(Luận văn) nghiên cứu ứng dụng kĩ thuât nuôi cấy tế bào trên hệ thống microcarrier trong sản xuất vacxin tai xanh

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ VÂN ANH lu NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY an n va TẾ BÀO TRÊN HỆ THỐNG MICROCARRIER to p ie gh tn TRONG SẢN XUẤT VACXIN TAI XANH Thú y an lu 8640101 va Mã số: d oa nl w Ngành: PGS.TS.Bùi Trần Anh Đào ll u nf Người hướng dẫn khoa học: oi m TS Bùi Thị Tố Nga z at nh z m co l gm @ an Lu NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng Năm 2019 Tác giả luận văn lu an n va Trần Thị Vân Anh p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Cho đến tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Nhân dịp tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành, sâu sắc tới thầy, cô giáo Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc chân thành đến thầy hướng dẫn: PSG.TS Bùi Trần Anh Đào TS Bùi Thị Tố Nga môn Bệnh lý - Khoa Thú y - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, người tận tình hướng dẫn suốt thời gian nghiên cứu hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn anh chị em bạn bè đồng nghiệp công ty TNHH Dược Hanvet tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hoàn thành luận văn lu an Cuối xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh, chị em n va người ln động viên, giúp đỡ tơi để tơi hồn thành tốt luận văn to Xin chân thành cảm ơn! gh tn Hà Nội, ngày tháng Năm 2019 p ie Tác giả luận văn nl w d oa Trần Thị Vân Anh ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trich yêu luân văn ix Thesis abstract x lu Phần Mở đầu an n va 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu tn to Phần Tổng quan tài liệu Tổng quan nuôi cấy tế bào ie gh 2.1 p 2.1.1 2.1.2 Một số đặc điểm tế bào động vật Thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy tế bào w Các loại môi trường nuôi cấy tế bào 2.1.4 Điều kiện nuôi cấy tế bào 2.1.5 Sự tạp nhiễm cách hạn chế 2.1.6 Sự sinh trưởng tế bào động vật nuôi cấy 2.2 Virus tai xanh 2.2.1 Hình thái cấu trúc virus PRRS 2.2.2 Đặc tính ni cấy virus Tai Xanh 2.3 Nuôi cấy virus tai xanh môi trường tế bào 11 2.3.1 Các dịng tế bào ni cấy thích hợp virus Tai Xanh 11 2.3.2 Nuôi cấy virus Tai Xanh môi trường tế bào Marc-145 11 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng nuôi cấy tế bào virus tai xanh 12 2.4.1 Nhiệt độ 12 2.4.2 Huyết 13 2.4.3 Bề mặt nuôi cấy 13 2.4.4 Yếu tố khơng khí môi trường xung quanh 13 d oa nl 2.1.3 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th iii si 2.5 Các hệ thống nuôi cấy tế bào 13 2.5.1 Hệ thống nuôi cấy tế bào 13 2.5.2 Hệ thống Microcarrier 15 2.5.3 Máy điều khiển 16 2.5.4 Bình ni cấy 16 2.5.5 Hạt Cytodex 16 2.5.6 Các loại hạt Cytodex 17 Phần Vật liệu- phƣơng pháp nghiên cứu 19 lu 3.1 Nội dung nghiên cứu 19 3.1.1 Nghiên cứu quy trình ni cấy tế bào Marc-145 hệ thống Microcarrier 19 3.1.2 Nghiên cứu tính thích ứng virus Tai Xanh nuôi cấy tế bào Marc-145 an hệ thống Microcarrier 19 n va Nghiên cứu quy trình thu hoạch xử lí dịch virus sau thu hoạch 19 3.2 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 19 tn to 3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 19 3.2.1 gh Vật liệu nghiên cứu 20 3.3 Địa điểm nghiên cứu 20 p ie 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 20 nl w 3.4 Phương pháp nghiên cứu 20 3.5.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào 20 3.5.2 Phương pháp gây nhiễm 26 2.5.3 Phương pháp thu hoạch 27 2.5.4 Phương pháp kiểm tra độ khiết (TCVN8684:2011) 27 2.5.5 Phương pháp xác định số TCID50 28 2.5.6 Phương pháp xử lý số liệu 29 d oa 3.5 ll u nf va an lu oi m z at nh Phần Kết thảo luận 30 Nghiên cứu quy trình ni cấy tế bào marc-145 hệ thống microcarrier 30 4.1.1 Xác định tốc độ khuấy thích hợp để ni tế bào Marc-145 hệ thống z 4.1 gm @ Microcarrier 30 l 4.1.2 Xác định giá trị DO thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 hệ thống m co Microcarrier 32 Xác định lưu lượng khí cấp vào thích hợp để ni cấy tế bào Marc-145 hệ an Lu 4.1.3 thống Microcarrier 34 n va ac th iv si Xác định môi trường ni cấy thích hợp cho tế bào Marc-145 hệ thống 4.1.4 Microcarrier 35 4.1.5 Xác định lượng tế bào Marc-145 cấy vào hạt Cytodex hệ thống Microcarrier 37 4.2 Nghiên cứu tính thích ứng virus tai xanh nuôi cấy tế bào marc-145 hệ thống microcarrier 39 4.2.1 Xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào, xử lí dịch hấp phụ virus 39 4.2.2 Xác định mơi trường trì sau gây nhiễm virus 42 4.2.3 Xác định liều gây nhiễm, thời gian thu hoạch virus thích hợp 44 4.3 Nghiên cứu quy trình thu hoạch-thu dồn dịch virus tai xanh 48 Phần Kết luận kiến nghị 51 lu an 5.1 Kết luận 51 5.2 Kiến nghị 51 va Tài liệu tham khảo 52 n p ie gh tn to Phụ lục 55 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th v si DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT lu an n va Nghĩa tiếng Việt CPE Cyto Pathogenic Effect DMEM Dulbecco’s Modified MEM Medium DO Dissolved Oxygen EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid FBS Fetal Bovine Serum LH Lactalbumin Hydrolysate M199 Medium 199 MEM Minimum essential medium MOI Multiplicity of infection PBS Phosphate Buffered Saline gh tn to Chữ viết tắt Hydrogen power p ie pH Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus TCID50 oa nl w PRRS 50% Tisue culture infective dose d Trypsin – EDTA ll u nf va an lu TE oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vi si DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Protein cấu trúc PRRSV Bảng 4.1 Kết theo dõi điều chỉnh tốc độ khuấy 30 Bảng 4.2 Mức độ bám tế bào Marc-145 vào hạt Cytodex giá trị DO khác 32 Bảng 4.3 Tỉ suất sinh sản tế bào Marc-145 sau 72 nuôi 33 Bảng 4.4 Kết điều chỉnh lưu lượng khí cấp vào môi trường nuôi 35 Bảng 4.5 Khả bám phát triển tế bào Marc-145 loại môi trường 36 Bảng 4.6 Số lượng tế bào Marc-145 nuôi sau 72 96 nuôi 37 lu Bảng 4.7 Khả gây bệnh tích tế bào thời gian hấp phụ virus 41 an va Bảng 4.8 Kết hiệu giá xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào 42 n Bảng 4.9 Khả gây bệnh tích tế bào mơi trường 43 tn to Bảng 4.10 Hiệu giá virus tìm mơi trường sau gây nhiễm 44 ie gh Bảng 4.11 Kết theo dõi mức độ thể CPE liều gây nhiễm 44 p Bảng 4.12 Kết xác định hiệu giá virus liều gây nhiễm (MOI) 46 Bảng 4.13 Kết xác định hiệu giá virus thu dồn kháng nguyên Tai Xanh w oa nl (log10TCID50/ml) 48 d Bảng 4.14: Kết kiểm tra vô trùng nguyên dịch Tai Xanh 49 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vii si DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình thái virus PRRS Hình 2.2 Cấu trúc gen PRRSV Hình 2.3 Hình thái tế bào Marc-145 sau 72 nuôi hệ thống Tflask 12 Hình 2.4 Bệnh tích tế bào sau 54-72 nhiễm virus Tai Xanh 12 Hình 2.5 Chai ni tế bào Tfask 14 Hình 2.6 Hệ thống ni chai lăn 15 Hình 2.7 Hệ thống ni cấy Microcarrier 15 Hình 2.8 Tế bào Marc-145 bám hạt Cytodex 18 Hình 3.1 Mơ hình nhân số lượng tế bào cho nuôi cấy hệ thống Microcarrier 21 lu an Hình 3.2 Buồng đếm tế bào 22 n va Hình 3.3 Cân chỉnh điện cực pH 25 tn to Hình 3.4 Cân chỉnh điện cứu DO 26 Hình 4.1 (1) Bình ni có bọt, (2) bình ni cấy khơng có bọt 31 gh ie Hình 4.2 Lấy mẫu theo dõi suất nhân tế bào Marc-145 33 p Hình 4.3 Hệ thống khí vào hệ thống Microcarrier 34 nl w Hình 4.4 Tỉ suất sinh sản tế bào Marc-145 môi trường nuôi 36 oa Hình 4.5 Tỉ xuất nhân tế bào Marc-145 đầu vào tế bào khác 38 d Hình 4.6 Mức độ bám tế bào Marc-145 hạt Cytodex 39 lu va an Hình 4.7 Bệnh tích tế bào 24 giờ, 48 giờ, 72 96 sau gây nhiễm virus Tai xanh 45 u nf Hình 4.8 Đồ thị sinh trưởng phát triển virus Tai Xanh 47 ll oi m Hình 4.9 Hạt Cytodex sau trình thu hoạch virus Tai Xanh 49 z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th viii si TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Trần Thị Vân Anh Tên luâ ̣n văn: “Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy tế bào hệ thống Microcarrier sản xuất vacxin Tai Xanh” Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên sở đào ta ̣o: Học Viê ̣n Nông Nghiê ̣p Viê ̣t Nam Mục tiêu nghiên cứu lu - Xây dựng quy trình ni tế bào Marc-145 quy trình sản xuất nguyên dịch Tai Xanh hệ thống Microcarrier theo quy mô công nghiệp, - Tiền đề để áp dụng quy trình sản xuất nguyên dịch khác sản xuất vacxin động vật tế bào an n va Phƣơng pháp nghiên cứu Lấy mẫu đếm số tế bào theo TCVN 4884-2:2015 Phương pháp kiểm tra độ khiết theo TCVN 8684:2011 Phương pháp xác định số TCID50 theo phương pháp Spearman Karber p ie gh tn to Phương pháp nuôi cấy tế bào Marc-145 phân lập virus Tai Xanh theo TCVN 8400-21:2014 w oa nl Số liệu thu thập xử lý phần mềm Excel 2010 Minitap 16 d Kết chính và kết luận u nf va an lu 1.Xây dựng quy trình ni cấy tế bào Marc-145 hệ thống Microcarrier Tốc độ khuấy 60 vòng/phút, tế bào bám hạt sau 24h, phát triển 90-100% sau 72-96h, môi trường nuôi không tạo bọt; giá trị DO=50% tế bào phát triển tốt nhất; Lưu lượng ll khí 0,25-0,5 lít/phút sau 50 phút ổn định giá trị DO pH môi trường; môi trường MEM 5% FBS tế bào đầu vào 300x106/30gram hạt Cytodex ni 10 lít mơi trường tốt 2.Xây dựng quy trình sản xuất virus Tai Xanh hệ thống Microcarrier sử dụng liều gây nhiễm 0,01MOI; môi trường nhiễm MEM 1% FBS ; hấp phụ virut 60 phút, dịch hấp phụ không hút bỏ, thu hoạch virus sau 72 cho hiệu giá virut 107,2107,5TCID50/ml 3.Quá trình thu hoạch virus đơng tan lần cho hiệu giá virus cao oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th ix si Kết lơ thí nghiệm hệ thống Microcarrier cho kết tương tự với thí nghiệm trước chai Tflask thực (7,1-7,3 log10TCID50/ml), nên kết có độ tin tưởng cao Qua phân tích kết trên, lựa chọn hấp phụ virus Tai Xanh vào tế bào Marc-145 60 phút, không hút bỏ dịch hấp phụ cho thí nghiệm 4.2.2 Xác định mơi trƣờng trì sau gây nhiễm virus Mơi trường trì tế bào sau nhiễm môi trường nuôi tế bào có khơng có huyết động vật Mơi trường trì có tác dụng trì sinh trưởng ổn định tế bào tạo điều kiện tối ưu cho trình xâm nhập nhân lên virus lu Để tìm loại mơi trường trì tế bào trình gây nhiễm virus đạt hiệu giá virus cao thu hoạch Tiến hành thử nghiệm công thức môi trường: MEM, DMEM, M119 LH Tuy nhiên, trì sinh trưởng tế bào bị an va n ảnh hưởng hàm lượng huyết pH môi trường Tất công thức mơi tn to trường thí nghiệm chúng tơi bổ sung 1%FBS, pH=7,3±0,1 gh Thí nghiệm thực lần với điều kiện nuôi tế bào, phương p ie pháp gây nhiễm, thông số tối ưu giống w Kết theo dõi khả gây bệnh tích tế bào thể bảng 4.9 oa nl Bảng 4.9 Khả gây bệnh tích tế bào môi trƣờng d Môi trƣờng nuôi cấy lu an Thời gian theo dõi M199 DMEM va màu đỏ hồng CPE (%) CPE 0%, tế bào bám hạt Cytodex 100% Đỏ cam Đỏ Đỏ cam Đỏ 5-10 5-10 đỏ cam đỏ cam 30-40 10-20 vàng cam Cam @ 20-30 10-20 cam đỏ cam 50-60 50-60 an Lu hồng m co đỏ cam l gm 72h CPE 0%, tế bào bám hạt Cytodex 100% z 54h CPE (% Bong) môi trƣờng CPE (% Bong) môi trƣờng CPE (% Bong) z at nh môi trƣờng 48h màu đỏ hồng oi CPE (%) m môi trƣờng ll 30h LH môi trƣờng u nf 24h MEM 60-70 30-40 n va ac th 42 si Qua bảng 4.9 theo dõi mức độ biểu CPE cho thấy sau 24-30 gây nhiễm virus tất môi trường nhiễm chưa gây bệnh tích tế bào Bệnh tích tế bào xuất sớm sau 48 gây nhiễm môi trường MEM M199 khoảng 5-10% Sau 54 gây nhiễm virus, số lượng tế bào bong khỏi hạt Cytodex thể rõ, loại mơi trường nhiễm có độ bong khác nhau, bong nhiều môi trường MEM (bong 40%) Sau 72 sau nhiễm, thay đổi màu sắc môi trường độ bong rõ rệt  Màu sắc môi trường từ đỏ đến vàng : DMEM > LH > M199 > MEM  Độ bong: MEM > M199 > DMEM > LH Sau 72 gây nhiễm virus, tiến hành thu kháng nguyên đông tan lần lu để giải phóng virus, lấy mẫu chuẩn độ xác định hiệu giá Kết xác định an hiệu giá virus thể bảng 4.10: n va Bảng 4.10 Hiệu giá virus tìm mơi trƣờng sau gây nhiễm Lô thí nghiệm Lô 01 Lô 02 Lô 03 DMEM 6,70 ±0,09 7,10 ±0,16 6,83 ±0,07 M199 7,23 ±0,05 7,63 ±0,09 7,43 ±0,09 LH 6,23 ±0,16 6,77 ±0,05 6,70 ±0,08 MEM 7,57 ±0,09 7,63 ±0,09 7,43 ±0,09 p ie gh tn to Hiệu giá virus (log10TCID50/ml) w Môi trƣờng d oa nl gây nhiễm an lu u nf va Kết xác định hiệu giá virus cho thấy điều kiện nuôi cấy tế bào môi trường nuôi nhiễm MEM kết xác định hiệu giá virus cao 7,54 ll log10TCID50/ml, môi trường nhiễm M199 cho kết xác định hiệu giá virus 7,43 log10TCID50/ml, môi trường nhiễm DMEM cho kết xác định hiệu giá virus 6,90 log10TCID50/ml môi trường nhiễm LH kết xác địn hiệu virus oi m z at nh giá thấp 6,54 log10TCID50/ml z Kết xác định hiệu giá virus phù hợp với mức độ bong tế bào @ gm hạt Cytodex quan sát kính hiển vi q trình theo dõi thí nghiệm l Mơi trường MEM mơi trường trì tế bào q trình gây m co nhiễm cho kết xác định hiệu giá virus cao chai Tflask 225cm2 theo nghiên cứu trước đây, đồng thời môi trường sử dụng sản xuất nguyên dịch Tai Xanh Hiệu giá virus trung bình hệ thống Tflask an Lu n va ac th 43 si khoảng 106,7-107,1TCID50/ml Phân tích liệu MINITAB/ANOVA/One-way (phụ lục 1) Kết P ≤0,0001 chứng tỏ môi trường nuôi khác có ảnh hưởng đến kết xác định hiệu giá virus Môi trường MEM M199 nhóm A chứng tỏ sử dụng môi trường để nuôi nhiễm virus Tai Xanh Theo kết nghiên cứu hệ thống Microcarrier, thấy môi trường nuôi tế bào Marc-145 MEM 5%FBS + Kháng sinh môi trường nhiễm virus Tai Xanh MEM 1%FBS + kháng sinh cho kết xác định hiệu giá virus Tai Xanh cao hệ thống chai phẳng Tflask từ 0,2-0,5log10 lu Từ kết thu trình nghiên cứu trên, lựa chọn an môi trường MEM 1%FBS môi trường nuôi nhiễm virus Tai Xanh vào tế bào va Marc-145 cho sản xuất kháng nguyên Tai Xanh n tn to 4.2.3 Xác định liều gây nhiễm, thời gian thu hoạch virus thích hợp p ie gh Để xác định liều gây nhiễm thích hợp cho kết xác định hiệu giá virus cao nhất, tiến hành gây nhiễm virus Tai Xanh hệ thống Microcarrier chứa lớp tế bào Marc-145 với liều gây nhiễm (MOI- Multiplicity of infection) 0,2MOI; 0,1MOI; 0,01MOI; 0,001MOI Mỗi liều MOI thí nghiệm/1 bình nl w d oa Microcarrier, tiến hành theo dõi mức độ biểu bệnh tích tế bào, lấy mẫu xác định hiệu giá virus Tai Xanh sau 48 giờ, 54 giờ, 72 96 gây nhiễm Thí nghiệm lặp lại lần cố định cách thực thông số: an lu u nf va  Thời gian ủ virus Tai xanh vào tế bào Marc-145: 60 phút 37˚C, 5% CO2  Môi trường nuôi nhiễm MEM 1%FBS + kháng sinh ll oi m  Cài đặt thống số hệ thống: Tốc độ khuấy: 60vòng/phút, lưu lượng khí: 0,5lít/phút, giá trị DO=50% z at nh Bảng 4.11 Kết theo dõi mức độ thể CPE liều gây nhiễm 10 30-40 60-70 100 0 10 30-40 50-60 an Lu 10 30-40 70-80 100 0,001 m co 30-40 50-60 70-80 100 0,01 l 0,1 gm 0,2 @ Bệnh tích Tế bào (%) 24 48 54 72 96 Liều gây nhiễm virus (MOI) z Thời gian gây nhiễm virus n va ac th 44 si Hàng ngày quan sát tế bào để đánh giá mức độ bệnh tích tế bào (CPE) liều gây nhiễm thời gian gây nhiễm khác Mức độ biểu CPE đánh giá bảng 4.11 Qua bảng theo dõi mức độ biểu CPE ta thấy sau 24 gây nhiễm virus Tai Xanh tất liều virus nhiễm chưa biểu bệnh tích tế bào bệnh tích tế bào thể nhanh mạnh dần với tăng liều nhiễm virus Bệnh tích tế bào thể rõ mạnh liều 0,1MOI 0,01MOI Sau 48 gây nhiễm virus bắt đầu xuất bệnh tích tế bào sau 96 tế bào bong hoàn toàn khỏi hạt Cytodex thảm tế bào lu an n va p ie gh tn to d oa nl w 24h 48h ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ 72h 96h virus Tai xanh an Lu Hình 4.7 Bệnh tích tế bào 24 giờ, 48 giờ, 72 96 sau gây nhiễm n va ac th 45 si Mỗi thời điểm theo dõi, tiến hành lấy mẫu soi bệnh tích tế bào xác định hiệu giá virus để so sánh liều gây nhiễm, thời gian thu hoạch virus Kết trình bày bảng 4.12 Bảng 4.12 Kết xác định hiệu giá virus liều gây nhiễm (MOI) Liều gây nhiễm virus (MOI) Thời gian gây nhiễm virus lu 0,1 0,01 0,001 48 7,26±0,08 7,14±0,08 6,61±0,14 4,72±0,11 Hiệu giá virus 54 6,57±0,05 6,54±0,08 7,19±0,11 5,83±0,16 (log10TCID50/ml) 72 5,72±0,18 6,1±0,06 7,54±0,08 6,32±0,22 96 5,06±0,23 4,94±0,23 6,82±0,13 7,14±0,08 an 0,2 n va to tn Qua bảng kết xác định hiệu giá virus bảng 4.12 Hiệu giá virus Tai Xanh  Ở liều gây nhiễm 0,2MOI 0,1MOI sau 48 gây nhiễm cho kết p ie gh có khác biệt liều nhiễm virus khác thời gian nuôi nhiễm d oa nl w xác định hiệu giá virus đạt cao nhất, trung bình 7,26 log10TCID50/ml sau 54 gây nhiễm virus cho kết xác định hiệu giá bắt đầu giảm, theo dõi đến 96 sau nhiễm cho kết xác định hiệu giá virus 5,06 log10TCID50/ml an lu giảm 2,2 log10TCID50/ml tức 158 lần u nf va Ở liều gây nhiễm 0,01MOI hiệu giá virus tăng dần theo thời gian gây nhiễm, kết xác định hiệu giá đạt cao sau 72 gây nhiễm (7,54 ll log10TCID50/ml), sau 96 nuôi nhiễm kết xác định hiệu giá virus bắt đầu giảm dần Kết giống với kết nghiên cứu công bố oi m z at nh (Nguyễn Thị Lan cs., 2016) z  Ở liều gây nhiễm 0,001MOI, mức độ thể bệnh tích tế bào thấp so với liều gây nhiễm khác nên kết xác định hiệu giá virus thấp cao gm @ sau 96 gây nhiễm (6,14 log10TCID50/ml) l Sau xác định liều gây nhiễm virus Tai Xanh thích hợp, chúng m co tơi tiến hành nghiên cứu thời gian thu hoạch virus để có kết xác định hiệu giá virus cao Liều 0,01MOI theo quy trình thơng số hệ thống nghiên cứu, virus theo dõi thu hoạch thời điểm 24 giờ; 36 giờ; 48 an Lu n va ac th 46 si giờ; 60 giờ; 72 giờ; 84 giờ; 96 giờ; 108 120 sau gây nhiễm Xác định hiệu giá virus thời điểm thu hoạch kết thu hình 4.8 lu an n va gh tn to p ie Hình 4.8 Đồ thị sinh trƣởng phát triển virus Tai Xanh d oa nl w Qua hình 4.8 cho thấy chu kỳ sinh trưởng phát triển virus Tai Xanh tương đối ổn định Sau gây nhiễm 24 virus bắt đầu trình sinh trường phát triển, hàm lượng virus thu tăng dần theo thời gian nhiễm đạt kết xác u nf va an lu định hiệu giá cao (7,2- 7,5 log10TCID50) khoảng thời gian 72-84 sau gây nhiễm Sau 96 giờ, kết xác định hiệu giá virus bắt đầu giảm Điều giải thích sau: Khi virus xâm nhập vào tế bào sau 24 virus bắt đầu ll trình sinh trưởng lúc virus bắt đầu gây ảnh hưởng bất lợi cho tế bào Sự phát triển virus mạnh tế bào bị ảnh hưởng nghiêm trọng dẫn đến phá hủy tế bào Khi kết xác định hiệu giá virus đạt cao thời điểm 72-84 sau gây nhiễm lúc tế bào bị phá hủy hoàn toàn Khi tế bào bị phá hủy hồn tồn virus khơng cịn kí chủ kí sinh, hay nói cách khác tế bào khơng cịn mơi trường thuận lợi để phát triển phải tồn dạng tự Ở dạng này, virus có sức đề kháng thấp, tác động nhiệt độ nên nhanh chóng bị hoạt tính làm giảm hiệu giá virus (Nguyễn Thanh Ba oi m z at nh z m co l gm @ Nguyễn Thị Ngọc, 2014; Butler, 2004) an Lu Từ kết bảng 4.12 hình 4.8 lựa chọn liều gây nhiễm 0,01MOI, thu hoạch virus sau 72 gây nhiễm n va ac th 47 si 4.3 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THU HOẠCH-THU DỒN DỊCH VIRUS TAI XANH Sau tối ưu quy trình ni nhiễm virus Tai Xanh, chúng tơi tiến hành nghiên cứu quy trình thu hoạch virus Tai Xanh cho thu kháng nguyên có hiệu giá virus cao Virus bị ảnh hưởng nhiều nhiệt độ, q trình đơng tan kháng ngun Đơng tan kháng ngun q nhiều lần, virus thích ứng với nhiệt độ kém, hiệu giá virus giảm Còn khơng đơng tan kháng ngun, virus gây bệnh tích bên tế bào, virus khơng giải phóng gây giảm hiệu giá virus, lu kết chuẩn độ khơng xác Chúng tơi tiến hành thí nghiệm không đông tan, đông tan lần đông tan lần với kháng nguyên sau 72 nhiễm Các thông số nuôi tế bào an n va  Sau nhiễm 72-96 giờ, tế bào bong khỏi hạt Cytodex 90-100%: Thu tươi  Dịch virus đem cất -40˚C tới đông mang đông tan lần : đông tan lần  Sau đông tan lần cất -40˚C tới đông mang đông tan lần : đông tan lần p ie gh tn to Marc-145 gây nhiễm virus Tai Xanh thực theo nghiên cứu trên, cố định thông số cài đặt máy tối ưu, thí nghiệm thực lần - Tiến hành lấy mẫu thời điểm: nl w Kết xác định hiệu giá virus trình bày bảng 4.13 d oa Bảng 4.13 Kết xác định hiệu giá virus thu dồn kháng nguyên Tai Xanh an lu (log10TCID50/ml) Hiệu giá virus (log10TCID50/ml) va Lơ thí nghiệm Đơng tan lần Đơng tan lần Lô 6,63 ±0,09 7,57 ±0,05 7,37 ±0,21 Lô 6,43 ±0,15 7,43 ±0,14 7,57 ±0,18 Lô 6,43 ±0,20 Trung bình 6,50 ±0,09 ll u nf Thu tƣơi oi m z at nh 7,63 ±0,09 7,52 ±0,07 7,52 ±0,11 z 7,57 ±0,18 @ tan nên virus chưa giải phóng khỏi tế bào m co l gm Quá trình thu tươi nguyên dich hiệu cho kết giá xác định hiệu giá virus Tai Xanh thấp khoảng 6,43-6,63 log 10TCID50/ml, chứng tỏ virus Tai Xanh xâm nhập vào tế bào Marc-145 gây bệnh tích tế bào, khơng có q trình đơng an Lu Q trình đơng tan lần đông tan lần cho kết xác định hiệu giá n va ac th 48 si virus giao động khoảng 7,37-7,63 log10TCID50 /ml tăng 1,0-1,2log10 so với thu dịch tươi Kết xác định hiệu giá trung bình đơng tan lần đơng tan lần cho kết hiệu giá virus giống 7,52 log10TCID50/ml Tuy nhiên, q trình đơng tan nhiều lần dẫn đến nứt chai, thao tác nhiều gây tạp trùng, tăng thời gian sản xuất Quá trình thu dồn dịch, chúng tơi tiến hành lấy mẫu kiểm tra độ thuẩn khiết kết thu thể bảng 4.14: Bảng 4.14 Kết kiểm tra vô trùng ngun dịch Tai Xanh Lơ thí nghiệm Thioglyconate Trypticase đậu tƣơng Thạch máu Saboraud agar lu an Ống Ống Ống Ống Ống Ống Ống Ống - - - - - - - - n va Lô Lô tn to Lô Kết luận Đạt Đạt Đạt p ie gh Kết cho thấy rằng, 3/3 lơ thí nghiệm đạt vơ trùng Phân tích liệu MINITAB/ANOVA/One-way (phụ lục 2) Kết P ≤0.001 chứng tỏ trình thu tươi, đông tan ảnh hưởng đến hiệu giá virus Đông tan lần đông tan lần nhóm A, chứng tỏ q trình thu oa nl w d dồn virus đông tan lần ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu (1) (2) Hình 4.9 Hạt Cytodex sau trình thu hoạch virus Tai Xanh (1) Hạt sau thu tươi kháng nguyên, (2) Hạt sau đông tan kháng nguyên n va ac th 49 si Sau trình thu dồn virus Tai Xanh, tế bào Marc-145 bán hạt Cytodex khoảng 5-10% thể hình 4.8 Từ kết hiệu giá virus bảng 4.13 lựa chọn đông tan lần để thu hoạch virus Tai Xanh hệ thống Microcarrier Sau thực nghiên cứu, tối ưu lựa chọn thông số kĩ thuật, đưa quy trình sản xuất kháng nguyên Tai Xanh hệ thống Microcarrier Sơ đồ sản xuất kháng nguyên Tai Xanh Tế bào lu Tế bào Marc-145 Lượng tế bào: 30x106TB/3gram Cytodex/1 lít mơi trường Mơi trường ni: MEM 5% HT+KS pH:7,1±0,2 - Tốc độ khuấy: 60 vịng/phút Lưu lượng khí : 0,25 – 0,5 lít/ phút DO =50% T0C = 370C±0,5 - Môi trường nhiễm: MEM 1% HT+KS PH= 7,3±0,2 MOI: 0,01 hấp phụ virut: 60 phút Thời gian nuôi nhiễm 72 an - n va p ie gh tn to Hệ thống Microcarrier 10L d oa nl w ll u nf va an lu Nhiễm Virut Tai Xanh - Thu vắc xin bán thành phẩm: sau khoảng 72 gây nhiễm, kiểm tra hủy hoại virut lên tế bào đạt ≥ 95% tiến hành thu vắc xin bán thành phẩm Đông tan virut lần, thu dồn kháng nguyên, bảo quản 40˚C z at nh - oi m Thu hoạch virut z m co l gm @ an Lu n va ac th 50 si PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Xây dựng quy trình ni cấy tế bào Marc-145 hệ thống Microcarrier Tốc độ khuấy 60 vòng/phút, tế bào bám hạt sau 24h, phát triển 90100% sau 72-96h, môi trường nuôi không tạo bọt; giá trị DO=50% tế bào phát triển tốt nhất; Lưu lượng khí 0,25-0,5 lít/phút sau 50 phút ổn định giá trị DO pH môi trường; môi trường MEM bổ sung 5% huyết tế bào đầu vào 300x106tb/30gram hạt Cytodex ni 10 lít mơi trường tốt lu Xây dựng quy trình sản xuất virus Tai Xanh hệ thống Microcarrier sử dụng MOI: 0,01; môi trường nhiễm MEM 1% huyết ; an n va hấp phụ virut 60 phút, dịch hấp phụ không hút bỏ, thu hoạch virus sau 72 cho hiệu giá virut 107,2-107,5TCID50/ml tn to Quá trình thu hoạch virus đông tan lần cho hiệu giá virus cao - Sử dụng kết nghiên cứu để sử dụng cho sản xuất vacxin Tai p ie gh 5.2 KIẾN NGHỊ w Xanh bán thành phẩm d oa nl - Vacxin Tai Xanh bán thành phẩm đem đông khô thử nghiệm, kiểm tra hiệu giá virus vacxin thành phẩm, tính an tồn, tính miễn dịch hiệu lực an lu vacxin để đánh giá chất lượng vacxin va - Sử dụng kết nghiên cứu làm tiền đề để nghiên cứu sản xuất nhiều loại ll u nf vacxin khác hệ thống Microcarrier oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 51 si TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài Liệu Tiếng Việt: Phan Kim Ngọc Và Phạm Văn Phúc (2009) "Công nghệ sinh học người động vật", NXB Giáo dục,Tp.HCM Nguyễn Thị Lan Và Cs (2016) " so sánh số đặc tính sinh học chủng virus PRRS phân lập Việt Nam (KTY-PRRS-04) qua đời cấy truyền" Vũ Văn Vụ Và Nguyễn Mộng Hùng (2006) "Công nghệ sinh học tế bào ".NXB ĐH Huế lu Nguyễn Hồng Lộc (2006) " Cơng nghệ tế bào" NXB ĐH Huế Nguyễn Như Hiền (2007) " Sinh học phân tử tế bào, sở khoa học công an nghệ sinh học" va Bùi Quang Anh (2008) " Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS) " n tn to Nhà xuất Nông nghiệp tr 7-21 Nguyễn Thị Lan (2016) " Đặc tính sinh học chủng virus PRRS (KTY-PRRS05) Phân lập Việt Nam qua đời cấy truyền " Tạp chí Khoa học Nơng p ie gh Nguyễn Thị Minh Hường (2015) " Nghiên cứu, so sánh khả gây bệnh tích tế nl w nghiệp Việt Nam.(4).tr 605 d oa bào số đặc điểm sinh học phân tử virus PSSR qua đời cấy chuyển II Tài Liệu Tiếng Anh: va an lu môi trường tế bào Marc-145" tr 36-38 Butler (2004) Animal cell culture and technology, Taylor & Francis Christianson, Collins, Benfield and Harris (1992) "Experimental reproduction of ll u nf m oi swine infertility and respiratory syndrome in pregnant sows." American journal of z at nh veterinary research 53(4) pp.485-488 Christian Kaisermayer, Ann-Christin Magnusson and J Tscho (2013) "Scale-Up z l gm Bioreactor™ Systems." BioProcess Int 11(7) @ of Adherent Vero Cells Grown on Cytodex™ Microcarriers Using WAVE Ce Rexroad Jr and Am Powell (1988) "Co-culture of ovine ova with oviductal m co cells in medium 199." Journal of animal science 66(4).pp 947-953 Colin Ratledge and Bjorn Kristiansen (2006) Basic biotechnology, Cambridge an Lu University Press n va ac th 52 si D He, C Overend, J Ambrogio, Rj Maganti, Mj Grubman and Ae Garmendia (2011) "Marked differences between MARC-145 cells and swine alveolar macrophages in IFNβ-induced activation of antiviral state against PRRSV." Veterinary immunology and immunopathology 139(1).pp 57-60 Dea S., C Gagnon, H Mardassi, Pirzadeh and And Rogan (2000) "Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates." Archives of virology 145(4).pp.659-688 Enda Moran (1999) "A microcarrier-based cell culture process for the production of a bovine respiratory syncytial virus vaccine." Cytotechnology 29(2).pp 135 lu Ge Healthcare and Amersham Biosciences (2005) "Microcarrier cell culture: an principles and methods." General Electric Company n va 10 Kd Rossow (1998) "Porcine reproductive and respiratory syndrome." Veterinary Kim Jeong-Ki, Al-Majhdi Fahad, Kumar Shanmukhappa and Sanjay Kapil (2006) "Defining the cellular target (s) of porcine reproductive and respiratory syndrome p ie 11 gh tn to pathology 35(1).pp.1-20 virus blocking monoclonal antibody 7G10." Journal of virology 80(2).pp 689-696 Kj Yoon, J Christopher-Hennings and Ea Nelson (2003) "Diagnosis of PRRS nl w 12 Kjell Nilsson (1988) "Microcarrier cell culture." Biotechnology and genetic d 13 oa virus." PRRS Compendium Producer Edition 55: 67 lu J Y Liu, J Hafner, G Dragieva and G Burg (2004) "Bioreactor microcarrier cell u nf va 14 an engineering reviews 6(1).pp.404-439 culture system (Bio-MCCS) for large-scale production of autologous melanocytes." ll 15 oi m Cell Transplant 13(7-8).pp.809-816 Janneke Jm Meulenberg (2000) "PRRSV, the virus." Veterinary research 16 z at nh 31(1).pp 11-21 Jovan Bojkovski, Ivan Doborasvljević, Nikola Delić, Božidar Savić, Dragan z gm @ Rogožarski and Tihomir Petrujkić (2012) "Porcine reproductive respiratory syndrome (PRRS)." Savremena poljoprivreda 61(1-2).pp.61-67 l 17 Oekyung Kim, Yan Sun, Frances W Lai, Cheng Song and Dongwan Yoo (2010) m co "Modulation of type I interferon induction by porcine reproductive and respiratory an Lu syndrome virus and degradation of CREB-binding protein by non-structural protein in MARC-145 and HeLa cells." Virology 402(2).pp.315-326 n va ac th 53 si 18 R Ian Freshney (2015) Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications, John Wiley & Sons 19 Ryan (2005) Growing more cells: A simple guide to small volume cell culture scale-up 20 William T Christianson and Hansoo Joo (1994) "Porcine reproductive and respiratory syndrome: A review." Swine health and production: the official journal of the American Association of Swine Practitioners (USA) lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 54 si PHỤ LỤC Phụ lục Phân tích liệu tìm mơi trường gây nhiễm virus Tai Xanh ANOVA/One-way : DMEM, MEM, M199, LH Source DF SS MS F P lu an Factor 5.0400 1.6800 45.47 0.000 n va Error 32 1.1822 0.0369 tn to Total 35 6.2222 S = 0.1922 R-Sq = 81.00% R-Sq(adj) = 79.22% gh p ie Grouping Information Using Tukey Method w Mean Grouping oa nl N MEM 7.5444 A DMEM 6.9000 B C ll u nf 6.5667 va LH an lu d M199 7.3000 A oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 55 si Phụ lục Phân tích liệu đơng tan thu dồn virus Tai Xanh ANOVA/One-way: Thu tƣơi, Đông tan lần, Đông tan lần Source DF SS MS F P Factor 2.81079 1.40539 164.69 0.0001 Error 0.07680 0.00853 Total 11 2.88759 lu an S = 0.09238 R-Sq = 97.34% R-Sq(adj) = 96.75% n va gh tn to Grouping Information Using Tukey Method Mean Grouping p ie N Đông tan lần 7.5233 A 6.4967 B d oa Thu tươi nl w Đông tan lần 7.5233 A ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 56 si