(Luận văn) nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật pcr phát hiện bệnh greening trên cây có múi

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LỘC TUẤN HOẠT lu an n va Tên đề tài: tn to NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR p ie gh PHÁT HIỆN BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI oa nl w d KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC nf va an lu lm ul : Chính quy z at nh oi Hệ đào tạo Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa z : 2011 – 2015 m co l gm @ Khoá học : CNSH - CNTP an Lu n va THÁI NGUYÊN - 2015 ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LỘC TUẤN HOẠT lu an n va Tên đề tài: tn to NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR p ie gh PHÁT HIỆN BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI w d oa nl KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC nf va an lu z at nh oi lm ul Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K43 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 – 2015 Giảng viên : ThS Bùi Đình Lãm Khoa CNSH-CNTP –Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên z m co l gm @ an Lu THÁI NGUYÊN - 2015 n va ac th si i LỜI CẢM ƠN Được đồng ý khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nơng Lâm Thái Ngun Em thực tập phịng thí nghiệm Khoa CNSH – CNTP Trường Đại học Nơng Lâm Thái Nguyên với đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát bệnh greening có múi” để hồn thành khóa luận ngồi nỗ lực thân em nhận nhiều giúp đỡ Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, thầy giáo tận tình giảng dạy cho em suốt năm học lu Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới Ban giám hiệu an n va trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, hồn thành khóa luận ie gh tn to thầy giáo tận tình giảng dạy cho em suốt năm học vừa qua để em Đặc biệt, em xin bày tỏ lịng kính trọng, lịng biết ơn sâu sắc tới ThS p Bùi Đình Lãm người tận tình hướng dẫn em suốt trình thực đề tài nl w Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến KS Lã Văn Hiền dành d oa nhiều thời gian quý báu trực tiếp hướng dẫn em thực nghiên cứu đề tài an lu Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè quan nf va tâm, ủng hộ động viên em suốt trình học tập nghiên cứu giúp em hoàn thành tốt khóa luận lm ul Do điều kiện thời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi thiếu sót em hồn thiện z at nh oi Kính mong thầy giáo bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài Em xin chân thành cảm ơn ! z gm @ Thái Nguyên, ngày 30 tháng năm 2015 Sinh Viên co l m Lộc Tuấn Hoạt an Lu n va ac th si ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Các lồi cam, qt có ý nghĩa thực tiễn sản xuất Bảng 2.2: Tình hình sản xuất cam, quýt châu lục giới giai đoạn 2007 2009 13 Bảng 2.3: Diện tích, suất sản lượng cam, quýt giới giai đoạn 2002 – 2009 14 Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam, quýt nước ta giai đoạn 2002 – 2009 15 Bảng 2.5: Tình hình sản xuất cam, quýt vùng nước ta năm 2009 15 lu Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi để phát tác nhân gây bệnh greening (Hung cs, an n va 1999b), (Hung cs, 2004) [28], [29] .27 Bảng 3.3: Bảng thu thập mẫu địa phương .29 gh tn to Bảng 3.2: Các trang thiết bị máy móc dùng thí nghiệm .28 ie Bảng 3.4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 32 p Bảng 4.1: Kết đánh giá mẫu cam sành huyện Quang Bình, tỉnh Hà Giang .34 nl w Bảng 4.2: Kết đánh giá mẫu chanh, quýt cam thu Hà Nội, Lạng Sơn, Thái d oa Nguyên .35 an lu Bảng 4.3: Kết so sánh biểu bệnh qua triệu chứng bện ngồi giải phẫu nf va mơ tế bào thực vật 38 Bảng 4.4: Kết giám định bệnh vàng greening cam, quýt chanh .43 z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Rầy chổng cánh Diaphorina citri 17 Hình 2.2 Triệu trứng nhiễm bệnh vàng greening có múi .18 Hình 4.1 Mẫu có múi thu thập để giám định bệnh vàng greening 33 Hình 4.2 Hình ảnh giải phẫu mô tế bào mẫu cam sành .36 Hình 4.3 Hình ảnh giải phẫu mơ tế bào quýt .37 Hình 4.4 Hình ảnh giải phẫu mơ tế bào có biểu nghi nhiễm 37 lu Hình 4.5 Kết tách chiết DNA tổng số .40 an n va Hình 4.6 Điện di sản phẩm PCR mẫu giám định bệnh greening 41 p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT lu an n va : Bảo vệ Thực vật Cs : Cộng CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA : Deoxyribonucleic Acid ĐC : Đối chứng dNTP : Nước khử ion không chứa Dnase RNase EDTA : Ethylene diamine tetraacetate FAO : Food and Agriculture Organization NN&PTNT : Nông nghiệp Phát triển Nông thôn PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Acid p ie gh tn to BVTV d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si v MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề 1.3 Yêu cầu nghiên cứu 1.4 Mục tiêu nghiên cứu 1.5 Ý nghĩa đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 lu Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU an n va 2.1 Tổng quan có múi .4 2.1.2 Giá trị có múi .5 gh tn to 2.1.1 Nguồn gốc phân loại ie 2.1.3 Đặc điểm thực vật học có múi .7 p 2.1.4 Yêu cầu sinh thái có múi nl w 2.1.5 Một số sâu bệnh hại có múi .10 d oa 2.1.6 Tình hình sản xuất có múi 12 an lu 2.2 Bệnh vàng Greening có múi .16 nf va 2.2.1 Lịch sử bệnh .16 2.2.2 Nguyên nhân triệu chứng bệnh 16 lm ul 2.2.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh vàng greening 19 z at nh oi 2.3 Cơ sở khoa học việc ứng dụng kỹ thuật PCR phát bệnh vàng greening .21 2.3.1 Nguyên lý ứng dụng kỹ thuật PCR 21 z gm @ 2.3.2 Các thành phần phản ứng PCR 22 2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ đặc hiệu phản ứng PCR 22 l co 2.3.4 Các bước thực phản ứng PCR 22 m 2.4 Tình hình nghiên cứu phát bệnh greening có múi 23 an Lu 2.4.1 Các nghiên cứu phát bệnh giới 23 n va ac th si vi 2.4.2 Các nghiên cứu phát bệnh Việt Nam 25 Phần 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1 Vật liệu nghiên cứu 27 3.1.1 Vật liệu thực vật 27 3.1.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 27 3.2 Phạm vi, địa điểm thời gian nghiên cứu 28 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 28 3.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 28 3.3 Nội dung nghiên cứu 29 lu 3.4 Phương pháp nghiên cứu 29 an n va 3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu vật liệu 29 3.4.4 Phương pháp sử lý số liệu .32 gh tn to 3.4.2 Phương pháp xác định biểu bệnh greening 30 p ie Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Kết thu thập mẫu vật liệu 33 nl w 4.2 Kết xác định mức độ biểu bệnh .34 d oa 4.2.1 Kết xác định biểu bệnh thông qua triệu chứng bên an lu 34 nf va 4.2.2 Kết xác định biểu bệnh thông qua quan sát hình thái mơ tế bào thực vật 36 lm ul 4.3 Kết giám định bệnh vàng greening kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc z at nh oi hiệu 39 4.3.1 Tách chiết DNA tổng số mẫu 39 4.3.2 Kết nhân đoạn gen 16s rDNA 40 z gm @ Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 l an Lu PHỤ LỤC m TÀI LIỆU THAM KHẢO co 5.2 Kiến nghị 45 n va ac th si Phần MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Cây có múi (cam, chanh,quýt, bưởi ), thuộc họ Rutaceae, loại ăn trồng phổ biến giới Việt Nam Cây có múi loại trồng mang lại giá trị dinh dưỡng, giá trị kinh tế cao Trong 100g thịt tươi có chứa - 12% đường, vitamin C từ 40 - 90 mg, acid hữu từ 0,4 - 1,2%, chất khoáng dầu thơm (Đường Hồng Dật, 2003) [3] Sản phẩm có múi sử dụng với nhiều mục đích khác làm thực phẩm sử dụng hàng ngày, làm mứt, nước lu giải khát Tinh dầu cất từ vỏ quả, lá, hoa dùng nhiều công nghệ an n va thực phẩm mỹ phẩm Vỏ dùng làm thuốc, hương liệu (Đường Hồng lớn cho người làm vườn Theo ước tính, suất trung bình cam, gh tn to Dật, 2003) [3] Ngoài ra, việc trồng ăn có múi cịn mang lại nguồn thu nhập ie quýt đạt từ 15 – 20 tấn/ha, sản phẩm có múi cam, quýt p bán thị trường với giá dao động khoảng 15.000 – 20.000 đồng/kg mang lại nl w nguồn thu nhập từ 300 – 400 triệu đồng/ha/năm (Đương Hồng Dật, 2003) [3] Vì d oa sản xuất ăn có múi trọng, đầu tư phát triển mạnh mẽ an lu Trên giới, ăn có múi trồng chủ yếu nhiều nước thuộc nf va vùng nhiệt đới, nhiệt đới ơn đới Ở Việt Nam có múi trồng ba miền Bắc, Trung Nam Năm 2011, diện tích ăn có múi Việt Nam đạt lm ul 124,057 ha, diện tích trồng cam quýt chiếm tới 70,300 ha, bưởi 45,000 z at nh oi chanh 18,000 (Bộ NN&PTNT) [1] Song đa dạng khí hậu vùng trồng trọt điều kiện thích hợp cho nhiều lồi sâu bệnh phát sinh gây hại có múi, nguyên nhân ảnh hưởng trực tiếp đến suất chất lượng (Lê z gm @ Mai Nhất, 2014) [8] Một số bệnh điển hình có múi như: Bệnh Tristeza, bệnh vàng thối rễ, ghẻ nhám Trong bệnh vàng gân xanh (bệnh greening) gây hại l co hầu hết ăn có múi Bệnh dịng vi khuẩn Gram âm gây m Dịng châu có tên Candidatus liberibacter asiaticus, dịng châu phi có tên an Lu Candidatus liberibacter africanus Các dòng vi khuẩn sống mạch libe n va ac th si lây truyền từ sang khác thông qua mắt ghép môi giới truyền bệnh rầy chổng cánh (Diaphorina citri) châu Á rầy cam (Trioza erytreae) châu Phi (Hung.T.H cs, 2004) [29] Đặc điểm bệnh greening có thời gian ủ bệnh dài, nên khó phát bệnh giai đoạn đầu thường hay nhầm lần với bệnh khác bị thiếu kẽm (Zn) (Lê Mai Nhất, 2014) [8] Đến bệnh biểu rõ ràng bị bệnh nặng biện pháp chữa trị gần vô nghĩa, nhiều biện pháp thực không mang lại hiệu Vì vậy, việc phát nhanh bệnh vàng greening giai đoạn đầu vô quan trọng việc phòng điều trị bệnh lu Ngày việc ứng dụng kỹ thuật Sinh học phân tử đại cho phép chẩn an n va đoán bệnh có múi mang lại hiệu cao với nhiều ưu điểm như: độ PCR, real-time PCR, kỹ thuật lai phân tử (Quyền Đình Thi, 2008) [11] Kết gh tn to nhạy cao, xác thời gian Có thể kể đến số phương pháp như: ie thu từ nghiên cứu chẩn đoán sinh học phân tử sở để sớm p đưa giải pháp phòng tránh Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu đó, nl w tiến hành thực đề tài : ‘‘Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát bệnh d oa greening có múi ’’ an lu 1.2 Mục đích nghiên cứu nf va Chẩn đốn bệnh vàng greening có múi kỹ thuật PCR 1.3 Yêu cầu nghiên cứu lm ul - Thu thập nguồn vật liệu số đối tượng có múi như: Cam, chanh, z at nh oi bưởi, quýt - Xác định biểu bệnh greening mẫu vật liệuthu thập - Giám định bệnh vàng greening có múi phản ứng PCR với l gm @ 1.4 Mục tiêu nghiên cứu z cặp mồi đặc hiệu m Cam, chanh, quýt, bưởi địa phương khác co - Thu thập mẫu vật liệu số đối tượng có múi như: an Lu - Giải phẫu mơ học mẫu có múi nghi nhiễm bệnh mẫu lành bệnh n va ac th si 38 Bảng 4.3: Kết so sánh biểu bệnh qua triệu chứng bện giải phẫu mô tế bào thực vật Giống Cam Sành lu Cam Sành an n va p ie gh tn to d oa nl w Qt Ngọt Khơng có biểu Xuất đám tế bào màu đen Tế bào biến dạng hình thái Tế bào biến dạng hình thái Xuất đám tế bào màu đen Khơng có biểu Tế bào biến dạng màu sắc Tế bào biến dạng màu sắc Tế bào biến dạng Tế bào biến dạng Xuất đám tế bào màu đen Khơng có biểu Tế bào biến dạng Tế bào biến dạng Xuất đám tế bào màu đen Tế bào biến dạng Tế bào chồng chéo lên Xuất đám tế bào màu đen Không có biểu Tế bào biến dạng hình thái Tế bào biến dạng hình thái Xuất đám tế bào màu đen Khơng có biểu Tế bào biến dạng màu sắc Tế bào biến dạng, có lỗ trống Tế bào biến dạng, có lỗ trống Tế bào biến dạng màu sắc Tế bào biến dạng màu sắc Tế bào biến dạng hình thái Tế bào biến dạng, có lỗ trống Khơng có biểu Tế bào biến dạng, có lỗ trống Xuất đám tế bào màu đen Tế bào biến dạng, có lỗ trống Tế bào biến dạng hình thái (*) + + + + + + + + + + + + + + + + + + (*) + + + + + + + + + + + z at nh oi lm ul z m co l gm @ Cam Vinh Khơng có biểu Lá vàng, gân xanh Lá vàng, gân xanh Lá vàng lốm đốm Lá vàng, gân xanh Lá vàng cục Lá vàng cục Lá vàng lốm đốm Lá vàng, gân xanh Lá vàng, gân xanh Lá vàng lốm đốm Lá vàng cục Lá vàng lốm đốm Lá vàng lốm đốm Lá vàng cục Lá vàng, gân xanh Lá vàng, gân xanh Lá vàng lốm đốm Lá vàng gân xanh Lá vàng gân xanh Lá vàng gân xanh Lá vàng gân xanh Khơng có biểu Lá nhỏ, vàng lốm đốm Lá nhỏ, vàng lốm đốm Lá nhỏ, phiến hẹp Lá nhỏ, phiến hẹp Lá nhỏ, vàng lốm đốm Lá nhỏ, vàng cục Lá nhỏ, phiến vàng, hẹp Lá vàng, gân xanh Lá nhỏ, vàng lốm đốm Lá nhỏ, vàng lốm đốm Lá nhỏ, vàng lốm đốm Lá nhỏ, vàng lốm đốm nf va Chanh giấy Biểu mô tế bào lu Chanh Thanh Yên Kết Triệu chứng an Mẫu số 1ĐC 10 11 12 10 11ĐC 5 Chú thích: (+), Có triệu chứng, biểu mơ tế bào;(-), có triệu chứng, khơng an Lu biểu mô tế bào; (*), Đối chứng n va ac th si 39 Các thí nghiệm cho thấy biểu mô tế bào bao gồm biểu như: Tế bào biến dạng hình thái, màu sắc, xuất đám tế bào màu đen, lỗ trống hay tế bào nằm chồng chéo lên nhau, phần lớn biến dạng tế bào Khi tiến hành giải phẫu 33 mẫu vật liệu có biểu triệu chứng bệnh bên ngồi có 29 mẫu cho thấy biểu bệnh mô tế bào (+), mẫu biểu bệnh mơ tế bào (-), điều cho thấy biểu bệnh bên biểu bệnh mô tế bào đồng nhất, điển hình mẫu Cam sành (mẫu 6, 12), quýt (mẫu 6), cam vinh (mẫu 3) có biểu triệu chứng bên ngồi không cho thấy biểu mô tế lu bào Mặt khác mẫu có triệu chứng bệnh bên giống cho kết an giải phẫu khơng giống ngược lại, nhìn bảng ta thấy mẫu Cam va n sành số có biểu bên ngồi vàng, gân xanh kết giải tn to phẫu xuất đám tế bào màu đen mẫu số tế bào biến dạng hình gh thái mẫu số 3, mẫu số cho kết giải phẫu giống với mẫu số có triệu p ie chứng bên ngồi vàng lốm đốm, biểu mẫu lại có w khác tương tự Từ kết lần cho thấy việc đánh giá biểu nl bệnh thông qua triệu chứng bên ngồi giải phẫu mơ tế bào thực vật d oa khơng có đồng độ tin cậy cao công tác giám định bệnh vàng an lu greening, cần tiến hành biện pháp để giám định bệnh vàng greening nf va cho kết xác Kết giải phẫu nghiên cứu chưa xác định vị trí cụ thể vi lm ul khuẩn, giám định xác bệnh, sở để tiến hành giám định z at nh oi bệnh vàng greening khẳng định rõ chẩn đoán sinh học phân tử 4.3 Kết giám định bệnh vàng greening kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu z @ 4.3.1 Tách chiết DNA tổng số mẫu l gm Các mẫu vật liệu thu thập địa phương chuyển tới phịng thí nghiệm để tiến hành tách chiết DNA tổng số phục vụ cho công việc giám định co m Phương pháp tách chiết DNA tổng số tiến hành dựa phương pháp an Lu CTAB Saghai maroof, 1984 (Jame.C, 2008) [32] Có vài cải tiến để n va ac th si 40 phù hợp với điều kiện nghiên cứu cụ thể Kết tách chiết DNA tổng số trình bày hình 4.3 lu an n va to tn Hình 4.5 Kết tách chiết DNA tổng số ie gh A, Cam Sành (Hà Giang); B, Chanh Thanh Yên (Viện Bảo vệ Thực vật – p Hà Nội); C, Quýt Ngọt (huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn); D, Chanh Giấy Cam w Vinh ( xã Quyết Thắng, TP Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) A, C D: Các oa nl đường chạy gel tương ứng với số mẫu thu Hà Giang, Lạng Sơn Thái d Nguyên; B: Đường chạy 1,2 tương ứng với mẫu số Đường chạy 3,4; 5,6; 7,8; lu nf va an 9,10 tương ứng với số mẫu 2,3,4,5 thu Viện Bảo vệ Thực vật – Hà Nội DNA tổng số tất mẫu tách chiết nhìn chung loại lm ul hoàn toàn RNA Nồng độ DNA tổng số thu được kiểm tra đo quang z at nh oi phổ bước sóng 260 280 nm Kết rằng, DNA tổng số đạt chất lượng nồng độ cao để thực cho thí nghiệm 4.3.2 Kết nhân đoạn gen 16s rDNA z Phản ứng PCR giám định bệnh greening tiến hành với mồi đặc hiệu @ m co l kích thước sản phẩm PCR 226 bp gm Cặp mồi sử dụng thiết kế dựa nghiên cứu Hung cs (2004) [29] với an Lu n va ac th si 41 lu an n va p ie gh tn to Hình 4.6 Điện di sản phẩm PCR mẫu giám định bệnh greening A Cam sành (huyện Quang Bình, tỉnh Hà Giang) 2/12 mẫu dương tính; B nl w Quýt (huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn) 8/11 mẫu dương tính; C Chanh d oa Thanh Yên (Viện Bảo Vệ Thực Vật, Hà Nội) 5/5 mẫu dương tính; D Chanh Giấy an lu cam vinh (xã Quyết Thắng, TP Thái Nguyên) 1/2 mẫu chanh giấy 5/5 mẫu nf va cam vinh dương tính Trong tất trường hợp A, B, C, D giếng (1) : Mẫu đối chứng âm tính (2): Mẫu đối chứng dương tính M : Thang chuẩn DNA 100 bp lm ul Hình 4.6.A, 4.6.B, 4.6.C 4.6.D Bảng 4.4 cho thấy việc giám định bệnh z at nh oi thực cam Sành, quýt Ngọt, chanh Giấy chanh Thanh Yên địa phương lấy mẫu xuất kết kết dương tính với bệnh greening Cụ thể, z hình 4.6.A với 12 mẫu cam Sành giám định có hai mẫu đường chạy xuất gm @ băng có vị trí trùng với băng đường chạy số (đối chứng dương – mẫu DNA nhiễm bệnh từ Viện Bảo vệ Thực vật – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt l co Nam) với kích thước khoảng 226 bp, điều chứng tỏ hai mẫu đường đường chạy m số có biểu dương tính với bệnh greening Tương tự với hình 4.6.B, 4.6.C an Lu 4.6.D thu số mẫu có biểu dương tính cao 8/11 mẫu, 5/5 n va ac th si 42 mẫu 6/7 mẫu Đối với hình 4.6.C có 5/5 (100%) mẫu chanh Thanh n hình 4.6.D có 5/5 (100%) mẫu cam Vinh (đường chạy số đến 9) xuất băng có kích thước 226 bp, bên cạnh mẫu chanh Giấy ½ mẫu bị nhiễm bệnh greening (đường chạy 4) Như tổng số 33 mẫu cho có biểu nghi nhiễm bệnh thơng qua việc xác định biểu bệnh triệu chứng bên ngồi 29 mẫu giải phẫu mơ tế bào thực vật (có biểu mơ tế bào) có 21 mẫu dương tính cịn lại 14 mẫu khơng nhiễm bệnh (âm tính) Điều chứng tỏ phương pháp xác định bệnh mắt thường giải phẫu mơ tế bào thực vật có mức độ sai lu số cao Kỹ thuật PCR ứng dụng để giám định bệnh vàng greening đáp ứng an n va yêu cầu sản xuất thời điểm tương lai gần Đây kỹ thuật cửa bệnh greening giống sản phẩm tươi nhập vào Việt gh tn to cho phép trả lời nhanh kết sản xuất công tác kiểm dịch hàng hóa ie Nam Với kỹ thuật này, từ nhận mẫu phịng nghiệm công đoạn p cuối 4-5 Đây kỹ thuật ngày sử dụng rộng rãi nl w chẩn đoán bệnh vàng greening để kiểm định giống trước xuất vườn d oa xác định lây lan bệnh vườn môi giới truyền bệnh nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 43 Bảng 4.4: Kết giám định bệnh vàng greening cam, quýt chanh lu an Giống Xã Vĩ Thượng, Quang Bình, Hà Giang Cam Sành Xã Yên Hà, Quang Bình, Hà Giang Cam Sành n va Địa điểm ie gh tn to p Xã Đồng Ý, Bắc Sơn, Lạng Sơn d oa nl w Quýt Ngọt Đƣờng chạy 10 11 12 13 14 10 11 12 13 7 nf va an lu m co l gm Cam Vinh @ Chanh giấy z at nh oi Xã Quyết Thắng – TP Thái Nguyên Chanh Thanh Yên lm ul Viện Bảo Vệ Thực Vật, Hà Nội Kết Tỷ lệ Triệu chứng nhiễm Khơng có biểu Lá vàng, gân xanh Lá vàng, gân xanh + Lá vàng lốm đốm + Lá vàng, gân xanh Lá vàng cục 2/12 mẫu, (16,6%) Lá vàng cục Lá vàng lốm đốm Lá vàng, gân xanh Lá vàng, gân xanh Lá vàng lốm đốm Lá vàng cục + Lá vàng lốm đốm + Lá vàng lốm đốm Lá vàng cục Lá vàng, gân xanh + Lá vàng, gân xanh 8/11 mẫu, + Lá vàng lốm đốm (72,7%) + Lá vàng gân xanh + Lá vàng gân xanh + Lá vàng gân xanh + Lá vàng gân xanh Khơng có biểu + Lá nhỏ, vàng lốm đốm + Lá nhỏ, vàng lốm đốm 5/5 mẫu, + Lá nhỏ, phiến hẹp (100%) + Lá nhỏ, phiến hẹp + Lá nhỏ, vàng lốm đốm Lá nhỏ, vàng cục ½ mẫu, + Lá nhỏ, phiến vàng, hẹp (50%) + Lá vàng, gân xanh + Lá nhỏ, vàng lốm đốm 5/5 + Lá nhỏ, vàng lốm đốm mẫu(100%) + Lá nhỏ, vàng lốm đốm + Lá nhỏ, vàng lốm đốm z an Lu Mẫu số 10 11 12 10 11 5 Chú thích:(+), Cây nhiễm bệnh greening; (-), Cây không nhiễm bệnh greening n va ac th si 44 Các kết nghiên cứu đạt có tương đồng với kết công bố Hung cs (2004) [29] tác giả sử dụng mồi đặc hiệu nhân đoạn 16s rDNA với khích thước 226 bp để giám định bệnh vàng greening cam Đài Loan Ở hình 4.6.A, 4.6.B, 4.6.C 4.6.D xuất băng sản phẩm PCR có kích thước 226 bp dự kiến Điều chứng tỏ mẫu thu thập cam Sành, quýt Ngọt, chanh Thanh Yên, chanh Giấy cam Vinh nghi vấn bị nhiễm bệnh vàng greening Tuy chưa có đánh giá mức độ gây hại bệnh vàng greening có múi giám định, kết thu tiền đề để giám định bệnh greening trình sản xuất giống bệnh lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 45 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu thu được, đề tài đưa kết luận sau: Thu thập mẫu vật liệu đối tượng có múi cam, chanh, quýt địa điểm: Hà Giang, Hà Nội, Lạng Sơn, Thái Nguyên gồm: 13 mẫu cam Sành, 11 mẫu quýt Ngọt, mẫu chanh Thanh Yên, mẫu chanh lu an Giấy, mẫu cam Vinh n va Đánh giá biểu bệnh greening đối tượng thông tn to qua triệu chứng bên Kết tổng số 36 mẫu vật liệu thu có Đã tiến hành giải phẫu mô thực vật mẫu vật liệu thu thập Kết p ie gh 33/36 mẫu có biểu bệnh greening, 3/36 mẫu khơng có biểu bệnh w cho thấy xuất đám sợi có sai khác với mẫu mơ khỏe mạnh oa nl Kết giám định bệnh vàng greening kỹ thuật PCR thu d số kết sau: Trong 12 mẫu cam sành Hà Giang giám định, kết PCR cho lu nf va an thấy có 2/12 mẫu có biểu dương tính với bệnh greening (xuất băng có kích thước 226 bp) Tương tự, mẫu quýt Ngọt Bắc Sơn, chanh Thanh Yên Hà lm ul Nội, chanh giấy cam Vinh Thái Nguyên có số mẫu dương tính với bệnh z at nh oi greening 8/11 mẫu quýt Bắc Sơn, 5/5 mẫu chanh Thanh Yên, ½ mẫu chanh Giấy 5/5 mẫu cam Vinh z 5.2 Kiến nghị @ co l số kiến nghị sau: gm Từ kết giám định bệnh greening có múi nghiên cứu đưa m Tiếp tục thu thập mẫu vật liệu đối tượng có múi địa an Lu phương khác n va ac th si 46 Tiếp tục phân tích PCR kỹ thuật sinh học phân tử khác để giám định bệnh vàng greening Tiến hành tinh sản phẩm PCR, đọc trình tự so sánh trình tự nucleotit thu mẫu nhiễm bệnh để định danh sác lồi vi khuẩn gây bệnh vàng greening có múi Việt Nam Tiến hành hướng nghiên cứu để phòng trừ bệnh vàng greening phục vụ cho trình sản xuất giống bệnh lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng việt Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn (2014), Tổng diện tích ăn phân theo địa phương, Số liệu trồng trọt, http://www.mard.gov.vn Phạm Thị Chữ (1996) “Tuyển chọn, nhân giống bưởi Phúc Trạch suất cao, phẩm chất tốt phục vụ xuất nội tiêu”, Tạp chí Khoa học cơng nghệ quản lý kinh tế, tháng 6/1996, trang 228-229 Đường Hồng Dật (2003) Cam, chanh, quýt, bưởi kỹ thuật trồng, Nxb Lao động - xã hội lu Đỗ Đình Đức (1991), “Một số kết nghiên cứu tượng vân vàng cam an n va quýt miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Bảo vệ Thực vật, số 6, Tr 10-13 TP Hồ Chí Minh gh tn to Vũ Công Hậu (1996), Trồng ăn Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội p ie Trần Công Khánh (1981), Thực hành hình thái giải phẫu thực vật, Nxb Đại nl w Đinh Hải Lâm (2001) “Nghiên cứu tạo vật liệu bệnh bảo quản nguồn d oa gene có múi in vitro số giống cam quýt địa phương nhập nội”, nf va Nam an lu Luận văn Thạc sỹ Nông nghiệp Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Lê Mai Nhất (2014), “Nghiên cứu bệnh vàng greening hại ăn có múi lm ul số tỉnh phía bắc Việt Nam đề xuất biện pháp phòng chống”, Luận án z at nh oi Tiến sỹ Nông nghiệp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Nguyễn Thị Minh Phương (2007) Cây ăn đặc sản kỹ thuật trồng, Nxb nông nghiệp Hà Nội z gm @ 10 Trần Thế Tục, Cao Anh Long, Hồng Ngọc Thuận, Hồng Thế Lư (1998), Giáo trình ăn quả, Nxb Nông nghiệp Hà Nội l co 11 Quyền Đình Thi, Nơng Văn Hai (2008) Cơng nghệ Sinh học tập 2: Những ký m thuật PCR ứng dụng phân tích DNA, Nxb Khoa học tự nhiên an Lu Công nghệ n va ac th si 12 Hà Minh Trung CS (2006), “ Hồn thiện cơng ghệ sản xuất có múi đặc sản (cam, quýt, bưởi) bệnh greening bệnh virus khác tỉnh phía bắc‟‟, Kỷ yếu hội nghị tổng kết khoa học công nghệ nông nghiệp 2001-2005, tr.190, Nxb Nông nghiệp 13 Hà Minh Trung, Ngô vĩnh viễn, Đỗ Thành Lâm (1995), “ Kết giám định kế hoạch phòng chống bệnh vàng cam qt Đồng sơng Cửu Long ” Tạp chí Nông nghiệp CNTP số 3, 1995, tr.95-97 14 Hà Minh Trung, Ngơ Vĩnh Viễn, Vũ Đình Phú, Mai Thị Liên, Lê Mai Nhất, Nguyễn Bích Ngọc (2003), Bệnh greening ngun nhân gây suy thối vườn lu có múi giải pháp khắc phục, Kỷ yếu hội thảo khoa học quốc gia an n va Bảo vệ Thực vật, Nxb Nơng nghiệp, tr.1-12 dụng dầu khống phịng trừ tổng hợp sâu bệnh hại ăn có múi ie gh tn to 15 Trung tâm làm vườn trồng trọt, Viện Bảo vệ Thực vật (2003), Hướng dẫn sử Việt Nam, Nxb Nông nghiệp Hà Nội p 16 Đào Thanh Vân, Trần Như Ý, Nguyễn Thế Huấn (2000) Giáo trình ăn quả, nl w Đại học Nông lâm Thái Nguyên d oa 17 Đỗ Năng Vịnh (2008), Cây ăn có múi-Cơng nghệ sinh học chọn tạo giống nf va II Tiếng anh an lu Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 18 Aubert.B, Garnier.M, Cassin.J.C, Bertin.Y (1988), Citrus greening disease lm ul survey in East and West African countries South of Sahara, Proceeding of z at nh oi 10th conference of IOCV, IOCV, Riverside 1988, 231 – 237 19 Aubert, B (ed) (1987), Regional Workshop on citrus greening Huanglongbin disease, Review and Abstract FAO-UNDP, China.Dec.6-12/1987 z gm @ 20 Bové.J.M, P Bonnet, M.Garnier and B Aubert (1980), Pennicilin and tetraciline treatment of greening disease affected citrus plants in the l co glasshouse and the bacterial nature of the procaryote associated with m greening In proc th conf IOCV, IOCV, Riverside.tr.91-102 an Lu n va ac th si 21 Bové.J.M, Garnier.M, Ahlawat.Y.S, Chakraborty.N.K, Varma.A (1993), Detection of the Asian strains of the greening BLO by DNA-DNA hybridisation in Indian orchard trees and Malaysian Diaphorina citri psyllids, Proceedings of 12th Conference IOCV, IOCV, Riverside 1993, 258-263 22 Bové.J.M, Garnier.M (1984), Citrus greening and psylla vectors of the disease in the Arabian peninsula In Proc.9th Conf IOCV, IOCV, Riverside Tr 109-114 23 Bové.J.M Nguyen Minh Chau, Ha Minh Trung, Bourdeaut.J and Garier.M (1996), “Huanglongbing (greening) in Viet Nam Detection of Liberobacter lu an asiaticum by DNA-Hybridization with probe in 2.6 and PCR Ampification of n va 16S Ribosomal DNA”, Thirteenth IOCV Conference, 1996-Procaryotes and 24 Brlansky.R.H and Rogers.M.E (2007), “ Citrus Huanglongbing: Understanding the Vector-Pothogen Interaction for Disease Mangament”, Citrus Research p ie gh tn to blight, 258-266 and Education Center, University of Florida-IFAS nl w 25 FAOSTAT (2015), Agricultural data, available from: http://faostat3.fao.org d oa 26 Garnier.M, Daniel.N and Bové.J.M (1984), An etiology of citrus greening an lu diseases Ananals of Microbiology, tr.169-179 nf va 27 Hung.T.H, H.L Wu and H.J.Su (1999a), “Detection of fastidious bacteria causing citrus greening disease by nonradioactive DNA probes”, Ann lm ul Phytopathol Soc.Jpn.65:14-146 z at nh oi 28 Hung.T.H, Wu.H.L and Su.H.J (1999b), “Development of a rapid method for the diagnosis of citrus greening disease usingthe polymerase chain reaction”, Journal of Phytopathology.147: 599-604 z gm @ 29 Hung.T.H, Hung.S.C, Chen.S.N, Hsu.M.H and Su.H.J (2004), “Detection by PCR of Candidatus Liberibacter asiaticus, the bacterium causing citrus of l m relationships”, Plant pathology.53:96-102 co huanglongbin in vector psyllids: application to the study of vector-pathogen an Lu n va ac th si 30 Huang.A.L (1987), Electronmicroscospical Studies on the Morpholohy and Population Dynamic of Fastidious Bacteria Causing Citrus Likubin, In H.J.Su (Advisor), ph.D Thesis NTU 148pp 31 Jagoueix.S, Bové.J.M, Garnier.M (1997), “Comparison of the 16S/23S Ribosomal Intergenic Regions of “ Candidatus Liberobacter asiaticum” and “Candidatus Liberobacter africanum”, the two species associated with citrus huanglongbing (greening) disease”, International Journal of Systematic Bacteriology.47:224-227 32 James C (2008) “Global status of commercialized biotech/ GM Crop‟‟, ISAAA lu an Brief No, 37, International Service for the Acquisition of Agri- Biotech n va application, Ithaca, NY, USA SweetOrange (Citrus sinensis) to „Candidatus Liberibacter asiaticus‟ ie gh tn to 33 Kim.J.S, Sagaram.U.S, Burns.J.K, Li.J.L, and Wang.N (2008), “Response of Infection: Microscopy and Microarray Analyses”, Phytopathology, 99:50-57 p 34 Presley.D (1993), “Diseases of fruit crops‟‟, Dept of primary Industries, nl w Queensdland d oa 35 Su.H.J (2008), Production and Cultivation of virus-free citrus sapling for citrus an lu Rehabilitation in Taiwan, Asia-pacific Consortium on Agricultural nf va Biotechnology, New Delhi and Asia-pacific Association of Agricultural Research Institutions, Bangkok.P51 lm ul 36 Su.H.J, Ting-Hseng Hung and Mei Chen Tsai (1993), Detection of the fastidious z at nh oi bacteria causing The Asia citrus greening by DNA probes, In Proc 12th Conf.IOCV, Riverside(Abs), 466 37 Tanaka (1979), Edible plant collection, Tokyo, Japan z gm @ 38 Tatineni.S, Sagaram.U.S, Gowda.S, Robertson.C.J, Dawson.W.O, Iwanami.T, Wang.N (2008), “In planta Distribution of „Candidatus Liberibacter l m PCR”, Phytophatology, 85:592-598 co asiaticus‟ as Revealed by Polymerase Chaine Reaction (PCR) and Real-Time an Lu n va ac th si 39 Ngo Vinh Vien, Nguyen Thi Bich Ngoc (2009), Cultivation and health management of pathogen free citrus seeding in Northern Viet Nam, International Training Workshop on health management of pathogen-free citrus Orchard, SOFRI, Tien Giang – Viet Nam, 16-20th November, 2009 40 Weiburg.W.G, Barns.S.M, Pelletier.D.A, Lane.D.J (1991), “16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study”, Journal of Bacteriology 173: 697-703 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ THU THẬP MẪU VẬT LIỆU VÀ GIÁM ĐỊNH BỆNH VÀNG LÁ GREENING lu an n va B p ie gh tn to A d oa nl w nf va an lu lm ul D z at nh oi C Hình ảnh vƣờn thu mẫu z @ A: Vườn cam Sành (huyện Quang Bình, tỉnh Hà Giang); B: Vườn quýt Ngọt (huyện l gm Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn); C: Cây cam Sành (tỉnh Hà Giang); D: Cây quýt Ngọt (huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn) m co an Lu n va ac th si