách sinh bệnh trình gồm nhiều bước, liên quan đến tương tác phức tạp số lượng vi khuẩn yếu tố vật chủ Cấp STEC qua đường miệng (chỉ cần liều thấp) vi khuẩn phải sống sót điều kiện mơi trường khắc nghiệt dày chúng phải cạnh tranh với vi khuẩn khác đường ruột để thiết lập định cư Vi khuẩn STEC sống sót đường ruột, nhân lên sản sinh Stx hấp thu qua tế bào biểu mơ ruột, dẫn truyền vào dịng máu Điều cho phép toxin đặc hiệu đến bề mặt tế bào đích gồm tế bào ruột lẫn nội quan khác (Paton Paton, 1998) Định cư vào ống tiêu hố: vi khuẩn có khả bám vào tế bào biểu mô ruột định cư ống tiêu hoá người yếu tố định độc lực Người ta ước tính liều gây nhiễm vài dòng STEC (O111:H- O157:H7) khoảng 1–100 CFU (colony forming unit) (Paton ctv, 1996) 10 Sức đề kháng acid STEC: Nét đặc trưng dòng STEC khả định cư ống tiêu hóa người, với số lượng cảm nhiễm thấp STEC đề kháng pH acid dày Do đó, dịng STEC O157:H7 cịn sống sót thực phẩm acid cao (Leyer ctv, 1995) Tính trạng điều hịa gen rpoS Gen có khả giúp vi khuẩn E coli kéo dài thời gian sống sót pH 2,5 (Paton Paton, 1998) Gần đây, Waterman Small (1996) báo cáo tình trạng đột biến gen Điều góp phần giải thích dịng STEC có khả gây cảm nhiễm khác Kiểu bám vào tế bào biểu mơ ruột: STEC có khả sống sót điều kiện khắc nghiệt dày Chúng phải thiết lập định cư cách bám vào tế bào biểu mô ruột STEC định cư đoạn kết tràng (colon) có lẽ đoạn xa ruột non người; tượng chưa chứng minh trực tiếp Ngay dòng serotype O157:H7 có bám dính khác nhau, điều phản ánh nhiều chế bám khác Vai trị plasmid 60 MDa (pO157) cho STEC bám dính: Hầu hết dòng STEC chứa pO157 Nhiều nghiên cứu phát diện plasmid liên quan đến yếu tố bám (fimbriae) bám dính với tế bào Henle 407 khơng bám vào tế bào HEp-2 Theo Tzipori ctv (1987), có diện plasmid hay khơng có khơng ảnh hưởng đến khả định cư kết tràng STEC khả gây bệnh tích A/E heo sinh cách mổ lấy thai 2.2.4 Khía cạnh lâm sàng Ngày nay, người ta cơng nhận có phân bố rộng bệnh người liên quan đến vi khuẩn sản sinh độc tố Stx Những bệnh liên quan tới STEC thường gắn liền với ổ dịch nhỏ rải rác lẫn ổ dịch lớn có nguồn gốc ngộ độc thực phẩm Nhiều bệnh nhân nhiễm STEC với triệu chứng tiêu chảy, số trường hợp sau hay hai ngày tiêu chảy lẫn máu HC Đau bụng dội thường xảy Đối với bệnh nhân nhiễm STEC gây tình trạng HUS dễ để lại di chứng tổn thương cấp tính thận, thiếu máu dung huyết giảm tiểu cầu Vài cá thể bị HUS có triệu chứng thần kinh bơ phờ, nhức đầu dội, co giật đau não Mặc dù HUS xảy tất nhóm tuổi tỉ lệ mắc bệnh