(Luận văn) sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ DIỆU HƯƠNG lu an SÀNG LỌC VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG VI SINH va n VẬT CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM p ie gh tn to PHYTOPHTHORA SP GÂY BỆNH TRÊN CÂY CĨ MÚI oa nl w Cơng nghệ sinh học d Ngành: an lu 8420201 u nf va Mã số: Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Hồng Hiển ll m oi TS Nguyễn Xuân Cảnh z at nh z m co l gm @ an Lu NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 24 tháng 09 năm 2019 Tác giả luận văn lu an va n Nguyễn Thị Diệu Hương p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, em nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép em bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Hồng Hiển TS Nguyễn Xn Cảnh tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho em suốt trình học tập thực đề tài lu Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ em trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn an n va ie gh tn to Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh, tồn thể anh, chị, bạn bè em thực tập nghiên cứu phịng thí nghiệm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian thực luận văn tốt nghiệp p Và cuối cùng, với tất lịng kính trọng biết ơn vô hạn, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ người thân em nuôi nấng, động viên tạo động lực cho em suốt trình học tập nghiên cứu nl w d oa Em xin chân thành cảm ơn! an lu Hà Nội, ngày 24 tháng 09 năm 2019 ll u nf va Tác giả luận văn oi m z at nh Nguyễn Thị Diệu Hương z m co l gm @ an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn x Thesis abstract xii Phần Mở đầu lu an n va 1.1 Mục đích nghiên cứu đề tài 1.2 Yêu cầu đề tài 2.1 Tổng quan tình hình sản xuất tiêu thụ có múi 2.1.1 gh Tình hình sản xuất tiêu thụ có múi giới 2.1.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ có múi Việt Nam tn to Phần Tổng quan tài liệu p ie Sâu bệnh hại có múi nl w 2.2 Giới thiệu nấm Phytophthora gây bệnh có múi 2.3.1 Nấm Phytophthora 2.3.2 Cơ chế gây bệnh 11 2.3.3 Biện pháp phòng trừ 12 2.3.4 Ứng dụng vi sinh vật vào đối kháng bệnh hại thực vật 13 2.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài nước 15 2.4.1 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài nước 15 2.4.2 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài nước 17 d oa 2.3 ll u nf va an lu oi m z at nh z Phần Nội dung phương pháp nghiên cứu 19 @ Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 3.2 Vật liệu 19 3.3 Môi trường nghiên cứu 19 3.4 Dụng cụ, thiết bị hóa chất sử dụng 20 3.4.1 Dụng cụ 20 m co l gm 3.1 an Lu n va ac th iii si 3.4.2 Thiết bị 20 3.4.3 Hoá chất 20 3.5 Phương pháp nghiên cứu 20 3.5.1 Giữ giống vi sinh vật 20 3.5.2 Phương pháp phân lập mẫu nấm bệnh 20 3.5.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng nấm 22 3.5.4 Phương pháp tái lây nhiễm 23 3.5.5 Đánh giá dặc điểm sinh học 23 3.5.6 Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh chủng vi sinh vật 24 lu an 3.5.7 Khảo sát số đặc điểm hình thái sinh học chủng vi sinh vật 25 3.5.8 Định danh chủng nấm bệnh, xạ khuẩn, vi khuẩn 27 va n Phần Kết thảo luận 31 Phân lập xác định chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh có múi 31 tn to 4.1 Phân lập 31 4.1.2 Lây nhiễm nhân tạo 33 p ie gh 4.1.1 Một số đặc điểm sinh học chủng HDB DB5 35 nl w 4.1.4 Đặc điểm hình thái 34 4.1.3 Định danh chủng nấm DB5 37 4.2 Sàng lọc nghiên cứu số đặc điểm sinh học số chủng vi d oa 4.1.5 an lu sinh vật có khả đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh va u nf có múi 39 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả đối kháng 39 4.2.2 Một số đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn 38 40 4.2.3 Định danh chủng xạ khuẩn 38 43 4.2.4 Một số đặc điểm sinh học phân loại hai chủng vi khuẩn VK1 VK2 45 4.2.5 Định danh chủng vi khuẩn VK1 VK2 48 4.4 Thảo luận 50 4.4.1 Kết phân lập xác định chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh 51 4.4.2 Kết sàng lọc nghiên cứu số đặc điểm sinh học số ll 4.2.1 oi m z at nh z m co l gm @ chủng vi sinh vật có khả đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh an Lu có múi 52 n va ac th iv si Phần Kết luận kiến nghị 54 5.1 Kết luận 54 5.2 Kiến nghị 54 Tài liệu tham khảo 55 Phụ lục 58 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th v si DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT lu an Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt µl Microliter µM Micromol CMC Carboxylmethyl cellulose CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide ĐC Đối chứng DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid EtBr Ethidium bromide FAO Food and Agriculture Organization of n va the United Nations p ie gh tn to FCOJ Frozen Concentrate Orange Juice LB Luria Bertani ml Mililiter mm Milimeter Nanometer nl w nm Nông nghiệp Phát triển nông thôn PCR Polymerase Chain Reaction RNA ribosome ll u nf Species oi m sp Ribonucleic acid va rRNA Potato D-glucose agar an RNA lu PDA d oa NN&PTNT Tris-Acetic-EDTA WA Water agar z at nh TAE z m co l gm @ an Lu n va ac th vi si DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Một số đặc điểm hình thái chủng nấm phân lập 32 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vii si DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Một số bệnh điển hình có múi nấm Phytophthora gây Hình 2.2 Hình thái nấm Phytophthora Hình 2.3 Chu kì sống Phytophthora Hình 4.1 Một số dấu hiệu bệnh thu mẫu (A) rễ; (B) (C) (D) thân; (E) (F) (G) lá; (H) 31 Hình 4.2 Phân lập phương pháp bẫy cánh hoa hồng 31 Hình 4.3 Tái lây nhiễm chanh sau tuần 34 Hình 4.4 Đặc điểm hình thái chủng nấm HDB DB5 quan sát qua kính lu hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần 34 an Hình 4.5 Khả sinh enzyme cellulase chủng nấm HDB DB5 36 n va Hình 4.6 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng chủng tn to nấm HDB DB5 sau ngày nuôi 37 gh Hình 4.7 Cây phân loại chủng DB5 xây dựng phần mềm p ie MEGA7 38 Hình 4.8 Hoạt tính đối kháng số chủng vi khuẩn xạ khuẩn với chủng nl w nấm bệnh HDB DB5 môi trường PGA sau ngày nuôi cấy 39 d oa Hình 4.9 Quan sát hình thái chủng xạ khuẩn 38 40 an lu Hình 4.10 Ảnh hưởng nồng độ muối đến sinh trưởng, phát triển chủng xạ khuẩn 38 sau ngày nuôi cấy 41 va u nf Hình 4.11 Khả sinh sắc tố Melanin chủng xạ khuẩn 38 môi trường ll ISP6 37oC sau ngày nuôi cấy 42 m oi Hình 4.12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn z at nh 38 môi trường Gause-I sau ngày nuôi cấy 43 Hình 4.13 Cây phân loại chủng 38 xây dựng phần mềm MEGA7 44 z Hình 4.14 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn VK1 VK2 môi @ gm trường LB 30oC sau ngày nuôi cấy 45 l Hình 4.15 Khả di động hai chủng vi khuẩn VK1 VK2 nuôi cấy m co môi trường LB 30°C sau ngày nuôi 46 Hình 4.16 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng vi an Lu khuẩn VK1 môi trường LB sau ngày nuôi cấy 47 n va ac th viii si Hình 4.17 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn VK2 môi trường LB sau ngày ni cấy 47 Hình 4.18 Cây phân loại chủng VK1 xây dựng phần mềm MEGA7 49 Hình 4.19 Cây phân loại chủng VK2 xây dựng phần mềm MEGA7 50 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th ix si Hình 4.15 Khả di động hai chủng vi khuẩn VK1 VK2 nuôi cấy môi trường LB 30°C sau ngày nuôi Chú thích: A: Chủng vi khuẩn VK2 B: Chủng vi khuẩn VK1 Các chủng vi khuẩn cấy thẳng vào ống nghiệm chứa môi trường LB bán lỏng Sau ngày ni 30°C, quan sát thấy có chủng vi khuẩn VK1 làm đục môi trường mọc lan khỏi đường cấy, chứng tỏ có chủng vi khuẩn VK1 có khả di động Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng vi khuẩn Nhiệt độ yếu tố quan trọng đến phát triển vi khuẩn Các lu an loài vi sinh vật khác có q trình sinh lý khác nhau, việc xác định n va nhiệt độ sinh trưởng tối ưu cho chúng cần thiết nuôi cấy hay thí chủng vi khuẩn VK1 VK2 môi trường LB để nhiệt độ khác nhau: gh tn to nghiệm lây nhiễm, đối kháng thực tiễn khác Vì vậy, tơi tiến hành ni cấy p ie 20°C, 30°C, 40°C, 45°C, 50°C Quan sát kết sau ngày nuôi cấy d oa nl w ll u nf va an lu 30°C 40°C oi m 20°C z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 46 si 45°C 50°C lu an Hình 4.16 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng vi va n khuẩn VK1 môi trường LB sau ngày nuôi cấy p ie gh tn to d oa nl w lu 40°C 30°C ll u nf va an 20°C oi m z at nh z gm @ 50°C m co l 45°C an Lu Hình 4.17 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn VK2 môi trường LB sau ngày nuôi cấy n va ac th 47 si Qua quan sát đánh giá, ta thấy Cả chủng vi khuẩn sinh trưởng tốt 30°C Phù hợp với khoảng nhiệt độ sinh trưởng tốt nấm bệnh Chủng vi khuẩn VK1 sinh trưởng 20oC 40 oC, không sinh trưởng nhiệt độ >45oC Mặt khác, thấy ảnh hưởng nhiệt độ đến thay đổi màu sắc khuẩn lạc, nhiệt độ thấp khuẩn lạc có màu vàng chuyển dần sang màu trắng Khi nuôi nhiệt độ cao khuẩn lạc chuyển từ vàng sang nâu nhạt Chủng vi khuẩn VK2 sinh trưởng khoảng nhiệt độ rộng, nhiệt độ cao màu cam khuẩn lạc nhạt dần 4.2.5 Định danh chủng vi khuẩn VK1 VK2 Để định danh chủng vi khuẩn nghiên cứu này, sử dụng phương lu pháp sinh học phân tử dựa độ tương đồng đoạn gen 16S rRNA chủng với chủng xạ khuẩn ngân hàng gene Sử dụng cặp mồi 27F an n va p ie gh tn to 1492R để khuếch đại gen 16S rDNA chủng Mẫu DNA khuếch đại gửi tinh giải trình tự gen 16S rRNA Kết thu đoạn trình tự nucleotide, đoạn trình tự sử dụng để đưa vào công cụ Blast GenBank để xác định trình tự tương đồng Sản phẩm PCR tinh giải trình tự cơng ty 1st BASE (Singapore) Sau nhận trình tự, tiến hành so sánh trình tự thu với trình tự khác ngân hàng gen nhờ công cụ blast, xây dựng phân loại cho chủng VK1 VK2 phần mềm oa nl w MEGA7 Kết thể hình 4.18 4.19 d ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 48 si Pseudomonas aeruginosa BAMCPA07-48 100 29 VK1 55 Pseudomonas aeruginosa LX Pseudomonas aeruginosa DAP38 Pseudomonas aeruginosa MSB1 Pseudomonas aeruginosa FDAARGOS lu Pseudomonas aeruginosa PABL048 an Pseudomonas aeruginosa PA-VAP-1 n va Pseudomonas aeruginosa GIMC5001 tn to Pseudomonas aeruginosa PaKu8 ie gh p Pseudomonas aeruginosa RTAC13 w Pseudomonas aeruginosa B14130 d oa nl phần mềm MEGA7 va an lu Hình 4.18 Cây phân loại chủng VK1 xây dựng ll u nf Dựa vào phân loại thấy chủng vi khuẩn VK1 nằm nhánh với chủvới giá trị bootstrap 100 Bên cạnh kết trình tự nucleotide cho thấy mức độ tương đồng 16S rRNA hai chủng 100% Chủng VK2 nằm nhánh với chủng Bacilllus velezensis với giá trị bootstrap 42 Bên cạnh kết trình tự nucleotide cho thấy mức độ tương đồng 16S rRNA hai chủng 98,87% Xét mặt giá trị tin cậy mức độ oi m z at nh z l gm @ tương đồng hai chủng giống Ngồi đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa nghiên cứu, nhận thấy chủng vi khuẩn VK2 có nhiều đặc điểm giống với chủng Bacilllus velezensis ngân hàng gen m co an Lu n va ac th 49 si Bacillus velezensis 42 15 VK2 16 Bacillus subtilis Bacillus halotolerans Bacillus amyloliquefaciens Bacillus atrophaeus Bacillus nematocida 26 lu an Bacillus nakamurai n va Bacillus swezeyi tn to 11 Bacillus songklensis gh 46 Bacillus marisflavi p ie 61 w oa nl Hình 4.19 Cây phân loại chủng VK2 xây dựng d phần mềm MEGA7 lu oi z at nh 4.4 THẢO LUẬN m velezensis VK2 ll u nf va an Chính vậy, kết hợp đặc điểm sinh học phương pháp sinh học phân tử, đưa kết luận chủng VK2 có quan hệ họ hàng gần gũi với lồi Bacilllus velezensis chúng tơi đặt tên cho chủng Bacilllus z Cây có múi (Citrus) thực vật có hoa, có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới cận nhiệt đới đông nam châu Á Các loại chi m co l gm @ bụi lớn hay thân gỗ nhỏ, với thân có gai thường xanh mọc so le Quả loại có múi, bao quanh múi bên chứa nhiều tép mọng nước Họ có vai trị quan trọng mặt thương mại nhiều loài (hoặc lai ghép) trồng để lấy Quả ăn tươi hay vắt, ép lấy nước Một số loại thuộc họ này: cam, chanh, bưởi, quýt,… an Lu n va ac th 50 si Gần đây, diễn biến dịch bệnh có múi phức tạp mà nguyên nhân bệnh Trong năm gần từ năm 2015, giới sản xuất 1.938 triệu nước cam (chuyển đổi sang FCOJ), tỉ lệ ngày giảm chủ yếu từ dịch bệnh Theo nghiên cứu dịch bệnh chủ yếu nấm Phytophthora sp gây yếu tố quan trọng nguy hiểm bậc làm giảm sút sản lượng họ cam chanh Với dấu hiệu cổ rễ, thân, bệnh thường xuất công vườn trồng họ này, trồng đất thấp, thoát nước, triệu chứng lúc đầu vỏ thân bị sũng nước xung quanh gốc hay chản hai, chản ba cây, sau vỏ bị thối có màu nâu hợp thành vùng bất dạng, kèm theo ứ nhựa màu nâu đen có mùi lu an Nhiều biện pháp đưa để hạn chế bệnh dịch thối rễ, tàn lụi n va lá, thân xì mủ, thối có múi khơng đạt kết thường không đạt hiệu cao, gây ảnh hưởng với sức tn to mong đợi Bên cạnh việc sử dụng thuốc hóa học để phịng hay trừ bệnh Do cần phân lập chủng nấm Phytophthora gây bệnh p ie gh khỏe người, môi trường sinh vật sống khác w có múi, đồng thời sàng lọc định danh số chủng vi sinh vật có khả oa nl đối kháng với nấm Phytophthora gây bệnh có múi làm sở để d đưa giải pháp phòng chống bệnh lu u nf va an 4.4.1 Kết phân lập xác định chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh ll Quá trình thu mẫu thu 18 mẫu bao gồm: đất, rễ, thân, oi m bưởi, chanh Mẫu bệnh với dấu hiệu thối rễ, tàn lụi lá, z at nh thân xì mủ, thối quả, ngồi đào thử đất xung quanh lên thấy có mùi thối thời gian ủ bệnh Tiến hành phân lập z mẫu đất, thân, rễ, đặt cánh hoa hồng PGA Sau đặt vào tủ gm @ nuôi 30°C quan sát liên tục sau 24h nuôi cấy Kết sau ngày nuôi cấy tủ nuôi làm thu chủng nấm DB1, DB5, HQC, HDB, l RB Trong hai chủng nấm DB1 HDB có khả gây bệnh tái lây m co nhiễm chanh an Lu Chủng nấm HDB, sau khoảng 18 nuôi cấy bắt đầu quan sát cuống sinh bào tử sau khoảng 24 nuôi cấy quan sát thấy bào tử giải n va ac th 51 si phóng khỏi cuống sinh bào tử mạnh Đặc điểm: hệ sợi phân nhánh, khơng có vách ngăn; chuỗi bào tử hình chùm; bào tử hình trịn Ở chủng nấm DB5, sau khoảng 18 nuôi cấy bắt đầu quan sát cuống sinh bào tử sau khoảng 24 nuôi cấy quan sát thấy bào tử giải phóng khỏi cuống sinh bào tử mạnh Đặc điểm: hệ sợi phân nhánh, khơng có vách ngăn; chuỗi bào tử hình chùm; bào tử hình chanh Chất dinh dưỡng yếu tố quan trọng hàng đầu trình sinh trưởng hình thành bào tử chủng nấm Để đánh giá khả sinh trưởng chủng tiến hành nghiên cứu chúng loại môi trường PDA, WA, V8-juice argar đặt tủ nuôi 30°C sau ngày thấy chủng phát triển mạnh môi trường V8-juice Agar lu an PDA Phát triển yếu môi trường WA Hai chủng nấm thích hợp phát triển n va mơi trường giàu dinh dưỡng DB5 có quan hệ họ hàng gần gũi với lồi Phytophthora colocasiae chúng tơi gh tn to Kết hợp đặc điểm sinh học phương pháp sinh học phân tử, chủng p ie đặt tên cho chủng Phytophthora colocasiae DB5 4.4.2 Kết sàng lọc nghiên cứu số đặc điểm sinh học số d oa có múi nl w chủng vi sinh vật có khả đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh lu Do tác động bất lợi kể thuốc hóa học, việc sử dụng vi sinh vật va an thay loại thuốc hóa học coi thay bền vững để kiểm soát sâu u nf bệnh mầm bệnh thực vật (Chandler et al., 2011) Do sử dụng ll nguồn xạ khuẩn vi khuẩn lưu trữ Bộ môn Công nghệ Vi sinh- Học viện Nông oi m nghiệp Việt Nam tuyển chọn tổng số 80 chủng xạ khuẩn, 30 z at nh chủng vi khuẩn Kết tuyển chọn tim chủng xạ khuẩn 38 chủng vi khuẩn VK1 VK2 có khả đối kháng với nấm gây bệnh có múi Vì z vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu số đặc điểm hình thái, sinh lý-sinh hóa gm @ chủng xạ khuẩn 38 chủng vi khuẩn VK1 VK2 l Chủng xạ khuẩn 38 có khuẩn lạc hình trịn, tâm lồi Màu trắng xám Sau m co ngày nuôi cấy, màu sắc khuẩn lạc chuyển sang màu xám Sau 24h xuất hệ sợi, sợi phân nhánh, xuất cuống sinh bào tử dạng xoắn Sau 36h, cuống sinh an Lu bào tử dần duỗi thẳng, xuất bào tử Dựa theo hệ thống phân loại màu Tresner Backus (Tresner, 1963) chủng xạ khuẩn 38 xếp vào nhóm n va ac th 52 si White (W) Khi dùng que cấy lấy khuẩn lạc lên thấy khuẩn lạc mềm, sợi chất dính chặt vào mặt thạch không sinh sắc tố Chủng vi khuẩn VK1 Khuẩn lạc tròn, nhỏ, mép trơn, bề mặt nhày trực khuẩn Gram âm Chủng vi khuẩn VK2 khuẩn lạc trịn, nhỏ, mép trơn, bề mặt khơ trực khuẩn Gram dương Kết hợp đặc điểm sinh học phương pháp sinh học phân tử, chủng vi khuẩn VK1 có quan hệ họ hàng gần gũi với lồi Pseudomonas aeruginosa đặt tên cho chủng Pseudomonas aeruginosa VK1, chủng vi khuẩn VK2 có quan hệ họ hàng gần gũi với loài Bacillus velezensis đặt tên cho chủng Bacillus velezensis VK2, chủng xạ khuẩn 38 có quan hệ họ hàng gần gũi với lồi Streptomyces mutabilis đặt tên cho chủng Streptomyces mutabilis 38 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 53 si PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Phân lập chủng nấm DB1, HDB, HQC, RB, DB5 hai chủng nấm DB5, HDB có khả gây bệnh có múi Cả chủng nấm nghiên cứu khơng có khả sinh enzyme cellulase, phát triển tốt mơi trường giàu dinh dưỡng Chủng HDB có hệ sợi phân nhánh, khơng có vách ngăn, chuỗi bào tử hình chùm, bào tử hình trịn Chủng DB5 có hệ sợi phân nhánh, khơng có vách ngăn, chuỗi bào tử hình chùm, bào tử hình chanh Kết hợp đặc điểm sinh học phương pháp sinh học phân tử đặt tên cho chủng DB5 Phytophthora lu an colocasiae DB5 n va tn to Tuyển chọn chủng xạ khuẩn 38 chủng vi khuẩn VK1, VK2 đối kháng với nấm HDB DB5 Chủng 38 có khuẩn lạc hình trịn, tâm lồi Màu trắng xám Sau ngày nuôi cấy, màu sắc khuẩn lạc chuyển sang màu xám Sau p ie gh 24h xuất hệ sợi, hệ sợi phân nhánh, xuất cuống sinh bào tử dạng xoắn Sau 36h, cuống sinh bào tử dần duỗi thẳng, xuất bào tử Chủng vi khuẩn VK1 có khuẩn lạc trịn, nhỏ, mép trơn, bề mặt nhày trực khuẩn Gram w d Gram dương oa nl âm Chủng vi khuẩn VK2 khuẩn lạc trịn, nhỏ, mép trơn, bề mặt khơ, trực khuẩn Streptomyces mutabilis 38 oi m 5.2 KIẾN NGHỊ ll u nf va an lu Kết hợp đặc điểm sinh học phương pháp sinh học phân tử, đặt tên cho chủng vi khuẩn VK1 Pseudomonas aeruginosa BAMCPA0748 VK1, chủng vi khuẩn VK2 Bacillus velezensis VK2, chủng xạ khuẩn 38 z at nh Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả đối kháng chủng vi sinh vật với nấm Phytophthora gây bệnh có múi z @ Tiến hành thí nghiệm đánh giá điều kiện invitro invivo l gm với phương pháp nồng độ khác để thu kết tốt Ứng dụng chủng vi sinh vật đối kháng vào sản xuất chế phẩm sinh m co học để nâng cao suất chất lượng trồng an Lu n va ac th 54 si TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Lê Thị Hiền, Đinh Văn Lợi, Vũ Thị Vân, Nguyễn Văn Giang (2014) Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn đối kháng nấm bệnh Tạp chí Khoa học Phát triển 12 (5).tr 656-664 Lương Đức Phẩm (2004).Công nghệ vi sinh vật học Nhà xuất Nông Nghiệp Lương Đức Phẩm (2011) Sản xuát sử dụng chế phẩm sinh học nông nghiệp Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (chủ biên) (2012) Vi sinh vật học Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội lu Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Khuyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, an Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội va n Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến (1997), Vi sinh vật học – tn to tập II, Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thành Đạt (2000) Sinh học vi sinh vật, Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Thị Phong Lan, Võ Thị Thu Ngân, Trần Phước Lộc, Trần Hà Anh (2015) ie gh p Tuyển chọn chủng xạ khuẩn (Streptomyces spp.) đối kháng nấm Pyricularia Nguyễn Xuân Cảnh, Lê Thị Chinh, Phạm Hồng Hiển, Trịnh Thị Vân (2018), oa nl w grisea gây bệnh đạo ơn hại lúa Tạp chí Khoa học Phát triển 13 (8).tr 1442-1451 d Tuyển chọn nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn có khả đối lu an kháng nấm Aspergillus flavus gây bệnh cam qt, Tạp chí Nơng nghiệp Phạm Thị Tâm (2014) Nghiên cứu nấm Phytophthora Palmivora gây bệnh thối u nf 10 va phát triển nông thôn ll đen ca cao vài vi sinh vật đối kháng phòng trừ bệnh Nhà xuất oi Tô Thị Nhã Trầm (2007) Khảo sát ảnh hưởng dịch nấm Phytophthora z at nh 11 m DHKHTN, Hà Nội Capcasi tác nhân hóa lý ảnh hưởng đến sinh trưởng khả tạo đợt biến z tiêu (Piper nigrum L.) nuôi cấy mô @ gm II Tài liệu tiếng Anh: Agrios G N (2005) Plant Pathology Amsterdam: Elsevier Academic Press 13 Appiah AA, Bridge PD and Flood J (2003) Inter- and intraspecific morphometric m co l 12 variation and characterization of Phytophthora isolates from cocoa Plant Pathol; an Lu 52 (2).pp.168 n va ac th 55 si 14 Arnau J, Conejero V, Fagoaga C, Hinarejos C, Rodrigo I, Tuset JJ, Pina JA, Navarro L (2001) Increased tolerance to Phytophthora citrophthora in transgenic orange plants constitutively expressing a tomato pathogenesis related PR-5 Molecular Breeding; pp 175-185 15 Bressan W (2003) Biological control of maize seed pathogenic fungi by use of actinomycetes Biocontrol, 48.pp.233–240 16 Charu Singh, Ramendra Singh Parmar, P Jadon, A Kumar Characterization of actinomycetes against phytopathogenic fungi of Glycine max (L.) Asian J Pharm Clin Res, Vol 9, S uppl 1, 2016, 216-219 17 Chaudhary HS, Yadav J, Shricastava AR, Singh S, Singh AK, Gopalan N (2013) lu Antibacterial activity of actinomycetes isolated from different soil samples of an Sheopur (A city of central India) va 18 Cooke DEL, Drenth A, Duncan JM, Wagels G, Brasier CM (2000) A molecular n tn to phylogeny of Phytophthora and related Oomycetes Fungal Genet Biol Dhanasekaran D., Thajuddin N., Panneerselvam A (2012) Applications of Actinobacterial Fungicides in Agriculture and Medicine Fungicides for plant and p ie gh 19 Drenth and Irwin (2001) Routine DNA base Diagnostic Tesst for Phytophthora nl w 20 Animal Diseases pp 1-27 Heffer V and Powelson ML The Plant Health Instructor Laboratory Exercises in d lu 21 oa Front Plant Sci Ivana Puglisi, Alessandro De Patrizio, Loenardo Schena, Thomas Jung, Maria u nf 22 va an Plant Pathology Oregon State University, USA ll Evoli, Antonella Pane, Nguyen Van hoa, Mai Van Tri, Sandra Wright, Mauritz oi m Ramstedt, Christer Olsson, Roberto Faedda, Gaetano Magnano di San Lio, Santa z at nh Olga Cacciola (2017) Two previously unknown Phytophthora species associated with brown rot of Pomelo (Citrus grandis) fruits in Vietnam PLoS One Jung T, Stukely MJC, Hardy GEStJ, White D, Paap T, Dunstan WA, Burgess TI z 23 @ gm (2011) Multiple new Phytophthora species from ITS Clade associated with l natural ecosystems in Australia: evolutionary and ecological implications 24 m co Persoonia 26 pp 13–39 Marmur J (1961) A Procedure for the Isolation of Deoxyribo-nucleic Acid from an Lu Micro-Organism Journal of Molecular Biology (2) pp 208 - 218 n va ac th 56 si 25 Mee Kyung Sang, Anupama Sharestha, Du-Yeon Kim, Kyungseok Park, Chun Ho Pak, Ki Deok Kim (2013) Biocontrol of Phytophthora Blight and Anthracnose in Pepper by Sequentially Selected Antagonistic Rhizobacteria against Phytophthora capsici Plant Pathol J 29(2).pp.154–167 26 Selvakumar Dharmaraj, B Ashokkumar, K Dhevendaran (2010) Isolation of marine Streptomyces and the evaluation of its bioactive potential African Journal of Microbiology Research (4) pp 240 - 248 27 Sharifah Farhana Syed-Ab-Rahman, Lilia C Carvalhais, Elvis Chua, Yawen Xiao, Taylor J.Wass, Peer M Schenk (2018) Identification of Soil Bacterial Isolates Suppressing Different Phytophthora spp and Promoting Plant Growth lu Front Plant Sci an III Tài liệu nguồn internet: va http://wasi.org.vn/tong-quan-ve-nam-phytophthora-capsici-gay-benh-chet-nhanh- n tn to tren-cay-ho-tieu-va-cac-bien-phap-phong-tru/ https://dophyvn.com/tim-hieu-dac-tinh-cua-nam-phytophthora/ https://edis.ifas.ufl.edu/hs261 http://www.cuctrongtrot.gov.vn/TinTuc/Index/3677 p ie gh http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Rutaceae&list=familia https://www.nextfarm.vn/mot-so-benh-ve-thoi-re-va-than-se-co-nguon-goc-tu-dat https://sinhhocvietnam.vn/dac-tinh-cua-nam-phytophthora-gay-benh-vang-la-thoi-re/ https://link.springer.com/article/10.1007/s11274-010-0400-0 http://www.hoinongdan.org.vn/sitepages/news/37/70459/bung-no-san-xuat-cay- d oa nl w u nf va an lu ll an-qua-co-mui-mung-hay-lo https://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=621&ItemID=19037 11 http://iasvn.org/chuyen-muc/Benh-chet-nhanh-8211.html oi m 10 z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 57 si PHỤ LỤC Trình tự chủng nấm DB5 lu an n va p ie gh tn to GGGCACGGCGGATGGTTCATTCCCCCACTTAAACAACTTTCCTCGTGAGCCT TATCAACCTTTTTAGTGGGGGGTGTTGCTCGGCATTTTGCTGACCCGCCCCC TCTCATGGCGAATTTTGGGATTTCGGTCTGGTCTAGTAGCTTTTTGTTTTAAA CCATTTAACAATACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACT AGATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAAC GCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGA AATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTAT CAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGG ATGTGCCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTTGTGTGCCTTCGGGCCGAGGCTG CGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGG TGTTGCTGGTTGTGGAGGCTGCCTGCGTGGCCAGTCGGCGGCCGGTTTGTCT GCTGCGGCGTTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGC TGAACAGGCGCTTATTGTATGCTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGA ACCGTAGCTGTGTGTGGCTTGGCTTTTGAACCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTA GAGTGGCGGCTTCGGCTGTCGAGTGTCGATCCATTTTGGGAACTTTTGTGTG CGCTTTCGAGTGTGCATCTCAATTGGACCTGATTCCGGCAAG nl w Trình tự chủng vi khuẩn VK1 d oa AAGGGGGGTTCTTGGCCTCCCGTTTCAATGGCCTAGTTGGATTAGCTAGTGG TGGGTAAAGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATC AGTCCCNTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCTACGGGAGGCAGCAGTGGG AATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGNTGAAGA AGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTA ATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTG CCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGG CGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCT CAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTACTGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTG GTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCA GTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGT GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTC GACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAG TCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACG GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAG AACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCC ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 58 si TTCGGGAGCTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA GATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGC ACCTCGGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT GGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGC TACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCA TAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTC GGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGG CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAG CTAGTCTAACCGCAAGGGGGACGGTTACCACGGA Trình tự chủng vi khuẩn VK2 lu GGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTA ACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGT TCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCC an n va p ie gh tn to TTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGA ATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCC GGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCT TTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTG CTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCC CTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAA ACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAA GATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGT GTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGT TACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCG AAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAG CCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTA CTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGA CTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCAGAAT d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh Trình tự chủng xạ khuẩn 38 z ATTGACGTCCTTAANGNCTTGTAAACCTTGTTTCAGCAGGTAAGAAGTTAAA AGTGACGGTACTTGCAGAAGAAGCGCAGAATAACTACGTGCCAAGCAGCCG CCGGTAATACCTAGGGTATCAAGCGTGGTCCGGNATTTTTTTGGAGTTAAAG AGGCTCGTAGGCNGGCTTGTCANGTTCNTTTTTTAAATGCCCNGGGATTTAC gm @ m co l CCCGGGGTCTGCAGTCGATACGNNNAGGATAGAGTTCGGTAGGAGAGATCG GAATTCTTGGTGTATCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACTCCGGTG GCGAAGGCGGATCTATGGGNCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGG GGAACGAACAGGATTAGATCCCCTTGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCA an Lu n va ac th 59 si lu CTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGT GCCCTGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGG GGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGATGCAACGCGAAGA ACCTTACCAACGGCTTGACATACACCGGAAAACCCTGGAGACAGGGTCCCC CTTGTGGTCGGTGTGGCAGGTGGTGCACGGGTGTCGTAAGCTCGTGTCGTGA GATGTTGGGTTAAGTCCGGCAAAGAGCGCAACCCGAGTCCAACCTTGCCAG CAGGCCCTCGTCGTGTTGGGGACTCACTGGAGAGCGCCGGGCTCAACTAAG CGGAAGGAGGGGGGGACGTCAAGTCATCATGCCCGGCCTGTCTTGGGATGC ACACGCGCTACAATCACCGGTACAATGAGATGCGATACCGCGAGGTGGAGC GAATCTCACAAAAACNGTCTCTCTTAGTACTGAGGTCTGTAACTAGCTCCCA TGAAGTAGGTGTCAATAGTAATTACTGATCAACAATCATGCCGTGAATACG TTCNNCCNGCGTTCTTCACCACGCCCGTCATCTCACCAAAGTCGGTAACACC ACCAGAAGGTGGCCCAACCCGTTAAGGGAGGGAGCTCCTTAAAGGTG an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 60 si