ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN KHẮC KHÁNH Tên đề tài Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xa[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN KHẮC KHÁNH Tên đề tài: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát nhanh đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) Trực trùng mủ xanh (Psedomonas aeruginosa) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành/ngành: Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2012-2016 Thái Nguyên - 2016 n i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN KHẮC KHÁNH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN NHANH VÀ ĐỒNG THỜI TỤ CẦU VÀNG (Staphylococcus aureus VÀ TRỰC TRÙNG MỦ XANH (Psedomonas aeruginosa) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành/Ngành: Cơng nghệ Sinh học Lớp : K44-CNSH Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2012-2016 Giảng viên hƣớng dẫn: BS NGUYỄN THỊ HUYỀN TS NGUYỄN VĂN DUY Thái Nguyên, năm 2016 n ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi hướng dẫn tận tình tơi q trình thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến BS Nguyễn Thị Huyền, Trưởng khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên, KTV Nguyễn Thị Thủy, CN Trần Trung Anh, Khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên hỗ trợ,giúp đỡ cung cấp chủng sinh vật để thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn cán phịng thí nghiệm thuộc khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn người bạn bên cạnh động viên giúp đỡ tơi học tập làm việc hồn thành khóa luận Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Khắc Khánh n iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.2 Các hóa chất sử dụng đề tài nghiên cứu 23 Bảng 3.3 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 4.1 Kết thử nghiệm phản ứng multilplex PCR mẫu thu thập Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên 40 n iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh hiển tế bào Staphylococcus aureus Hình 2.2 Hình ảnh khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa Hình 4.1 Kết điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số chủng S aureus (A) chủng P aeruginosa (B) 29 Hình 4.2 Kết điện di kiểm tra khả khuếch đại gen mục tiêu cặp mồi sử dụng nghiên cứu 31 Hình 4.3 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR điều kiện phản ứng khác 33 Hình 4.4 Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR sử dụng khuôn chủng S aureus P aeruginosa 35 Hình 4.5 Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR nồng độ DNA pha loãng khác 37 Hình 4.6 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng khuôn khác 38 n v MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài: 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Giới thiệu chung Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa4 2.1.1 Giới thiệu chung Staphylococcus aureus 2.1.2 Giới thiệu chung Pseumonase aeruginosa 2.2 Tình hình nghiên cứu Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa nước giới 12 2.2.1 Tình hình nghiên cứu Staphylococcus aureus 12 2.2.2 Tình hình nghiên cứu Pseudomonas aeruginosa 14 2.3 Các phương pháp phát Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa 17 2.3.1 Phương pháp phát Staphylococcus aureus 17 2.3.1.3 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) 18 2.3.2 Các phương pháp xác định Pseudomonas aeruginosa 19 2.4.Tổng quan kỹ thuật multiplex PCR 20 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 22 n vi 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 22 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 22 3.2.1.Địa điểm nghiên cứu 22 3.2.2.Thời gian nghiên cứu 22 3.3 Vật liệu nghiên cứu 22 3.3.1 Các cặp mồi sử dụng đề tài 22 3.3.2 Hóa chất sử dụng đề tài 23 3.3.3 Dụng cụ thiết bị sử dụng qua trình thực đề tài 24 3.4 Nội dung nghiên cứu 24 3.5 Phương pháp nghiên cứu 25 3.5.1 Phương pháp tách chiết DNA 25 3.5.2 Phản ứng multiplex PCR phát nhanh đồng thời Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa 26 3.5.3 Phương pháp xác định nồng độ tế bào 27 3.5.3 Phương pháp xác định ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR 27 3.5.4 Xác định độ đặc hiệu phản ứng multiplex PCR 28 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn nghiên cứu 29 4.2 Kết xây dựng quy trình phát nhanh đồng thời S aureus P aeruginosa kỹ thuật multiplex PCR 30 4.2.1 Kết thử nghiệm khả khuếch đại gen mục tiêu cặp mồi sử dụng nghiên cứu 30 4.2.2 Kết xác định điều kiện chung phản ứng PCR sử dụng cặp mồi riêng rẽ 32 n vii 4.2.3 Kết thử nghiệm khả khuếch đại phản ứng multiplex PCR 35 4.2.4 Kết xác định ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR 36 4.2.5 Kết xác định độ đặc hiệu phản ứng multiplex PCR 38 4.3 Kết thử nghiệm phát nhanh đồng thời S aureus P aeruginosa từ mẫu thu thập bệnh viện 39 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 n PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) thách thức mối tuân tâm hàng đầu Việt Nam toàn giới Những nghiên cứu gần cho thấy NKBV làm tăng tỷ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện, tăng việc sử dụng kháng sinh, tăng đề kháng kháng sinh tăng chi phí điều trị Thống kê cho thấy tỷ lNKBV khoảng 5-10% nước phát triển số nước phát triển tỷ lệ lên đến 25% [30] tỷ lệ cao khoa Hồi Sức Tích Cực NKBV làm gia tăng tỷ lệ tử vong bệnh viện Tại Cộng đồng Châu Âu, tỷ lệ tử vong nhiễm trùng bệnh viện 37.000 ca/năm [14] , Mỹ tỷ lệ lên tới 99.000 ca/năm Các bệnh nguyên gây NKBV có mức độ đề kháng kháng sinh cao với bệnh nguyên gây nhiễm khuẩn cộng đồng, đồng thời NKBV có thời gian nằm viện trung bình dài hơn, từ 7-14 ngày Do đó, chi phí cho NKBV thường tăng gấp 2-4 lần so với trường hợp khơng NKBV Chi phí phát sinh NKBV Anh quốc khoảng tỷ USD Mỹ 28-45 tỷ USD[11] Staphylococcsu aureus Pseudomonas aeruginosa hai tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện phổ biến Ngoài việc thực quy trình phát S aureus P aeruginosa chủ yếu phương pháp vi sinh Phương pháp thực phức tạp qua nhiều công đoạn nuôi cấy kiểm tra sản phẩm thu gặp khó khăn có khả nhầm lẫn loại vi sinh vật với Trong việc xác định nhanh xác loại vi sinh vật góp phần giảm nguyên nhân lây lan cộng đồng Với trình độ khoa học kỹ thuật ngày đại kéo theo người ngày am hiểu giải thích rõ ràng quan điểm kỹ thuật n sinh học phân tử Qua việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào lĩnh vực đời sống ngày rộng rãi, đặc biệt sinh học phân tử ứng dụng mạnh mẽ vào lĩnh vực y khoa mang lại chẩn đốn xác nhanh chóng xác định vi sinh vật gây bệnh Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng rộng rãi : kỹ thuật PCR, kỹ thuật multiplex PCR, ELISA kỹ thuật PCR với độ đặc hiệu cao thời gian cho kết nhanh chóng ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác Xuất phát từ tình hình thực tiễn dựa điều kiện sở vật chất khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên tiến hành thực đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát nhanh đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) Trực trùng mủ xanh (Psedomonas aeruginosa).” 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài Xây dựng quy trình phát nhanh đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) kỹ thuật multiplex PCR 1.2.2 Yêu cầu đề tài: - Tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn S aureus P aeruginnosa - Tối ưu phản ứng multiplex PCR phát nhanh đồng thời S aureus P aeruginosa - Thử nghiệm thành công phản ứng multiplex PCR mẫu vi khuẩn phân lập Bệnh viện n