(Luận văn) phát hiện nhanh bệnh greening trên cây có múi ở một số tỉnh phía bắc việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - lu an n va LÊ THỊ SINH tn to PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI p ie gh Tên đề tài: d oa nl w Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM nf va an lu KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC lm ul z at nh oi Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học @ : 2012 – 2016 m co l gm Khoá học : CNSH - CNTP z Khoa an Lu THÁI NGUYÊN - 2016 n va ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - lu an n va LÊ THỊ SINH PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI p ie gh tn to Tên đề tài: nl w Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM d oa KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC an lu nf va Hệ đào tạo : Chính quy Khoa Khố học : K44 - CNSH z at nh oi Lớp lm ul Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học : 2012 – 2016 z : ThS Bùi Đình Lãm gm @ Giảng viên : CNSH - CNTP m co l Khoa CNSH-CNTP, Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên an Lu THÁI NGUYÊN - 2016 n va ac th si i LỜI CẢM ƠN Đƣợc đồng ý Khoa CNSH - CNTP, trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Em đƣợc thực tập phịng thí nghiệm Khoa CNSH – CNTP, trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên với đề tài: „„Phát nhanh bệnh greening có múi số tỉnh phía Bắc Việt Nam’’ để hồn thành khóa luận ngồi nỗ lực thân em nhận đƣợc nhiều giúp đỡ Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, thầy giáo tận tình giảng dạy cho em suốt năm học lu Trƣớc hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới Ban giám hiệu an n va trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, hồn thành khóa luận ie gh tn to thầy giáo tận tình giảng dạy cho em suốt năm học vừa qua để em Đặc biệt, em xin đƣợc bày tỏ lịng kính trọng, lòng biết ơn sâu sắc tới ThS p Bùi Đình Lãm ngƣời tận tình hƣớng dẫn em suốt trình thực đề tài nl w Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến KS Lã Văn Hiền dành d oa nhiều thời gian quý báu trực tiếp hƣớng dẫn em thực nghiên cứu đề tài an lu Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân bạn bè quan nf va tâm, ủng hộ động viên em suốt trình học tập nghiên cứu giúp em hồn thành tốt khóa luận lm ul Do điều kiện thời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi thiếu sót em đƣợc hồn thiện z at nh oi Kính mong thầy giáo bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài Em xin chân thành cảm ơn ! z Sinh Viên m co l gm @ Thái Nguyên, ngày 20 tháng năm 2016 an Lu Lê Thị Sinh n va ac th si ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Các lồi cam, qt có ý nghĩa thực tiễn sản xuất Bảng 2.2: Tình hình sản xuất có múi châu lục giới giai đoạn 2011 - 2013 14 Bảng 2.3: Diện tích, suất sản lƣợng có múi giới giai đoạn 2005 – 20013 .16 lu an Bảng 2.4: Tình hình sản xuất có múi nƣớc ta giai đoạn 2005 – 2013 .16 Bảng 2.5: Tình hình sản xuất cam, quýt vùng nƣớc ta năm 2009 .17 Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi để phát tác nhân gây bệnh greening (Hung n va cs, 1999b), (Hung cs, 2004) [34], [35] 28 Các trang thiết bị máy móc dùng thí nghiệm .29 Bảng 3.3: Bảng thu thập mẫu địa phƣơng 30 gh tn to Bảng 3.2: Chu trình nhiệt phản ứng PCR .32 p ie Bảng 3.4: Kết thu thập mẫu vật liệu .36 Bảng 4.2: Kết đánh giá mẫu cam sành tỉnh Hà Giang 38 d Kết giám định bệnh vàng greening 42 nf va an lu Bảng 4.4: Kết đánh giá mẫu cam vinh Thái Nguyên 39 oa Bảng 4.3: nl w Bảng 4.1: z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Rầy chổng cánh Diaphorina citri 19 Hình 2.2 Triệu trứng nhiễm bệnh vàng greening có múi 21 Hình 4.1 Mẫu có múi thu thập để giám định bệnh vàng greening 37 Hình 4.2 Kết tách chiết DNA tổng số 40 Hình 4.3 Điện di sản phẩm PCR mẫu giám định bệnh greening 41 Hình 4.4 Kết tinh mẫu cam .44 Hình 4.5 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR - F từ mẫu lu DNA tách từ cam Vinh (Xã Quyết Thắng – Thái Nguyên,tỉnh an n va Thái Nguyên) 45 DNA tách từ cam sành (Quang Bình – Hà Giang) 45 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR – F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Vơ Chanh, huyện Phú Lƣơng, Thái Ngun, ie Hình 4.7 p gh tn to Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR – F từ mẫu Hình 4.6 nl w Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với d oa Hình 4.8 tỉnh Thái Nguyên) 45 an lu mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Quyết Thắng Hình 4.9 nf va – Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên) .46 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi lm ul GR - F từ mẫu DNA tách từ cam Sành (Quang Bình – Hà Giang) 47 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi z at nh oi Hình 4.10 GR - F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lƣơng, Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) .47 z m co l gm @ an Lu n va ac th si iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT lu an n va : Bảo vệ Thực vật Cs : Cộng CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA : Deoxyribonucleic Acid ĐC : Đối chứng dNTP : Deoxyribo-nucleotide triphosphate EDTA : Ethylene diamine tetraacetate FAO : Food and Agriculture Organization NN&PTNT : Nông nghiệp Phát triển Nông thôn PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Acid p ie gh tn to BVTV d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si v MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu nghiên cứu 1.4 Mục tiêu nghiên cứu 1.5 Ý nghĩa đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học lu 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 an Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU n va 2.1 Tổng quan có múi .4 tn to 2.1.1 Nguồn gốc phân loại gh 2.1.1.1 Nguồn gốc p ie 2.1.2 Đặc điểm sinh học có múi 2.1.3 Giá trị có múi .9 nl w 2.1.4 Yêu cầu sinh thái có múi 10 d oa 2.1.5 Một số sâu bệnh hại có múi .12 lu 2.1.6 Tình hình sản xuất có múi 14 nf va an 2.2 Bệnh vàng Greening có múi .18 2.2.1 Lịch sử bệnh .18 lm ul 2.2.2 Nguyên nhân triệu chứng bệnh 18 z at nh oi 2.2.3 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh vàng greening 21 2.2.4 Một số biện pháp phòng tránh 23 2.3 Tình hình nghiên cứu phát bệnh greening có múi 23 z 2.3.1 Các nghiên cứu phát bệnh giới 23 @ gm 2.3.2 Các nghiên cứu phát bệnh Việt Nam 26 l Phần 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 m co 3.1 Vật liệu nghiên cứu 28 3.1.1 Vật liệu thực vật 28 an Lu 3.1.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 28 n va ac th si vi 3.2 Phạm vi, địa điểm thời gian nghiên cứu 29 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 29 3.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 29 3.3 Nội dung nghiên cứu 30 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 3.4.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu vật liệu 30 3.4.2 Phƣơng pháp xác định biểu bệnh greening thông qua biểu bên 31 3.4.3 Phƣơng pháp phát bệnh greening có múi kỹ thuật PCR 31 3.4.4 Giải trình tự gene sản phẩm PCR .33 lu an 3.4.5 Phƣơng pháp sử lý số liệu .35 n va Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .36 4.2 Kết xác định mức độ biểu bệnh .37 gh tn to 4.1 Kết thu thập mẫu vật liệu 36 p ie 4.2.1 Kết xác định biểu bệnh thơng qua triệu chứng bên ngồi 37 nl w 4.3 Kết giám định bệnh vàng greening kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc d oa hiệu 40 lu 4.3.1 Tách chiết DNA tổng số mẫu 40 nf va an 4.3.2 Kết nhân đoạn gen 16s rDNA 40 4.4 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR từ mẫu bị bệnh greening 44 lm ul Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .48 z at nh oi 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 z I Tiếng Việt 50 @ gm II Tiếng Anh .52 m co PHỤ LỤC l III Tài liệu Internet 55 an Lu n va ac th si Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây ăn có múi (cam, quýt, chanh, bƣởi, v.v.) nhóm ăn quan trọng sản xuất nông nghiệp nƣớc ta Năm 2011, diện tích ăn có múi Việt Nam đạt 124.057 ha, diện tích trồng cam quýt chiếm tới 70.300 ha, bƣởi 45.000 chanh 18.000 (FAO, 2015) [52] Cây có múi loại trồng mang lại giá trị dinh dƣỡng, giá trị kinh tế cao Trong 100g thịt tƣơi có lu chứa 6-12% đƣờng, vitamin C từ 40-90 mg, Các acid hữu từ 0,4-1,2%, chất an khống dầu thơm Sản phẩm có múi đƣợc sử dụng với nhiều mục đích va n khác nhƣ làm thực phẩm ăn hàng ngày, làm mứt, nƣớc giải khát Tinh dầu tn to đƣợc cất từ vỏ quả, lá, hoa đƣợc dùng nhiều Công nghệ Thực phẩm Mỹ Bệnh greening nguyên nhân ảnh hƣởng trực tiếp đến suất chất p ie gh phẩm Vỏ dùng làm thuốc, hƣơng liệu (Đỗ Đình Đức, 1991) [7] lƣợng (Lê Mai Nhất, 2014) [11] Bệnh lan truyền với tốc độ nhanh gây w oa nl hại nghiêm trọng cho nhiều vùng trồng cam quýt giới Sản lƣợng bị d giảm từ 30% đến 100% (Bassanezi R.B cs, 2005) [25] Ở Việt Nam, bệnh lu an greening đƣợc ghi nhận gây hại ăn có múi từ năm 1960 Bệnh nf va greening gây hại lớn vào năm 1970 1990 nông trƣờng trồng lm ul cam Mức độ thiệt hại bƣởi từ 17% – 25% cam quýt từ 54% – 70% z at nh oi (Vien N.V cs,2009) [50] Bệnh vàng greening bệnh hại quan trọng nhất, khốc liệt nhất, nguy hiểm nhất, nghiêm trọng nhất, hủy diệt tàn phá nặng nề nghề trồng ăn có múi giới (Su cs., 2012) [44] Đặc z trƣng bệnh Greening có thời gian ủ bệnh dài, nên khó phát bệnh @ gm giai đoạn đầu thƣờng hay nhầm lẫn với bệnh khác nhƣ bị thiếu kẽm (Zn) co l (Lê Mai Nhất, 2014) [11] Đến bệnh biểu rõ ràng bệnh tàn phá m nặng biện pháp chữa trị gần nhƣ vô nghĩa lúc này, nhiều biện an Lu pháp đƣợc thực nhƣng không mang lại hiệu Hơn nữa, vi n va ac th si khuẩn gây bệnh vàng đến xuất chủng mới, có độc tính nặng (Hung cs, 199a) [33].Chính vậy, việc phát nhanh bệnh greening giai đoạn đầu vơ quan trọng việc phịng điều trị bệnh Ngày việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử cho phép chẩn đoán bệnh có múi mang lại hiệu cao với nhiều ƣu điểm nhƣ: độ nhạy cao, xác thời gian Có thể kể đến số kỹ thuật: PCR, real-time PCR, kỹ thuật lai phân tử, southern blot Kết thu đƣợc từ nghiên cứu chẩn đoán sinh học phân tử sở để sớm đƣa giải pháp phịng lu tránh Đến có nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để an phát bệnh greening có múi Xác định tác nhân gây bệnh vàng va n greening phƣơng pháp sinh học phân tử Phân lập vi khuẩn Candidatus tn to Liberibacter asiaticus gây bệnh greening từ rầy chổng cánh kỹ thuật PCR Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài: „„Phát p ie gh (Hung cs, 199a) [33] nhanh bệnh greening có múi số tỉnh phía Bắc Việt Nam’’ w oa nl 1.2 Mục đích nghiên cứu d Phát nhanh bệnh greening có múi kỹ thuật PCR lu an 1.3 Yêu cầu nghiên cứu nf va - Thu thập nguồn vật liệu số đối tƣợng có múi nhƣ: Cam, chanh, lm ul bƣởi, quýt số tỉnh miền Bắc Việt Nam z at nh oi - Xác định biểu bệnh greening mẫu vật liệu thu thập đƣợc - Giám định bệnh vàng greening có múi phản ứng PCR với z @ cặp mồi đặc hiệu co l 1.4 Mục tiêu nghiên cứu gm - Giải trình tự gene sản phẩm PCR từ mẫu bị bệnh greening (từ 2-3 mẫu) an Lu Cam, chanh, quýt, bƣởi, địa phƣơng khác m - Thu thập đƣợc mẫu vật liệu số đối tƣợng có múi nhƣ: n va ac th si 42 bệnh greening giống sản phẩm tƣơi nhập vào Việt Nam Với kỹ thuật này, từ nhận mẫu phòng nghiệm cơng đoạn cuối 4-5 Đây kỹ thuật ngày đƣợc sử dụng rộng rãi chẩn đoán bệnh vàng greening để kiểm định giống trƣớc xuất vƣờn nhƣ xác định lây lan bệnh vƣờn môi giới truyền bệnh Bảng 4.4: Kết giám định bệnh vàng greening Địa điểm Giống lu an n va Đƣờng Kết số chạy - Lá vàng lốm đốm - Lá vàng, gân xanh - Lá vàng, gân xanh - Lá vàng lốm đốm - Lá vàng, gân xanh - Lá vàng lốm đốm - Lá vàng, gân xanh 10 - Lá vàng, gân xanh 11 - Lá vàng cục 10 12 + Lá vàng, gân xanh 11 13 - Lá vàng, gân xanh 14 - Lá vàng, gân xanh Triệu chứng ie gh tn to Xã Vĩ Mẫu p Thƣợng, huyện w Cam nf va Sành an lu Giang d tỉnh Hà oa nl Quang Bình, Tỷ lệ nhiễm 1/16 lm ul 13 15 - Lá vàng, gân xanh 14 16 - Lá vàng cục 15 17 - 16ĐC 18 - Cam - Lá vàng cục Vinh + Lá vàng, gân xanh + Lá vàng, gân xanh z at nh oi 12 (6.25%) z @ Lá vàng, gân xanh m co l gm Khơng có biểu an Lu n va ac th si 43 Mẫu Đƣờng Kết số chạy - Lá vàng lốm đốm Xã Quyết + Lá vàng, gân xanh 4/11 Thắng, - Lá vàng, gân xanh (36,4%) - Lá vàng lốm đốm 10 - Lá vàng, gân xanh 11 - Lá vàng, gân xanh 10 12 + Lá vàng, gân xanh 11ĐC 13 - Khơng có biểu 1ĐC - Khơng có biểu Cam - Lá vàng, gân xanh Vinh + Lá vàng, gân xanh - Lá vàng lốm đốm - Lá vàng lốm đốm - Lá vàng, gân xanh - Lá vàng lốm đốm 10 - Lá vàng, gân xanh lm ul - Lá vàng, gân xanh 10 12 - Lá vàng, gân xanh 11 13 + Lá vàng, gân xanh 12 14 - Lá vàng, gân xanh 13 15 + 14 16 + Địa điểm Giống Thái Triệu chứng Tỷ lệ nhiễm Nguyên,tỉnh Thái Nguyên lu an n va ie gh tn to Xã Vô p Chanh, huện Nguyên, tỉnh d oa nl Thái w Phú Lƣơng, an lu Thái Nguyên nf va 11 4/14 z at nh oi (28.57%) z gm @ Lá vàng, gân xanh co l Lá vàng, gân xanh m Chú thích:(+), Cây nhiễm bệnh greening; (-), Cây không nhiễm bệnh greening an Lu Các kết nghiên cứu đạt đƣợc có tƣơng đồng với kết công bố Hung cs (2004) [35] tác giả sử dụng mồi đặc hiệu nhân đoạn 16s rDNA n va ac th si 44 với khích thƣớc 226 bp để giám định bệnh vàng greening cam Đài Loan Ở hình 4.3A, 4.3B, 4.3C xuất băng sản phẩm PCR có kích thƣớc 226 bp nhƣ dự kiến Điều chứng tỏ mẫu thu thập cam Sành cam Vinh nghi vấn bị nhiễm bệnh vàng greening Tuy chƣa có đánh giá mức độ gây hại bệnh vàng greening có múi giám định, nhƣng kết thu đƣợc tiền đề để giám định bệnh greening trình sản xuất giống bệnh 4.4 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR từ mẫu bị bệnh greening lu  Kết tinh sản phẩm PCR an n va p ie gh tn to d oa nl w Hình 4.4 Kết tinh mẫu cam lu nf va an Ghi chú: (1): mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Quyết Thắng – Thái , (Nguyên,tỉnh Thái Nguyên), (2): mẫu DNA tách từ cam sành (Quang Bình – Hà Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) z at nh oi lm ul Giang), (3): mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lƣơng,  Kết nghiên cứu giải trình tự dựa mồi xi GR – F (5‟ - 3‟) đƣợc thể hình 4.5, 4.6,4.7 z m co l gm @ an Lu n va ac th si 45 Hình 4.5 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Quyết Thắng, Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên) lu an n va p ie gh tn to oa nl w d Hình 4.6 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR – F từ mẫu DNA nf va an lu tách từ cam sành (Quang Bình – Hà Giang) z at nh oi lm ul z l gm @ m co Hình 4.7 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR – F từ mẫu DNA tách an Lu từ cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lương, Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) n va ac th si 46 Kết giải trình tự gen thu đƣợc hình 4.5, 4.6 4.7 tiến hành phân tích BLAST NCBI, so sánh mức độ tƣơng đồng 99% đến 100% cho thấy chủng vi khuẩn gây bệnh greening cam Vinh (Xã Quyết Thắng – Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên), cam Sành (Hà Giang) cam Vinh (Xã Vô Chanh, Phú Lƣơng, Thái Nguyên, tỉnhThái Nguyên) chủng vi khuẩn Candidatusloài Liberibacter asiaticus (Las) châu Á gây Kết kiểm tra PCR phù hợp với nghiên cứu trƣớc (Hung T.H et al., 1999, 2000; Hà Minh Trung et al., 2003; Lê Mai Nhất, 2014; Lê Mai Nhất et al., 2014) So với nghiên cứu trƣớc đây, nghiên cứu lu sử dụng kết giải trình tự gen phân tích phần mềm Blast an NCBI để tăng cƣờng độ tin cậy xác định, làm rõ nguyên nhân gây bệnh va n greening số ăn có múi miền Bắc to gh tn Từ kết giải trình tự gen thu đƣợc hình 4.5, 4.6 4.7 tiến hành so sánh p ie BLAST NCBI, kết đƣợc thể hình 4.8, 4.9 4.10 d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z gm @ Hình 4.8 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Quyết Thắng – Thái m co l Nguyên,tỉnh Thái Nguyên) an Lu n va ac th si 47 lu an n va Hình 4.9 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi GR - p ie gh tn to F từ mẫu DNA tách từ cam Sành (Quang Bình – Hà Giang) d oa nl w nf va an lu lm ul z at nh oi Hình 4.10 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi GR F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lương, Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) z gm @ Từ kết hình 8, 4.9 4.10 cho thấy mức độ tƣơng đồng 99% đến 100% cho thấy chủng vi khuẩn gây bệnh greening cam Vinh (Xã Quyết Thắng l co Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên) cam Sành (Hà Giang) cam Vinh (Xã Vô m Chanh, huyện Phú Lƣơng, Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) chủng vi an Lu khuẩn Candidatus loài Liberibacter asiaticus (Las) châu Á gây n va ac th si 48 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu thu đƣợc, đề tài đƣa kết luận sau: Thu thập đƣợc mẫu vật liệu đối tƣợng có múi: cam Sành, cam Vinh Đánh giá đƣợc biểu bệnh greening đối tƣợng thông lu an qua triệu chứng bên Kết tổng số 41 mẫu vật liệu thu đƣợc có va 38/41 mẫu có biểu bệnh greening, 3/41 mẫu khơng có biểu bệnh n to tn Đã tiến hành giải phẫu mô thực vật mẫu vật liệu thu thập đƣợc (71 ie gh mẫu 64 mẫu có biểu hiện, mẫu khỏe) Kết cho thấy xuất p đám sợi có sai khác với mẫu mô khỏe mạnh nl w Kết giám định bệnh vàng greening kỹ thuật PCR thu đƣợc d oa số kết nhƣ sau: Trong 16 mẫu cam sành Hà Giang giám định, kết PCR cho an lu thấy có 1/16 mẫu có biểu dƣơng tính với bệnh greening (xuất băng có kích thƣớc 226 bp) Tƣơng tự, mẫu cam Vinh xã Quyết Thắng xã Vô Chanh, nf va huyện Phú Lƣơng thành phố Thái Nguyên có số mẫu dƣơng tính với bệnh greening z at nh oi lm ul lần lƣợt 4/11 4/14 mẫu Kết giải trình tự gen đƣợc tiến hành phân tích BLAST NCBI, so sánh mức độ tƣơng đồng 99% đến 100% cho thấy chủng vi khuẩn gây bệnh z greening cam Vinh (Xã Quyết Thắng, Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên), cam @ gm Sành (Hà Giang) cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lƣơng, Thái Nguyên, m co (Las) châu Á gây l tỉnh Thái Nguyên) chủng vi khuẩn Candidatusloài Liberibacter asiaticus an Lu n va ac th si 49 5.2 Kiến nghị Từ kết giám định bệnh greening có múi nghiên cứu đƣa số kiến nghị nhƣ sau: Tiếp tục thu thập mẫu vật liệu đối tƣợng có múi địa phƣơng khác Tiếp tục phân tích PCR kỹ thuật sinh học phân tử khác để giám định bệnh vàng greening lu Tiếp tục tiến hành tinh sản phẩm PCR, đọc trình tự so sánh trình tự an nucleotit thu đƣợc mẫu nhiễm bệnh vùng khác để định va n danh sác loài vi khuẩn gây bệnh vàng greening có múi Tiến hành hƣớng nghiên cứu để phòng trừ bệnh vàng greening p ie gh tn to Việt Nam d oa nl w phục vụ cho trình sản xuất giống bệnh nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Phí Văn Ba (1976), Con đường trao đổi chất sinh học, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Mạnh Chinh (2005), Sổ tay trồng ăn quả , Nxb Nông nghiệp Phạm Thị Chữ (1996) “Tuyển chọn, nhân giống bƣởi Phúc Trạch suất cao, phẩm chất tốt phục vụ xuất nội tiêu”, Tạp chí Khoa học công nghệ quản lý kinh tế, tháng 6/1996, trang 228-229 lu Đƣờng Hồng Dật (2003) Cam, chanh, quýt, bưởi kỹ thuật trồng, Nxb Lao an động - xã hội va n Bùi Huy Đáp (1960), Cây ăn quả nhiệt đới, tập (1), Nxb Nông thơn tn to Lê Đình Định (1990), “Tình hình dinh dƣỡng đất trồng cam chu kỳ p ie gh số loại đất vùng Phủ Quỳ - Nghệ Tĩnh”, Một số kết quả nghiên cứu khoa học trạm thí nghiệm nhiệt đới Tây Hiếu 1960- 1990, Nxb Nông nghiệp w oa nl Đỗ Đình Đức (1991), “Một số kết nghiên cứu tƣợng vân vàng d cam, quýt miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Bảo vệ Thực vật, số 6, Tr an lu 10-13 nf va Vũ Công Hậu (1996), Trồng ăn Việt Nam Nhà xuất Nơng nghiệp lm ul TP Hồ Chí Minh z at nh oi Trần Công Khánh (1981), Thực hành hình thái giải phẫu thực vật, Nxb Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội 10 Đinh Hải Lâm (2001) “Nghiên cứu tạo vật liệu bệnh bảo quản nguồn z gene có múi in vitro số giống cam quýt địa phƣơng nhập nội”, @ Nam co l gm Luận văn Thạc sỹ Nông nghiệp Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt m 11 Lê Mai Nhất (2014), “Nghiên cứu bệnh vàng greening hại ăn có múi an Lu số tỉnh phía bắc Việt Nam đề xuất biện pháp phòng chống”, Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam n va ac th si 51 12 Nguyễn Thị Minh Phƣơng (2007) Cây ăn đặc sản kỹ thuật trồng, Nxb nơng nghiệp Hà Nội 13 Lê Đình Sơn (1993), “Phân tích để đạo bón phân cho cam”, Tạp chí Khoa học đất, (3), Nxb Nơng nghiệp, trang 56 - 62 14 Phạm Thừa (1965), “Quy luật sinh trƣởng, phát triển cành Thu, Hè, Đông, Xuân Cam Sành Bố Hạ”, Tạp chí KHKTNN, (2), trang 35 - 40 15 Trần Thế Tục, Cao Anh Long, Hồng Ngọc Thuận, Hồng Thế Lƣ (1998), Giáo trình ăn quả, Nxb Nông nghiệp Hà Nội lu 16 Quyền Đình Thi, Nơng Văn Hai (2008) Cơng nghệ Sinh học tập 2: Những ký an thuật PCR ứng dụng phân tích DNA, Nxb Khoa học tự nhiên va n Công nghệ tn to 17 Hà Minh Trung (2006), “ Hồn thiện cơng ghệ sản xuất có múi đặc sản p ie gh (cam, quýt, bƣởi) bệnh greening bệnh virus khác tỉnh phía bắc‟‟, Kỷ yếu hội nghị tổng kết khoa học công nghệ nông nghiệp 2001-2005, tr.190, Nxb Nông nghiệp w oa nl 18 Hà Minh Trung, Ngô vĩnh viễn, Đỗ Thành Lâm (1995), “ Kết giám định d kế hoạch phòng chống bệnh vàng cam quýt Đồng sông Cửu Long lu an ” Tạp chí Nơng nghiệp CNTP số 3, 1995, tr.95-97 nf va 19 Hà Minh Trung, Ngô Vĩnh Viễn, Vũ Đình Phú, Mai Thị Liên, Lê Mai Nhất, lm ul Nguyễn Bích Ngọc (2003), Bệnh greening nguyên nhân gây suy thối vƣờn z at nh oi có múi giải pháp khắc phục, Kỷ yếu hội thảo khoa học quốc gia Bảo vệ Thực vật, Nxb Nông nghiệp, tr.1-12 20 Trung tâm làm vƣờn trồng trọt, Viện Bảo vệ Thực vật (2003), Hướng dẫn sử z dụng dầu khống phịng trừ tổng hợp sâu bệnh hại ăn có múi gm @ Việt Nam, Nxb Nông nghiệp Hà Nội m Đại học Nông lâm Thái Nguyên co l 21 Đào Thanh Vân, Trần Nhƣ Ý, Nguyễn Thế Huấn (2000) Giáo trình ăn quả, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội an Lu 22 Đỗ Năng Vịnh (2008), Cây ăn có múi-Công nghệ sinh học chọn tạo giống n va ac th si 52 II Tiếng Anh 23 Aubert.B, Garnier.M, Cassin.J.C, Bertin.Y (1988), Citrus greening disease survey in East and West African countries South of Sahara, Proceeding of 10th conference of IOCV, IOCV, Riverside 1988, 231 – 237 24 Aubert, B (ed) (1987), Regional Workshop on citrus greening Huanglongbin disease, Review and Abstract FAO-UNDP, China.Dec.6-12/1987 25 Bassanezi R.B., Busato L.A., Bergamin Filho A., Amorim L., Gottwald T.R (2005), Spatial distribution of huanglongbing symptomatic trees in citrus groves in São lu Paulo, Brasil, Proceedings 2nd Inernational Citrus Canker and Huanglongbing an Research Workshop, Florida Citrus Mutual, Orlando 2005, H-7 va n 26 Bové.J.M, P Bonnet, M.Garnier and B Aubert (1980), Pennicilin and to tn tetraciline treatment of greening disease affected citrus plants in the p ie gh glasshouse and the bacterial nature of the procaryote associated with greening In proc th conf IOCV, IOCV, Riverside.tr.91-102 27 Bové.J.M, Garnier.M, Ahlawat.Y.S, Chakraborty.N.K, Varma.A (1993), nl w oa Detection of the Asian strains of the greening BLO by DNA-DN‟ƣ\A d hybridisation in Indian orchard trees and Malaysian Diaphorina citri lu 258-263 nf va an psyllids, Proceedings of 12th Conference IOCV, IOCV, Riverside 1993, lm ul 28 Bové.J.M, Garnier.M (1984), Citrus greening and psylla vectors of the disease 109-114 z at nh oi in the Arabian peninsula In Proc.9th Conf IOCV, IOCV, Riverside Tr 29 Bové.J.M Nguyen Minh Chau, Ha Minh Trung, Bourdeaut.J and Garier.M z (1996), “Huanglongbing (greening) in Viet Nam Detection of Liberobacter @ gm asiaticum by DNA-Hybridization with probe in 2.6 and PCR Ampification m and blight, 258-266 co l of 16S Ribosomal DNA”, Thirteenth IOCV Conference, 1996-Procaryotes an Lu n va ac th si 53 30 Brlansky.R.H and Rogers.M.E (2007), “ Citrus Huanglongbing: Understanding the Vector-Pothogen Interaction for Disease Mangament”, Citrus Research and Education Center, University of Florida-IFAS 31 Garnier.M, Daniel.N and Bové.J.M (1984), An etiology of citrus greening diseases Ananals of Microbiology, tr.169-179 Halbert 32 S.E., Manjunath K.L (2004), “Asian citrus psyllids (Sternorrhycha: Psyllidae) and greening disease of citrus: a literature review and assessment of risk in Florida”, Florida Entomologist 87: 330- lu 353 an 33 Hung.T.H, H.L Wu and H.J.Su (1999a), “Detection of fastidious bacteria va n causing citrus greening disease by nonradioactive DNA probes”, Ann to tn Phytopathol Soc.Jpn.65:14-146 p ie gh 34 Hung.T.H, Wu.H.L and Su.H.J (1999b), “Development of a rapid method for the diagnosis of citrus greening disease usingthe polymerase chain reaction”, Journal of Phytopathology.147: 599-604 w oa nl 35 Hung.T.H, Hung.S.C, Chen.S.N, Hsu.M.H and Su.H.J (2004), “Detection by d PCR of Candidatus Liberibacter asiaticus, the bacterium causing citrus of lu nf va an huanglongbin in vector psyllids: application to the study of vector-pathogen relationships”, Plant pathology.53:96-102 lm ul 36 Huang.A.L (1987), Electronmicroscospical Studies on the Morpholohy and z at nh oi Population Dynamic of Fastidious Bacteria Causing Citrus Likubin, In H.J.Su (Advisor), ph.D Thesis NTU 148pp 37 Jagoueix S., Bové J.M., Garnier M (1996), “PCR detection of the two z „Candidatus‟ liberobacter species associated with greening disease of @ gm citrus” Molecular Cellular Probes 10: 43-50 co l 38 Jagoueix.S, Bové.J.M, Garnier.M (1997), “Comparison of the 16S/23S m Ribosomal Intergenic Regions of “ Candidatus Liberobacter asiaticum” and an Lu “Candidatus Liberobacter africanum”, the two species associated with n va ac th si 54 citrus huanglongbing (greening) disease”, International Journal of Systematic Bacteriology.47:224-227 39 James C (2008) “Global status of commercialized biotech/ GM Crop‟‟, ISAAA Brief No, 37, International Service for the Acquisition of Agri- Biotech application, Ithaca, NY, USA 40 Kim.J.S, Sagaram.U.S, Burns.J.K, Li.J.L, and Wang.N (2008), “Response of SweetOrange (Citrus sinensis) to „Candidatus Liberibacter asiaticus‟ Infection: Microscopy and Microarray Analyses”, Phytopathology, 99:50- lu 57 an 41 Presley.D (1993), “Diseases of fruit crops‟‟, Dept of primary Industries, va n Queensdland tn to 42 Su.H.J (2008), Production and Cultivation of virus-free citrus sapling for citrus p ie gh Rehabilitation in Taiwan, Asia-pacific Consortium on Agricultural Biotechnology, New Delhi and Asia-pacific Association of Agricultural Research Institutions, Bangkok.P51 nl w oa 43 Su.H.J, Ting-Hseng Hung and Mei Chen Tsai (1993), Detection of the fastidious d bacteria causing The Asia citrus greening by DNA probes, In Proc 12th lu nf va an Conf.IOCV, Riverside(Abs), 466 44 Su H.J., Feng Y.C., Hsin C and Hung T.H (2012) Current researches and lm ul Health management of Citrus Huanglongbing in 166 Taiwan, International z at nh oi Symposium on Epidemiology and disease management of citrus Huanglongbing disease for sustainable citrus production in the ASPAC Region, NTU, I-3, November – 10, 2012 z @ 45 Tanaka (1979), Edible plant collection, Tokyo, Japan gm 46 Tatineni.S, Sagaram.U.S, Gowda.S, Robertson.C.J, Dawson.W.O, Iwanami.T, co l Wang.N (2008), “In planta Distribution of „Candidatus Liberibacter an Lu Time PCR”, Phytophatology, 85:592-598 m asiaticus‟ as Revealed by Polymerase Chaine Reaction (PCR) and Real- n va ac th si 55 47 Ngo Vinh Vien, Nguyen Thi Bich Ngoc (2009), Cultivation and health management of pathogen free citrus seeding in Northern Viet Nam, International Training Workshop on health management of pathogen-free citrus Orchard, SOFRI, Tien Giang – Viet Nam, 16-20th November, 2009 48 Walter Reuther et al (1989), The citrus industry Vol (2), Puplication of University of California, USA 49 Weiburg.W.G, Barns.S.M, Pelletier.D.A, Lane.D.J (1991), “16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study”, Journal of Bacteriology 173: lu 697-703 an 50 Vien N V and Ngo N T B (2009) Cultivation and health management of va n pathogen free citrus seeding Northern Vietnam, Internatioal Training to tn Workshop on Health Management of Pathogen - free Citrus Orchard ie gh SOFRI , Tien Giang-Vietnam, 16 – 20 th Norvember, 2009 p III Tài liệu Internet 51 Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn (2014), Tổng diện tích ăn w oa nl phân theo địa phương, Số liệu trồng trọt, http://www.mard.gov.vn d 52 FAOSTAT (2015), Agricultural data, available from: http://faostat3.fao.org lu nf va an 53 "Automated DNA Sequencing Chemistry Guide."http://www.bioscienceresearch.co.nz/downloads/files/DNA_sequen z at nh oi lm ul cing/ABI_Seq_Ref_Guide.pdf z m co l gm @ an Lu n va ac th si PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ THU THẬP MẪU VẬT LIỆU VÀ GIÁM ĐỊNH BỆNH VÀNG LÁ GREENING lu an n va B p ie gh tn to A d oa nl w nf va an lu lm ul D z at nh oi C Hình ảnh vƣờn thu mẫu z A: Vƣờn cam Sành (huyện Quang Bình, tỉnh Hà Giang); B: Cây cam Sành (huyện @ l gm Quang Bình, tỉnh Hà Giang); C: Cây cam Vinh (Quyết Thắng, Thái Nguyên); D: Cây Cam Vinh (Vô Chanh, Thái Nguyên) m co an Lu n va ac th si