(Luận văn tốt nghiệp) ứng dụng kỹ thuật vi ghép cải tiến tạo cây cam bố hạ sạch bệnh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐÀO ANH NHẤT Tên đề tài: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT VI GHÉP CẢI TIẾN TẠO RA CÂY CAM BỐ HẠ SẠCH BỆNH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Cơng nghệ sinh học Khoa: CNSH-CNTP Khóa học: 2017 - 2021 THÁI NGUYÊN, NĂM 2021 Luan van ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐÀO ANH NHẤT Tên đề tài: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT VI GHÉP CẢI TIẾN TẠO RA CÂY CAM BỐ HẠ SẠCH BỆNH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Cơng nghệ sinh học Lớp: 49 – CNSH Khoa: CNSH-CNTP Khóa học: 2017 - 2021 Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Duy TS Bùi Tri Thức THÁI NGUYÊN, NĂM 2021 Luan van i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập thực đề tài tốt nghiệp, nỗ lực bản thân, nhận nhiều giúp đỡ, động viên từ Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm khoa tập thể thầy cô giáo, cán viên chức khoa CNSH – CNTP, bạn bè, gia định người thân Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm khoa tập thể thầy cô giáo, cán viên chức khoa CNSH - CNTP tận tình giảng dạy cho tơi suốt năm học vừa qua để tơi hồn thành khóa học Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng, lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Duy người tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS Bùi Tri Thức dành nhiều thời gian quý báu trực tiếp hướng dẫn thực nghiên cứu đề tài Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè quan tâm, ủng hộ động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Do điều kiện thời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi thiếu sót, kính mong thầy giáo bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài tơi hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 28 tháng năm 2021 Sinh Viên Đào Anh Nhất Luan van ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Diện tích, suất, sản lượng cam, quýt giới Bảng 2.2: Diện tích, suất, sản lượng cam, quýt Việt Nam 10 Bảng 3.1 Thiết bị dụng cụ nghiên cứu 17 Bảng 3.2 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 3.3 Trình tự cặp mồi để phát tác nhân gây bệnh greening 19 Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép 20 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm hạt bưởi Diễn 20 Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng tuổi gốc ghép đến hiệu quả vi ghép 21 Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng tuổi mắt ghép đến hiệu quả vi ghép 21 Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng kỹ thuật ghép đến hiệu quả vi ghép 22 Bảng 3.9 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến hiệu quả vi ghép 22 Bảng 4.1 Ảnh hưởng loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép cải tiến (sau 30 ngày vi ghép) 27 Bảng 4.2 Ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm hạt bưởi Diễn (sau tuần gieo hạt) 29 Bảng 4.3 Ảnh hưởng tuổi gốc ghép bưởi Diễn đến hiệu quả vi ghép cam Bố Hạ (sau 30 ngày vi ghép) 30 Luan van iii Bảng 4.4 Ảnh hưởng tuổi mầm ghép đến hiệu quả vi ghép (sau 30 ngày vi ghép) 31 Bảng 4.5 Ảnh hưởng kỹ thuật ghép đến hiệu quả vi ghép (sau 30 ngày vi ghép) 33 Bảng 4.6 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng hiệu quả vi ghép (sau 30 ngày vi ghép) 34 Luan van iv DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 Hình ảnh loại gốc ghép sau 25 ngày gieo hạt tuần vi ghép 28 Hình 4.2 Hình ảnh hạt bưởi sau tuần gieo hạt 29 Hình 4.3 Hình ảnh vi ghép sử dụng gốc ghép với độ tuổi khác (sau 30 ngày thao dõi) 31 Hình 4.4 Hình ảnh vi ghép sử dụng mầm ghép độ tuổi khác (sau 30 ngày theo dõi) 32 Hình 4.5 Hình ảnh vi ghép kỹ thuật sau tuần ghép 33 Hình 4.6 Hình ảnh vi ghép để điều kiện chiếu sáng (sau tuần ghép) 35 Hình 4.7 Cành bị bệnh greening bệnh tristeza 34 Hình 4.8 Kết quả PCR mẫu bị bệnh vi ghép 36 Hình 4.9 Kết quả giám định bệnh tristeza kỹ thuật ELISA 37 Luan van v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ, Thuật ngữ Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ viết tắt cs Cộng VAC Vườn ao chuồng VACR Vườn ao chuồng ruộng MS Mean square PCR ELISA CT FAO CTV Polemerase Chain Reaction: Phản ứng tổng hợp chuỗi trùng hợp Enzyme-linked Immunosorbent assay: Kỹ thuật huỳnh quang miễn dịch liên kết enzyme Công thức Food and Agriculture Organization: Tổ chức Nông Lương Citrus Tristeza Virus: Virus gây bệnh tristeza có múi Luan van vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v MỤC LỤC vi Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1.Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1 Giới thiệu cam, quýt 2.1.1.Nguồn gốc phân loại 2.1.2 Giá trị cam, quýt 2.1.2 Tình hình sản xuất cam, quýt nước giới 2.1.3 Đặc điểm hình thái cam, quýt 10 2.1.4 Yêu cầu sinh thái cam 12 2.2 Bệnh Tristeza Greening gây hại cam 12 2.2.1 Bệnh Tristeza 12 2.2.2 Bệnh vàng gân xanh greening 13 2.3 Các cách nhân giống cam bệnh 14 2.3.1 Nhân giống phương pháp vi ghép đỉnh sinh trưởng 14 2.3.2 Nhân giống phương pháp vi ghép cải tiến 15 Luan van vii Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 17 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 17 3.1.3 Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất sử dụng nghiên cứu 17 3.3 Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Ảnh hưởng loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép 20 3.3.2 Ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm hạt bưởi Diễn 20 3.3.3 Ảnh hưởng tuổi gốc ghép đến hiệu quả vi ghép 21 3.3.4 Ảnh hưởng tuổi mầm ghép đến hiệu quả vi ghép 21 3.3.5 Ảnh hưởng kỹ thuật ghép đến hiệu quả vi ghép 22 3.3.6 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng hiệu quả vi ghép 22 3.3.7 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 22 3.3.8 Phương pháp PCR để phát bị bệnh greening 23 3.3.9 Phương pháp kiểm tra bệnh tristeza kỹ thuật ELISA 24 3.4 Các phương pháp xử lý số liệu 26 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép 27 4.2 Kết quả theo dõi ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm hạt bưởi Diễn 28 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng tuổi gốc ghép đến hiệu quả vi ghép 30 4.4 Kết quả ảnh hưởng tuổi mầm ghép đến hiệu quả vi ghép 31 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kỹ thuật ghép đến hiệu quả vi ghép 32 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng hiệu quả vi ghép 33 4.7 Kết quả kiểm tra bệnh greening bệnh tristeza thị phân tử 35 Luan van viii Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 Luan van 27 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng loại gốc ghép đến hiệu vi ghép Trong kỹ thuật ghép, để ghép sinh trưởng phát triển tốt cần phải lựa chọn gốc ghép phù hợp Các loại gốc ghép thường sử dụng lồi dại, khỏe mạnh, chống chịu tốt, thích nghi với điều kiện mơi trường có quan hệ gần gũi mặt di truyền với ghép Trong nghiên cứu này, để tiến hành vi ghép cải tiến cam Bố Hạ, loại gốc ghép cam, chấp, bưởi diễn lựa chọn để thử nghiệm Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép cải tiến tổng hợp bảng 4.1 dưới đây: Bảng 4.1 Ảnh hưởng loại gốc ghép đến hiệu vi ghép cải tiến (sau 30 ngày vi ghép) Công thức Loại gốc ghép Số lượng gốc ghép Số lượng sống (tỷ lệ %) Số lượng chết (tỷ lệ %) CT1 Gốc cam Hàm Yên 30 100 CT2 Gốc chấp 30 16,6 83,3 CT3 Gốc bưởi Diễn 30 100 Dựa bảng 4.1 cho thấy: Sử dụng loại gốc ghép khác cho tỷ lệ vi ghép sống khác rõ rệt Trong đó, sử dụng cam Hàm Yên làm gốc ghép, 100% số vi ghép bị chết Gốc ghép bưởi Diễn, 100% số vi ghép sống sau 30 ngày theo dõi Trong đó, sử dụng chấp làm gốc ghép, số vi ghép sống 5/30 cây, chiếm tỷ lệ 16,6% Hơn nữa, chấp cam Hàm n lồi có hạt đa phôi, 100% số hạt bưởi Diễn hạt đơn phối Vì vậy, để tạo gốc ghép, nghiên cứu sử dụng hạt đơn phôi để gieo tạo gốc ghép Các thử nghiệm sử dụng hạt đa phôi làm gốc ghép, gốc ghép sinh trưởng yếu, nhỏ không đủ điều kiện để ghép Luan van 28 Sau gieo tuần, gốc ghép đạt kích thước chiều cao cam Hàm Yên, chấp bưởi Diễn 2,8 cm, 3,5 cm 5,0 cm tiến hành vi ghép cải tiến Kết quả cho thấy, sử dụng bưởi Diễn làm gốc ghép, gốc ghép sinh trưởng tốt hơn, kích thước lớn hơn, dễ ghép Cây vi ghép sinh trưởng tốt Từ kết quả thu khẳng định sử dụng bưởi Diễn làm gốc ghép phù hợp để vi ghép cải tiến cam Bố Hạ Do vậy, nghiên cứu chúng tơi sử dụng bưởi Diễn làm gốc ghép Hình 4.1 Hình ảnh loại gốc ghép sau 25 ngày gieo hạt tuần vi ghép A Gốc bưởi Diễn; B Gốc chấp; C Gốc cam Hàm Yên D Mầm ghép gốc bưởi; E Mầm ghép gốc chấp F Mầm ghép gốc cam 4.2 Kết theo dõi ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm hạt bưởi Diễn Điều kiện chiếu sáng ảnh hưởng đến nảy mầm hạt Một số loại hạt môi trường rừng tự nhiên khơng nảy mầm có lượng ánh sáng vừa đủ [17] Trong nghiên cứu này, để tìm hiểu ảnh hưởng thời gian chiếu sáng đến nảy mầm hạt gốc ghép, chúng tơi tiến hành thí nghiệm theo cơng thức với thời gian chiếu sáng/ngày khác nhau, gồm: CT1 h/ngày, CT2 12 h/ngày CT3 24 h/ngày Dưới kết quả nghiên cứu công thức sau tuần gieo hạt Luan van 29 Bảng 4.2 Ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm hạt bưởi Diễn (sau tuần gieo hạt) Số Công lượng thức hạt Thời gian Số Số lượng chiếu lượng sống sáng chết (tỷ lệ %) (giờ/ngày) (tỷ lệ %) 100 Chất lượng gốc ghép Mầm mập, xanh thẫm CT1 30 CT2 30 12 100 Bình thường, xanh thẫm CT3 30 24 100 Mầm nhỏ, xanh thẫm Dựa kết quả bảng 4.2 cho thấy, tỷ lệ nảy mầm hạt 100% tất cả công thức, điều chứng tỏ ánh sáng khơng ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm hạt bưởi Diễn Tuy nhiên, sau 30 ngày theo dõi, so sánh hình thái mầm cho thấy, hạt chiếu sáng với thời gian khác có hình thái khác Các hạt chiếu sáng h/ngày có mầm mập, màu xanh thẫm, hạt chiếu sáng 12 h/ngày (Công thức 2) có mầm bình thường cịn hạt chiếu sáng 24 h/ngày mầm nhỏ Như vậy, hạt chiếu sáng h/ngày cho chất lượng mầm tốt nhất, tỷ lệ nảy mầm 100% Do đó, chúng tơi chọn thời gian chiếu sáng h/ngày tuần để tạo bưởi Diễn làm gốc ghép Hình 4.2 Hình ảnh hạt bưởi sau tuần gieo hạt A Công thức 1; B Công thức 2; C Công thức Luan van 30 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tuổi gốc ghép đến hiệu vi ghép Tuổi gốc ghép tiêu chí quan trọng việc chọn thời điểm phù hợp tiến hành vi ghép để đạt hiệu quả cao vi ghép phát triển tốt Trong nghiên cứu lựa chọn gốc ghép bưởi Diễn, tiến hành vi ghép cải tiến gốc ghép tuần, tuần, tuần tuần tuổi Kết quả thể bảng 4.3 Bảng 4.3 Ảnh hưởng tuổi gốc ghép bưởi Diễn đến hiệu vi ghép cam Bố Hạ (sau 30 ngày vi ghép) Công Độ tuổi Số lượng Số lượng Số lượng chết thức gốc ghép gốc ghép sống ( tỷ lệ %) (tỷ lệ %) CT1 tuần 30 100 CT2 tuần 30 83,33 16,66 CT3 tuần 30 100 CT4 tuần 30 90,0 10,0 Kết quả thể bảng 4.3 cho thấy: Tuổi gốc ghép khác cho tỷ lệ sống sau vi ghép khác Cụ thể, sử dụng gốc ghép tuần tuổi, 100% mầm ghép bị chết Tỷ lệ vi ghép sống tăng dần tuổi mầm ghép tăng từ tuần đến tuân sau giảm xuống sử dụng gốc ghép tuần tuổi Kết quả nghiên cứu cho thấy, công thức 3, sử dụng gốc ghép bưởi Diễn tuần tuổi, tỷ lệ mầm ghép sống, sinh trưởng cao nhất, đạt 100% Trong q trình theo dõi nghiên cứu chúng tơi nhận thấy, gốc ghép giai đoạn tuần tuổi non, yếu, khó ghép, mầm ghép bị chết Khi sử dụng gốc ghép tuần tuổi, gốc ghép cứng dễ bị gãy, khó tiến hành ghép Khi sử dụng gốc ghép tuần tuổi, phần thân gốc ghép cứng, khó thao tác tỷ lệ mầm ghép sống cao (đạt 90%) Cây gốc ghép tuần tuổi có kích thước độ cứng thân phù hợp cho việc ghép mầm cam Bố Hạ, tỷ lệ sống vi ghép cao (100% vi ghép sống, sinh trưởng) Luan van 31 Từ kết quả nghiên cứu rút kết luận sử dụng gốc ghép bưởi Diễn tuần tuổi phù hợp để vi ghép cải tiến cam Bố Hạ Do đó, nghiên cứu tiếp theo, sử dụng gốc ghép bưởi diễn tuần tuổi Hình 4.3 Hình ảnh vi ghép sử dụng gốc ghép với độ tuổi khác (sau 30 ngày thao dõi) A Công thức 1; B Công thức 2; C Công thức 3; D Công thức 4.4 Kết ảnh hưởng tuổi mầm ghép đến hiệu vi ghép Tuổi mầm ghép yếu tố ảnh hưởng đến khả sống, sinh trưởng vi ghép Do đó, nghiên cứu này, chúng tơi lựa chọn vật liệu ghép mầm cam Bố Hạ có độ tuổi từ tuần đến tuần Tiến hành ghép gốc ghép bưởi Diễn tuần tuổi Theo dõi tỷ lệ sống chết sau vi ghép 30 ngày Kết quả tổng hợp bảng 4.4 sau: Bảng 4.4 Ảnh hưởng tuổi mầm ghép đến hiệu vi ghép (sau 30 ngày vi ghép) Công thức Độ tuổi mầm Số lượng Số lượng Số lượng mẫu sống (tỷ lệ %) chết (tỷ lệ %) CT1 tuần tuổi 30 100 CT2 tuần tuổi 30 100 CT3 tuần tuổi 30 100 CT4 tuần tuổi 30 20 80 Luan van 32 Kết quả nghiên cứu cho thấy, sử dụng mầm ghép cam Bố Hạ tuần đến tuần (công thức công thức 2), 100% số vi ghép bị chết sau 30 ngày theo dõi Sử dụng mầm ghép tuần tuổi (từ 21- 24 ngày tuổi), tất cả vi ghép sống, vết ghép liền sẹo với gốc ghép, sinh trưởng tốt, không nhiễm nấm bệnh, không biểu bệnh greening, tristeza Tuy nhiên, sử dụng vật liệu mầm cam Bố Hạ tuần tuổi (công thức 4), tỷ lệ sống sinh trưởng giảm mạnh (chỉ đạt 20% số sống, tương đương với tổng số 30 nghiên cứu) Cây sinh trưởng chậm so với công thức 3, vết ghép lâu liền sẹo Như vậy, sử dụng mắt ghép cam Bố Hạ từ 21 – 24 ngày tuổi tính từ lúc mầm bắt đầu bật phù hợp để tiến hành vi ghép cải tiến gốc ghép bưởi Diễn Hình 4.4 Hình ảnh vi ghép sử dụng mầm ghép độ tuổi khác (sau 30 ngày theo dõi) A Công thức 1; B Công thức 2; C Công thức 3; D Công thức 4.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kỹ thuật ghép đến hiệu vi ghép Các kỹ thuật ghép định sống phát triển vi ghép chúng tiến hành nghiên cứu với kỹ thuật ghép để tìm kỹ thuật ghép tốt cho trình vi ghép cải tiến Dưới kết quả nghiên cứu kỹ thuật ghép vi ghép cải tiến Luan van 33 Bảng 4.5 Ảnh hưởng kỹ thuật ghép đến hiệu vi ghép (sau 30 ngày vi ghép) Công Số lượng Các kỹ thuật Số lượng Số lượng thức ghép ghép sống ( tỷ lệ %) chết (tỷ lệ %) CT1 30 Ghép 100 CT2 30 Ghép áp 100 CT3 30 Ghép hình chữ V 100 Kết quả nghiên cứu bảng 4.5 cho thấy, sử dụng kỹ thuật ghép ghép áp, mầm ghép khơng gắn với gốc ghép, tồn mầm ghép bị chết sau ghép Tuy nhiên, với kỹ thuật ghép hình chữ V, mắt ghép dễ dàng cố định gốc ghép liền sẹo với gốc ghép 100% mầm ghép sống sinh trưởng sau 30 ngày vi ghép (công thức 3) Như kỹ thuật ghép hình chữ V phù hợp cho trình vi ghép cải tiến cam Bố Hạ gốc bưởi Diễn Hình 4.5 Hình ảnh vi ghép kỹ thuật sau tuần ghép A Công thức 1; B Công thức 2; C Công thức 4.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng hiệu vi ghép Bên cạnh nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến tỷ lệ nảy mầm hạt gốc ghép, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng với cường độ khác đến khả sống mầm cam Bố Hạ sau vi ghép Kết quả thể bảng 4.6 dưới đây: Luan van 34 Bảng 4.6 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng hiệu vi ghép (sau 30 ngày vi ghép) Công Số lượng Điều kiện thức chiếu sáng ghép Số lượng Số lượng sống chết (tỷ lệ %) (tỷ lệ %) Đặc điểm vi ghép liền sẹo CT1 30 Không có ánh sáng 100 nhanh, thời gian bật chồi chậm Liền sẹo CT2 30 Ánh sáng yếu 100 chậm, thời gian bật chồi nhanh CT3 30 Ánh sáng trực xạ 100 tuần khơng CT4 30 có ánh sáng + tuần ánh Liền sẹo 100 sáng yếu nhanh, thời gian bật chồi nhanh Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau ghép, đặt điều kiện khơng có ánh sáng điều kiện ánh sáng yếu (2.000 – 2.500 lux), tỷ lệ vi ghép sống 100% sau 30 ngày theo dõi Tuy nhiên, khơng chiếu sáng có thời gian liền sẹo với gốc ghép nhanh thời gian bật chồi chậm so với đặt điều kiện ánh sáng yếu Đối với vi ghép công thức 4, sau vi ghép đặt bóng tối tuần đưa điều kiện chiếu sáng yếu, thời gian liền sẹo thời gian bật chồi nhanh nhất, tỷ lệ sống 100% Luan van 35 Hình 4.6 Hình ảnh vi ghép để điều kiện chiếu sáng (sau tuần ghép) A Công thức 1; B Công thức 2; C Công thức 3; D Công thức 4.7 Kết kiểm tra bệnh greening bệnh tristeza thị phân tử Bệnh greening bệnh tristeza bệnh phổ biến, gây thiệt hại nặng nề cho nghề trồng cam Vì vậy, sản xuất cần thiết phải tạo bệnh loại bệnh Trong nghiên cứu này, tạo 18 cam Bố Hạ kỹ thuật vi ghép cải tiến từ nguồn vật liệu ban đầu cam Bố Hạ bị bệnh không bị bệnh Tất cả giám định bệnh kỹ thuật sinh học phân tử Hình 4.7 Cành bị bệnh greening bệnh tristeza A Cây bị bệnh greening; B Cây bị bệnh tristeza Để giám định bệnh greening vi ghép, kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu theo công bố Hung cs, năm 2004 Trong nghiên cứu này, mẫu cam sử dụng để tách chiết DNA tổng số Mẫu DNA tổng số sử dụng làm khn cho phản ứng PCR Nếu mẫu hình thành sản phẩm PCR có Luan van 36 kích thước khoảng 226 bp thể mẫu phân tích bị nhiễm bệnh greening, kết quả PCR âm tính thể mẫu không bị bệnh greening Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR từ mẫu nghiên cứu thể hình 4.8 Hình 4.8 Kết PCR mẫu bị bệnh vi ghép Đường chạy M Thang chuẩn DNA, đường chạy số số Mẫu cam Bố Hạ bị bệnh greening sử dụng để lấy mắt ghép; đường chạy từ số – 20: mẫu vi ghép Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR hình 4.8 cho thấy: đường chạy số số hình thành băng sản phẩm PCR có kích thước khoảng 226 bp Đây sản phẩm đặc hiệu khuếch đại cặp mồi G-F G-R từ nguồn mẫu có nhiễm bệnh greening Chứng tỏ mẫu nhiễm bệnh greening Kết quả phù hợp với kiểu hình cam Bố Hạ bị bệnh greening sử dụng để lấy mắt ghép ban đầu Các mẫu đường chạy từ số đến số 20 khơng hình thành sản phẩm PCR chứng tỏ mẫu không nhiễm bệnh Kết quả cho phép khẳng định cả 18 cam Bố Hạ vi ghép cải tiến không mang mầm bệnh greening Chứng tỏ kỹ thuật vi ghép cải tiến phát triển nghiên cứu bệnh dù vật liệu ban đầu mắt ghép từ bị bệnh không bị bệnh greening Để phát bệnh tristeza, sử dụng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đặc hiệu với virus gây bệnh tristeza hãng Agritest, Italia cung cấp Trong kỹ thuật này, mẫu phát phương pháp hiển thị mầu đặc trưng sử dụng chất dietanolammine Nếu giếng ELISA hiển thị màu vàng có cường độ cao so với giếng đối chứng âm tính thể có Luan van 37 mặt kháng nguyên virus gây bệnh tristeza Ngược lại, giếng hiển thị màu vàng có cường độ thấp cường độ màu giếng đối chứng âm tính khẳng định mẫu phân tích khơng nhiễm bệnh tristeza Kết quả phát bệnh tristeza vi ghép kỹ thuật ELISA thể hình 4.9 dưới đây: Hình 4.9 Kết giám định bệnh tristeza kỹ thuật ELISA Kết quả giám định bệnh tristeza kỹ thuật ELISA hình 4.9 cho thấy: Đối với mẫu bị bệnh tristeza làm mẫu so sánh (giếng 1c, 1d, 3c 3d), kết quả hiển thị mầu cho thấy cường độ mầu cao so với mẫu kiểm chứng âm tính (giếng 1b 3b) phù hợp với kết quả kiểu hình bị bệnh Các giếng phân tích mẫu vi ghép cho cường độ mầu thấp cường độ màu mẫu kiểm chứng âm tính chứng tỏ mẫu phân tích khơng chứa kháng ngun virus gây bệnh tristeza Kết quả phân tích chứng tỏ vi ghép không bị nhiễm bệnh tristeza Tất cả vi ghép có hình thái bình thường, khơng biểu bệnh tristeza Từ kết quả giám định bệnh greening kỹ thuật PCR bệnh tristeza kỹ thuật ELISA vi ghép đưa kết luận: cả 18/18 bệnh greening tristeza (chiếm tỷ lệ 100%) Như vậy, kỹ thuật vi ghép cải tiến cho phép tạo cam Bố Hạ bệnh gốc ghép bưởi Diễn sử dụng vật liệu ghép từ cam bị bệnh không bị bệnh Luan van 38 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết quả nghiên cứu trên, đưa số kết luận sau: Đã nghiên cứu ảnh hưởng loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép cải tiến Gốc ghép bưởi Diễn phù hợp cho vi ghép cải tiến cam Bố Hạ Tỷ lệ sống đạt 100% Đã nghiên cứu ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm hạt bưởi Diễn Kết quả cho thấy, hạt hạt chiếu sáng h/ngày cho chất lượng mầm tốt nhất, tỷ lệ nảy mầm 100% Đã nghiên cứu ảnh hưởng tuổi gốc ghép đến hiệu quả vi ghép cải tiến Gốc ghép bưởi Diễn tuần tuổi phù hợp để vi ghép cam Bố Hạ Tỷ lệ sống đạt 100% Đã nghiên cứu ảnh hưởng tuổi mầm ghép đến hiệu quả vi ghép cải tiến Sử dụng mầm ghép cam Bố Hạ từ 21 đến 24 ngày tuổi cho hiệu quả vi ghép cao Tỷ lệ sống ghép 100% Đã nghiên cứu ảnh hưởng ảnh hưởng kỹ thuật ghép đến hiệu quả vi ghép Kỹ thuật ghép chữ V phù hợp cho ghép cam Bố Hạ gốc bưởi Diễn, tỷ lệ sống ghép 100% Đã nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng hiệu quả vi ghép Sau vi ghép đặt bóng tối tuần đưa điều kiện chiếu sáng yếu, thời gian liền sẹo thời gian bật chồi nhanh nhất, tỷ lệ sống 100% Đã giám định bệnh greening tristeza vi ghép Kết quả giám định cho thấy 100% vi ghép bệnh greening tristeza Kỹ thuật vi ghép cải tiến cho phép tạo bệnh từ nguồn bị bệnh 5.2 Kiến nghị Tiếp tục theo dõi, giám định bệnh vi ghép giai đoạn sau từ đưa nhận định đầy đủ hiệu quả kỹ thuật vi ghép cải tiến đến khả tạo cam bệnh từ áp dụng kỹ thuật vào thực tiễn Luan van 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Hữu Cúc, Phạm Hoàng Anh (2005), “Dịch hại cam, quýt, chanh, bưởi (rutaceae) IPM”, NXB Nông Nghiệp Đường Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bưởi kỹ thuật trồng, NXB Lao động - Xã hội Nguyễn Hữu Đống (2003), ăn có múi (cam, chanh, quýt, bưởi), NXB Nghệ An Vũ Công Hậu (1996), Trồng ăn Việt Nam NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh Lê Đình Sơn (1993), “Phân tích để đạo bón phân cho cam”, Tạp chí Khoa học đất, (3), Nxb Nông nghiệp, trang 56 - 62 Hoàng Ngọc Thuận (2009), kỹ thuật chọn tạo trồng cam quýt, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 3-33 Tổng cục thống kê (2019), Niên giám thống kê năm 2019 NXB thống kê, 552-553 Phạm Thừa (1965), “Quy luật sinh trưởng, phát triển cành Thu, Hè, Đông, Xuân Cam Sành Bố Hạ”, Tạp chí KHKTNN, (2), trang 35 40 Trần Thế Tục (1990), “Một số nhận xét rễ Cam số loại đất vùng Phủ Quỳ- Nghệ Tĩnh”, Một số kết nghiên cứu khoa học trạm thí nghiệm nhiệt đới Tây Hiếu 1960- 1990, NXB Nơng nghiệp 10 Hồng Thị Thuỷ (2015), “Nghiên cứu đặc điểm sinh học số biện pháp kỹ thuật đối với nguồn thực liệu tạo quả không hạt có múi”, luận án tiến sĩ nơng nghiệp, trang 26 – 27 11 Đào Thanh Vân, Trần Như Ý, Nguyễn Thế Huấn (2000), Giáo trình ăn quả, Trường Đại học Nông Lâm, Đại hoc Thái Nguyên Tiếng Anh Luan van 40 12 Brlansky.R.H and Understanding Rogers.M.E the (2007), Vector-Pothogen “Citrus Huanglongbing: Interaction for Disease Mangament”, Citrus Research and Education Center, University of Florida-IFAS 13 FASTAT/FAO Statistics (2019), Agricultural data 14 Hung.T.H, Hung.S.C, Chen.S.N, Hsu.M.H and Su.H.J (2004), “Detection by PCR of Candidatus Liberibacter asiaticus, the bacterium causing citrus of huanglongbin in vector psyllids: application to the study of vector-pathogen relationships”, Plant pathology.53:96-102 15 Murashige, T., W.P Bitters, E.M Naver, C.N Roistacher, ADN P.B Holiday (1972), “A technique of shoot tip grafting and its utilization towards recovering virus-free citrus clones”, Hort Science, 7, 118-119 16 Navarro L., R.C.N., Murashigue T (1972), "Improvement of shoot tip grafting in vitro for virus-free citrus", J American Soc Hort Sci, 471-479 17 Raven, P H.; Evert R.F.; Eichhorn S E (2005) “Biology of Plants, 7th Edition”, Freeman and Company Publishers tr 504–508 18 Su H.J and J Y Chu (1984), “Modified technique of citrus shoot-tip grafting and rapid propagation method to obain citrus budwoods free of citrus viruses Proc Int Soc Citriculture, 1, 332-334 19 Swingle W T and Reece P C (1967), “The Botany of citrus and its wild relatives”, In Rether, W Batchelor, L.D.(eds) The citrus Industry, University of California Press, California, pp 109 - 174 Luan van Luan van ... trồng cam quýt phía bắc Vi? ??t Nam, vi? ??c tiến hành đề tài ? ?Ứng dụng kỹ thuật vi ghép cải tiến tạo Cam Bố Hạ bệnh? ?? mang tính thời cấp thiết 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Ứng dụng kỹ thuật. .. hiệu vi ghép Các kỹ thuật ghép định sống phát triển vi ghép chúng tiến hành nghiên cứu với kỹ thuật ghép để tìm kỹ thuật ghép tốt cho trình vi ghép cải tiến Dưới kết quả nghiên cứu kỹ thuật ghép. .. nghề trồng cam Vì vậy, sản xuất cần thiết phải tạo bệnh loại bệnh Trong nghiên cứu này, tạo 18 cam Bố Hạ kỹ thuật vi ghép cải tiến từ nguồn vật liệu ban đầu cam Bố Hạ bị bệnh không bị bệnh Tất