Đặc điểm quá trình lên men Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin là những chủng vi sinh vật hiếu khí nên quá trình nuôi cấy cần lắc hoặc khuấy trộn kèm theo sục khí liên tục với lưu lượng khoảng 1 VVM ; cánh khuấy có đường kính phù hợp, thể tích nồi lên men phù hợp
BÀI THU HOẠCH Tetracycline Đại cương (*) Tetracyclin phát lần vào năm 1953 phương pháp khử clo clotetracyclin Sau người ta tìm thấy chủng xạ khuẩn Str Viridifaciens có khả sinh tổng hợp tetracyclin thực tế sản xuất sử dụng Str Aureofaciens điều kiện nuôi cấy đặc biệt có bổ sung thêm chất ức chế clo hóa (*) Cơ chế tác dụng : ● Tetracyclin kháng sinh phổ rộng có tác dụng kìm khuẩn ức chế trình tổng hợp protein vi khuẩn Cơ chế tác dụng tetracyclin khả gắn vào ức chế chức ribosom vi khuẩn, đặc biệt gắn vào đơn vị 30S ribosom Do vậy, tetracyclin ngăn cản trình gắn aminoacyl t - RNA dẫn đến ức chế trình tổng hợp protein ● Khi vi khuẩn kháng tetracyclin, vị trí gắn tetracyclin ribosom bị biến đổi Vì vậy, tetracyclin không gắn vào ribosom vi khuẩn tác dụng Đặc điểm (*) Công thức cấu tạo chung :Các kháng sinh nhóm tetracyclin có khung octahydro naphtaxenic: (*)Tính chất lý hóa: Các Tetracyclin chất bột màu vàng, tan nước, tan dung dịch có tính base hay acid Tetracyclin base kết tinh vàng sẫm, tan nước dung môi hữu Dạng base không bền nên thực tế sản xuất tetracyclin clohydrat bột vàng sang tan nước vừa bền vững vừa dễ sử dụng Tính lưỡng tính : Do phân tử KS nhóm tetracyclin có chứa nhóm dimetylamino có khả tạo muối với acid nhóm hydroxyl có khả tạo muối với kiềm với Ca2+ , Mg2+ ( tạo tetracyclinat ) Khơng bền vững với tác nhân oxy hóa oxy khơng khí Trong dung dịch kiềm dễ bị oxy hóa tạo dẫn chất có màu thẫm Bị phân hủy ánh sáng Phát huỳnh quang môi trường kiềm Các cyclin cho phản ứng alcaloid với acid picric, iodomercurid, iodoiodid Tan dung dịch kiềm tạo tạo màu với Fe 3+ Kết hợp với ion hóa trị 3, thường Fe 3+, Cu2+, Fe2+, Co2+, Zn2+, tạo phức chelat, hấp thu Kém bền với nóng ẩm ánh sáng → phân hủy thuốc, tạo thành anhydrotetracyclin, 4-epitetracyclin, anhydro 4-epi-tetracyclin có độc tính cao thận Dễ bị đồng phân hóa ( cấu trúc hydro naphtaxenic ) dung dịch nước pH 2,0 – 6,0 tạo epitetracyclin khơng có tác dụng kháng sinh Hiện tượng đồng phân hóa xảy nhanh tetracyclin clotetracyclin Điều chế Phương pháp vi sinh: từ Streptomyces khác Phương pháp bán tổng hợp: Các chất bán tổng hợp thường từ chất thiên nhiên (clotetracyclin tetracyclin), đó: Vị trí 2: thay nhóm carboxamid (rolitetracyclin) Vị trí 6: loại nhóm hydroxyl methyl (metacyclin, minocyclin, doxycyclin) Vị trí 7: loại nhóm halogen, amin hóa (minocyclin) Vị trí 9: amin hóa (amicyclin) Tổng hợp tồn phần Sinh tổng hợp Tetracyline Tetracycline Dữ liệu dược động học Sinh khả dụng 75% Chủn hóa dược phẩm Khơng Chu kỳ bán rã sinh học 8–11 hours, 57–108 (hỏng thận) Bài tiết Nước tiểu (>60%), thận Công thức hóa học C22H24N2O8 Khối lượng phân tử 444.435 g/mol a Chủng giống Khả sinh tổng hợp kháng sinh nhóm tettracyclin tập trung chủ yếu xạ khuẩn, phần lớn xạ khuẩn có đặc điểm sau: • Hiếu khí • Ưa ẩm, độ ẩm thích hợp 40-50% • Nhiệt độ thích hợp sinh trưởng 27-28 °C , pH từ 6,6-7 Các giống xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin gồm chủng Streptomyces rimosus, str Aureofaciens, str Platensis, str Gilvus… Cơ chế sinh tổng hợp tetracyclin phức tạp với chuyển hóa qua nhiều giai đoạn trung gian khác (cơ chế sinh tổng hợp clotetracyclin gồm có 72 phản ứng) q trình sinh tổng hợp có thể chia làm ba giai đoạn chính: Sinh tổng hợp chuỗi oligoketidamit mạch thẳng từ nguồn hydrocacbon Khép vòng chuỗi oligoketidamit tạo thành khung pretetramits (hoặc 6- metylpretetramit) Chuyển tiếp mạch pretetramit (hoặc 6-metylpretetramit) để tạo thành tetracyclin b Đặc điểm trình lên men Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin chủng vi sinh vật hiếu khí nên q trình ni cấy cần lắc khuấy trộn kèm theo sục khí liên tục với lưu lượng khoảng VVM ; cánh khuấy có đường kính phù hợp, thể tích nồi lên men phù hợp =>Việc đảm bảo thơng khí hợp lý liên tục suốt q trình lên men có ảnh hưởng lướn đến hiệu suất sinh kháng sinh, đặc biệt đến 12 – q trình có thể bị hủy hồn tồn dừng oxy phút pH tối ưu cho phản ứng 6,6 – 7,2 Mỗi bào tử nảy -4 chồi tạo thành hệ sợi kháng sinh nằm sinh khối xạ khuẩn nhiệt đọ ni cấy thích hợp 27 – 28 độ C Thời gian lên men thường 110 đến 140 Do kháng sinh sản phẩm bậc 2, cần thời gian để tổng hợp Nên thu vào cuối pha cân c Nhu cầu dinh dưỡng Nguồn hydrat carbon: chủ yếu bột ngô, bột mỳ, tinh bột khoai tây tinh bột ngơ Ngồi người ta cịn bổ sung vào môi trường nuôi cấy số loại đường glucose maltose Các chủng xạ khuẩn nhóm tetracyclin khơng có khả phân giải saccharose h Nguồn nito: mơi trường ni cấy cần có nguồn nito vơ hữu cao ngô, bột đậu tương, bột lạc Nguồn phospho: đối với trình sinh tổng hợp tetracyclin hàm lượng phosphor vơ hịa tan môi trường lên men (chủ yếu từ cao ngô) có ý nghĩa quan trọng đến hiệu suất tạo kháng sinh: • Thiếu phospho giống phát triền hiệu suất lên men thấp • Thừa phosphor giống phát triển nhanh hoạt lực kháng sinh giảm đáng kể tích tụ acid acetic aicd pyruvic môi trường => để tránh thừa phosphor người ta bổ sung CaCO3 để tạo thành phosphat canxi khơng tan • Ngồi cịn có tác dụng giảm nồng độ kháng sinh hòa tan để tránh độc tính kháng sinh đối với giống Nguồn kim loại vi lượng: chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin cần số kim loại Fe, Mn, Mg, Cu…và thường bổ sung dưới dạng muối sulfat (*) Nếu mơi trường có cao ngơ, bột đậu, bột lạc khơng cần bổ sung thân loại ngun liệu có sẵn muối kim loại (*) Cần ý đặc biệt đến hàm lượng sắt thừa sắt kết hợp với tetracyclin tạo phức chất khơng có hoạt tính kháng sinh d Nguyên tắc chiết xuất từ môi trường lên men Các kháng sinh nhóm tetracylin có tính chất lượng tính nên có thể dùng phương pháp sau để chiết tách sản phẩm khỏi dịch lên men: Chiết dung mơi hữu có chất mang: isooctanol kèm theo chất mang acid oxalic,dung môi hữu methyalkyl Chiết phương pháp kết tủa:dùng thuốc nhuộm acid arylsulfonic Chiết phương pháp trao đổi ion: nhựa trao đổi ion sulfocationit (*) Tùy theo loại kháng sinh cụ thể, độ tình khiết cần thiết sản phẩm mà người ta lựa chọn phương pháp thích hợp e Quy trình lên men Điều kiện trình lên men tạo tetracyclin chủng Str Aureofaciens gần giống với lên men tạo clotetracyclin Tuy nhiên điểm khác biệt quan trọng thành phần môi trường nuôi cấy Dựa vào thành phần môi trường cung cấp cho xạ khuẩn mà người ta có thể định hướng sản phẩm cuối trình lên men Str Aureofaciens điều kiện ni cấy bình thường tạo clotetracyclin, nuôi dưỡng điều kiện đặc biệt có chất ức chế q trình clo hóa xạ khuẩn tạo chủ yếu tetracyclin Để nâng cao hiệu suất sinh rổng hợp tetracyclin phải loại hết vết Clra khỏi mơi trường phịng thí nghiệm, để loại ion Cl- có thể dùng muối bạc, nhiên phương pháp không thực tế Hiện người ta dùng chất ức chế trình clo hóa brom, iod, thiocyanid… Tuy nhiên tăng hàm lượng bromid môi trường xạ khuẩn tổng hợp – bromtetracyclin chất ức chế sinh tổng hợp tetracyclin => Vì vậy, ngồi NaBr cịn thêm chất ức chế q trình clo hóa khác – mercaptobenzothiazol, – thiouracyl, dẫn xuất dithiocarbamic… Cơ chế tác dụng chất đến chưa rõ chúng khơng có rác dụng cạnh tranh với ion Clo, có thể có mặt nhóm sulfuhydryl –SH có tác dụng kích thích phản ứng oxy khử làm loại Clo khỏi phân tử kháng sinh f Quy trình chiết tetracyclin Tetracyclin có thể chiết xuất ba phương pháp Ở giới thiệu phương pháp chiết dung môi hữu cơ: Dịch lên men xong bơm vào thùng chứa, hạ nhiệt độ xuống 15 độ C thêm aicd oxalic hạ pH xuống 2,5 đến Thêm Na2CO3 khuấy pH = 3,5 Thêm K4Fe(CN)6 khuấy tiếp 15 phút để loại sắt lấy mẫu phân tích Ca++ Fe++: yêu cầu Ca++ pha sinh tổng hợp kháng sinh f Quy trình chiết xuất kháng sinh: Phương pháp trao đổi ion Bước 1: Tạo dịch lọc chứa kháng sinh: Dịch lên men để 15•C, loại sắt K4Fe(CN) 6, loại Ca++ acid oxalic Yêu cầu: Ca++