Bg thuc tap duoc lieu 2 2164

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VÕ TRƯỜNG TOẢN KHOA DƯỢC  Bài giảng thực tập DƯỢC LIỆU Đơn vị biên soạn: KHOA DƯỢC Hậu Giang – Năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BÀI GIẢNG MÔN HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC VÕ TRƯỜNG TOẢN Tên môn học: THỰC TẬP DƯỢC LIỆU Trình độ: Đại học Số tín chỉ: Giờ thực hành: 30 tiết Thông tin Giảng viên:  Tên Giảng viên: Phạm Duy Lân  Đơn vị: Trung Tâm Thực Hành Y Dược  Điện thoại : 01202166774  Email: phamduylan1911@gmail.com BÀI 1: DƯỢC LIỆU CHỨA TANIN Mục tiêu Sau thực hành Dược liệu chứa tannin, sinh viên phải: - Thực phản ứng định tính chung tannin dược liệu - Phân biệt dược hai loại tannin phản ứng hóa học - Định lượng tannin dược liệu phương pháp oxy hóa với KMnO4 I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Tannin (tannin, taninoid) hợp chất pholyphenol phức tạp, có nguồn gốc thực vật, có vị chat có tính thuộc da Dựa vào cấu trúc hóa học người ta xếp tannin vào hai nhóm chính: - Tannin thủy phân (tannin pyrogallic) - Tannin không thủy phân (tannin ngưng tụ, tannin pyrocatechic) Tannin dễ tan kiềm loãng, hỗn hợp cồn nước Tannin tan cồn, glycerin, propylene glyconl, acetone ethyl acetate Tannin không tan dung môi phân cực Tannin tạo tủa với dung dịch nước protein Đây tích chất quan trọng để định tính tannin Để phân biệt hai loại tannin pyrogallic pyrocatechic dựa vào phản ứng phản ứng ngưng tụ nhân thơm tannin pyrocatechic tạo màu sắc khác hai loại tannin với thuốc thử FeCl3, thuốc thử Styasny, nước Brom v.v… Có nhiều phương pháp định lượng tannin phương pháp chuẩn độ thể tích, phương pháp đo màu v.v… DĐVN III (2002, trang PL-141) quy định dụng phương pháp bột da để định lượng tannin dược liệu II THỰC NGHIỆM 1.Nguyên vật liệu thí nghiệm 1.1 Dụng cụ, hóa chất thuốc thử Hóa chất, thuốc thử Dung dịch gelatin muối 1%1 Thuốc thử Stiasny2 Dung dịch FeCl3 % Dung dịch chì acetate Dung dịch KMnO4 0,1N Chỉ thị màu sulfo indigo Nước Brom Dung dịch gelatin muối : Dung dịch gelatin 1% nước muối 10% Thuốc thử Stiasny: Dung dịch Formol- HCl đậm đặc (2:1), pha dùng Chỉ thị Sulfo indigo: Hòa tan 1g carmin indigo 25ml acid sulfuric đậm đặc (TT) Thêm 25 ml acid sulfuric đậm đặc nữa.Sau pha vào nước đến vừa đủ 1000ml 1.2 Dược liệu -Ngũ bội tử ( Galla chinensis) tổ sâu ký sinh Muối ( Rhus chinensis Mill.,Anacardiaceae) - Lá ổi ( Folium Psidii) ổi ( Psidium guajava L., Mytarceae) - Kim ngân hoa ( Flos Lonicerae) hoa kim ngân ( Lonicera japonica Thunb., Caprifoliaceae) - Lá bàng ( Folium Terminaliae catappae) bàng ( Terminalia catappa L., Combrataceae) 2.Định tính tannin 2.1 Chiết hợp chất tannin từ dược liệu Lấy khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình nón 100ml, thêm vào bình nón 40 ml nước đun sơi, tiếp tục đun bếp cách thủy sôi 10 phút, lắc đun Lọc nóng lấy dịch lọc Chiết tiếp bã dược liệu lần với 10ml nước, cần Dịch lọc thu dùng làm phản ứng định tính tannin 2.2 Định tính chung tannin dược liệu 2.2.1 Phản ứng với dung dịch protein Lấy vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, cho vào giọt thuốc thử gelatin muối Phản ứng dương tính có tủa trắng đục 2.2.2 Phản ứng với muối kim loại nặng: Cho vào ống nghiệm ống ml dịch chiết.Thêm vào thuốc thử: Ống : giọt TT FeCl3 1% Ống : ml thuốc thử chì acetat 1% Ống : giọt thuốc thử đồng acetat % Quan sát màu, mức độ tạo màu, tạo tủa dược liệu Nếu cần pha lỗng ( nhỏ vài giọt sản phẩm vào ống nghiệm chứa ml nước) để quan sát rõ 2.3 Định tính phân biệt hai loại tannin Cho vào ống nghiệm lớn ( 16x16 ) ống ml dịch chiết Thêm vào thuốc thử : Ống : giọt thuốc thử FeCl3 1% Ống : ml TT Stiasny Ống : giọt nước Brom Quan sát tạo màu, tạo tủa dung dịch để kết luận loại tannin Chú ý: Có thể pha lỗng vào nước để dễ quan sát Thuốc thử Tannin pyrogallic Tannin pyrocatechic - FeCl3 1% Xanh đen Xanh rêu - Stiasny + đun cách thủy Khơng tủa Tủa vón, đỏ gạch (10 phút) - Nước Brom Không tủa Tủa ngà 2.4 Xác định loại tannin dược liệu Lấy 5ml dịch chiết dược liệu chứa loại tannin (kết mục 2.3) vào ống nghiệm lớn (16x16), thêm thuốc thử stiasny, đun cách thủy 10 phút, lọc Dịch lọc tiếp tục với 1ml thuốc thử Stiasny khơng cịn tủa ngưng; cịn tủa tiếp tục lọc lấy dịch trong, tiến hành lặp lại khơng cịn tủa Lọc lấy dịch Trung hòa dịch lọc dung dịch NaOH 10% đến pH 5-6 tiếp tục thêm Natri acetate* (dung dịch đậm đặc hay tinh thể) pH trung tính kềm nhẹ chia vào ống nghiệm, ống 2ml Thêm vào ống thứ vài giọt thuốc thử Gelatin muối, Thêm vào ống thứ giọt thuốc thử FeCl3 Quan sát: ống thứ có tủa trắng đục, ống thứ có màu xanh đen dược liệu có tannin polygallic 2.5 Tìm catechin tự dược liệu Lấy 5ml dược liệu chứa tannin catechin (kết mục 2.3), thêm dung dịch Gelatin muối, lọc lấy dịch Dịch lọc tiếp tục thêm gelatin muối, tủa lọc tiếp dịch lọc khơng xuất thêm tủa với gelatin muối nữa, lọc lấy dịch Dịch lọc chia thành ống nghiệm, ống 2ml Ống thứ thêm giọt thuốc thử Stiasny, ống thứ thêm giọt thuốc thử FeCl3 Nếu ống thứ sau đun cách thủy 10 phút có tủa vón màu đỏ gạch ống thứ có màu xanh rêu dược liệu chứa catechin tự Định lượng tannin dược liệu 3.1 Ngun tắc Tannin bị KMnO4 oxy hóa mơi trường acid Điểm kết thúc định lượng xác định thị màu sulfo indigo Từ lượng KMnO4 tiêu thụ, tính lượng chất oxy hóa dược liệu theo tannin chuẩn 3.2 Tiến hành Cân xác 1g bột ổi (qua rây 0,5mm) cho vào bình nón 250ml Thêm 50ml nước sơi đun cách thủy 30 phút, lắc Gạn vào lọc dịch lọc qua vào becher 250ml ( tránh để mảnh dược liệu rơi lên bông) Tiếp tục chiết nhiều lần dịch lọc không phản ứng với thuốc thử sắt III cloric 1% (hoặc phèn sắt amoni) Làm nguội dịch chiết becher chuyển toàn dịch chiết (nhớ tráng becher) vào bình định mức 250ml thêm nước vừa đủ tới vạch Lấy 10ml dung dịch (pipet xác) cho vào bình nón 1000ml, thêm 250ml nước 10ml (buret) dung dịch sulfo indigo (TT) Định lượng dung dịch KMnO4 0,01N (Pha loãng 10 lần từ KMnO4 0,1N môn chuẩn bị sẵn) chuyển sang màu vàng 1ml dung dịch KMnO4 0,01N tương ứng với 0.0004157 gam tannin tinh khiết Song song định lượng mẫu trắng gồm 10ml dung dịch sulfo indigo 250ml nước Hàm lượng phần trăm tannin dược liệu (chưa trừ độ ẩm) tính theo cơng thức: T= (a  b).0,0004157.250.100 % 10.m a: số ml dung dịch KMnO4 0.1N dùng cho mẫu b: số ml dung dịch KMnO4 0.1N dùng cho mẫu trắng m: số gam bột dược liệu cân (Tham khảo từ DĐVN I tập I, trang 732) III GỢI Ý THẢO LUẬN Phản ứng quan trọng định tính để kết luận dược liệu có tannin hay khơng? Trên mẫu dược liệu, phương pháp định lượng tannin cho kết khác Giải thích sao? KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHUNG Các alkaloid (alkaloid) base hữu thường dễ tan dung môi hữu (ether, benzene, chloroform, acetone, methanol ethanol) Đa số alkaloid base thực tế không tan nước Một vài alkaloid có cấu trúc ammonium bậc IV tan nước tan dung môi hữu Một số alkaloid khơng có oxy tồn trang thái lỏng tan nước Một số alkaloid dạng lỏng bay lôi theo nước Một số alkaloid oxy dạng rắn thăng hoa áp suất thường Một số alkaloid có OH phenol tan phần dung dịch kiềm mạnh Dưới dạng muối, alkaloid thường tan nước, cồn (ethanol, methanol) hay hỗ hợp cồn nước; chúng không tan tan dung môi hữu phân cực (ether, benzene, chloroform) TÍNH CHẤT CHUNG CỦA ALKALOID Alkaloid thường base yếu, tan dung môi hữu cơ, không tan nước Khi cho alkaloid tác dụng với acid thu alkaloid dạng muối Các muối alkaloid thường dễ tan nước Các muối dễ bị chất kiềm vô (NH4OH, NaOH) chí muối khác (Na2CO3, NaHCO3) đẩy khỏi muối cho lại alkaloid ban đầu Alkaloid phản ứng với thuốc thử chung (thuốc thử tạo tủa) tạo thành muối khó tan (dạng kết tinh hay vơ định hình) ứng dụng định tính alkaloid Một số alkaloid hay nhóm alkaloid cho màu sắc đặc trưng với số thuốc thử gọi thuốc thử đặc hiệu alkaloid (thuốc thử tạo màu) ứng dụng định tính làm thuốc thử phát sắc ký KIỂM ĐỊNH CÁC ALKALOID Trong kiểm định dược liệu chứa alkaloid, tiêu kiểm định chung cho dược liệu, người ta phải tiến hành định tính định lượng alkalioid dược liệu Có thể định tính alkaloid trưc tiếp mô thực vật hay dịch chiết dược liệu Để định tính alkaloid vi phẩu thực vật, người ta quan sát tủa alkaloid với thuốc thử Bouchardat kính hiển vi Đơi định tính trực tiếp alkaloid mặt cắt dược liệu thuốc thử đặc hiệu Để định tính alkaloid dịch chiết dược liệu, thuốc thử chung, thuốc thử tạo màu sắc ký lớp mỏng phương pháp thường dùng Có nhiều phương pháp định lượng alkaloid dược liệu phương pháp cân, phương pháp thể tích, phương pháp quang phổ Tùy trường hợp mà lựa chọn phương pháp thích hợp Cũng kết hợp phương pháp phân tách (thường phương pháp sắc ký) với việc định lượng (thường phương pháp quang phổ) để định lượng riêng hay vài alkaloid hỗn hợp alkaloid tồn phần Kết biểu thị bằng:  % alkaloid toàn phần có dược liệu (phương pháp trực tiếp)  % alkaloid tồn phần có dược liệu quy theo alkaloid (PP cân gián tiếp, chuẩn độ acid-base, quang phổ)  % alkaloid có dược liệu (PP kết hợp sắc ký – quang phổ) CHIẾT XUẤT CÁC ALKALOID Trong cây, alkaloid thường tồn dạng muối hòa tan với acid hữu vô hay dạng kết hợp với tannin Người ta chiết alkaloid khỏi nguyên liệu thực vật nhiều cách nhìn chung quy cách là:  Chiết alkaloid khỏi dược liệu dạng alkaloid base dung môi hữu  Chiết alkaloid khỏi dược liệu dạng muối dung môi phân cực (nước, cồn, hỗ hợp cồn nước acid hóa) Với vài alkaloid đặc biệt, người ta chiết xuất bằng:  Phương pháp cất kéo lôi cuốc theo nước (chiết xuất nicotin từ Thuốc lá)  Phương pháp thăng hoa (chiết xuất cafein từ Trà) Dựa vào tính tan khác dạng base dạng muối alkaloid dung mơi, người ta phân loại phần tạp chất khỏi dịch chiết trước định tính, định lượng hay phân lập alkaloid tinh khiết Các quy trình chiết thường sử dụng chiết xuất alkaloid từ nguyên liệu thực vật dùng cho định tính alkaloid Ghi chú: Thể tích dung mơi chiết, thời gian chiết phương pháp thay đổi tùy thuộc vào dược liệu phương tiện sử dụng 3.1 Chiết dung mơi hữu có mơi trường kiềm (phương pháp 1) Bột dược liệu (5g) - Kiềm hóa băng NH4OH đậm đặc vừa đủ ẩm) Chiết 20-30 ml CHCl3 Đun nóng nhẹ/BM 10 phút, lọc chiết Sohxlet Dịch chiết CHCl3 H2SO4 2% (5ml x lần) Dịch chiết nước acid NH4OH đậm đặc pH 10 Định tính thuốc thử chung Định tính thuốc thử đặc hiệu - Chiết CHCl3 (10ml x 2-3 lần) Dịch chiết CHCl3 Định tính phương pháp sắc kí Bốc đến cắn khơ Cắn alkaloid base Định tính thuốc thử đặc hiệu với lần 20 ml dung môi dịch chiết khơng cịn phản ứng alkaloid - Gộp chung dịch chiết vào bình lắng gạn 250 ml, lắc với dung dịch acid sulfuric 5% (20,10,10ml ) dịch acid âm tính với thuốc thử ValseMayer - Gộp dịch chiết acid vào bình lắng gạn 250 ml, kiềm hóa NaOH 10% đến pH 10 chiets alkaloid chloroform (20, 10, 10 ml ) hết alkaloid - Gộp dịch CHCl3 vào bình lắng gạn, rửa vói nước cất ( lần x ml); lấy lớp chloroform cho vào erlen 250 miệng rộng bốc bếp cách thủy (trong tủ hút) hết chloroform Nhỏ vài giọt dịch chiết lam kính, hơ lam kính bếp cách thủy khibay hết dung môi Nhỏ lên n i có cắn dịch chiết giọt acid sulfuric 2%, dung đũa thủy tinh khuấy nhejcho tan cắn (nếu có) Them vào dịch acid giọt thuốc thử Valse-Mayer, dung dịch phải trong, khơng có tủa trắng đục Nếu dịch thử nước acid nhỏ thảng thuốc thử Valse-Mayer lên dịch chiết Trong thực tập chiết lần (80, 50, 50ml chloroform) Hòa tan cắn erlen với 15ml cồn 96% trung tính cách đun nhẹ bếp cách thủy Pha loãng với 15ml nước cất, thêm giọt methyl đỏ (CT) giọt dung dịch methylen xanh 0,15% Định lượng alkaloid toàn phần dung dịch dung dịch HCl 0,1N có màu tím tro 1ml dung dịch HCl 0,1N tươn ứng với 0,03094 g alkaloid toàn phần theo hỗn hợp phân tử quinine cinchonin tính theo công thức: A= nx0,03094x100 % ax(1  h) n: số ml dung dịch HCl 0,1N dùng cho mẫu thử a: khối lượng dược liệu đem định lượng (gam) h: độ ẩm mẫu định lượng 21 Định lượng alkaloid cà độc dược Cân xác khoảng 5g bột hạt cà độc dược vào bình nón nút mài 100ml, kiềm hóa với lượng vừa đủ NH4OH đđ, đậy kín, để yên 15 phút thêm 20ml hỗn hợp Et2O-CHCl3 (3:1) Đậy nút, lắc nhẹ 15 phút đẻ yên (thỉnh thoảng lắc đều) Gạn lọc dịch chiết vào bình lắng có chứa sẵn 20ml nước 10ml H 2SO4 5% Bã dược liệu chiết tiếp vào hỗn hợp Et2O-CHCl3 (3:1) (2 lần x 20ml) dịch chiết không phản ứng với alkaloid (thử thuốc thử ValseMayer phần định lượng Mã Tiền) Gộp chung dịch chiết vào bình lắng gạn nói Lắc tách lấy lớp acid (lớp dưới) Lớp dung mơi (lớp trên) cịn lại bình lắng gạn lắc tiếp với 10ml H2SO4 5%, thực vài lần hết alkaloid (thử trên) Gộp dịch chiết acid vào bình lắng gạn kiềm hóa NH4OH đđ đến pH = 10 chiết CHCl3 (20, 20, 10ml…) chiết hết alkaloid Gộp dịch chiết CHCl3 vào becher khô, làm khan lượng Na2SO4 khan, gạn lấy lớp CHCl3 (trong suốt) cho vào bình nón khơ 100ml Rửa lớp Na2SO4 CHCl3 (3 lần x 3ml) gộp chung dịch rửa vào dịch CHCl3 bình nón Bốc dung môi bếp cách thủy (trong tủ hốt) đến cắn khơ Hịa tan cắn 10ml H2SO4 0,02N (chính xác) thêm giọt thị methyl đỏ Chuẩn độ H2SO4 thừa dung dịch NaOH 0,02N 1ml H2SO4 0,02N tương đương với: 0,005787 g hyoscyamin (C17H23NO3 = 289,35) hay 0,006067 g scopolamin (C17H21NO4 = 303,35) Định lượng nuciferin tâm sen (hoặc sen) Cân xác khoảng g bột dược liệu sấy khô, thấm ẩm amoniac đậm đặc (TT), để giờ, sau cho vào túi làm giấy lọc, đặt vào bình Soxhlet, chiết ethanol 96% (TT) kiệt alcaloid Cất thu hồi dung mơi, hịa tan cắn dung dịch acid hydrocloric 5% (TT) (5 lần, lần ml) Lọc, rửa dịch lọc acid ether dầu hỏa (TT) lần, lần 10 ml Kiềm hóa dịch chiết acid amoniac đậm đặc (TT) đến pH 10, sau lắc với cloroform (TT) lần, lần 10 ml Gộp dịch chiết 22 cloroform, rửa dịch cloroform nước cất đến pH trung tính, bốc dung mơi tới khơ Hịa tan cắn với lượng xác 10 ml acid hydrocloric 0,1 N (CĐ) Thêm ml nước cất giọt methyl đỏ (TT) Chuẩn độ dung dịch acid hydrocloric 0,1 N (CĐ) thừa dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ) Hàm lượng alcaloid toàn phần (X) Sen tính phần trăm theo cơng thức: X%= (10 – n ).2,95/a n: Số ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ) dùng a: Khối lượng bột dược liệu đem định lượng trừ độ ẩm Dược liệu phải chứa 0,80% alcaloid tồn phần tính theo nuciferin (C19H21O2N) III GỢI Ý THẢO LUẬN, CÂU HỎI Tại người ta thường định lượng alkaloid phương pháp thừa trừ Ý nghĩa việc sử dụng hỗn hợp [H2SO4 5% + HNO3 50% NaNO2] định lượng strychnin hạt Mã tiền? Tại sau giai đoạn trên, người ta lại dùng NaOH 10% mà khơng dùng NH4OH đậm đặc? Lập cơng thức tính hàm lượng % strychnin (M = 334,40) hạt Mã tiền Với n= số ml NaOH 0,1N sử dụng, hệ số hiệu chỉnh phép định lượng k = 1,02 độ ẩm dược liệu h (%) Lập cơng thức tính hàm lượng % alkaloid tồn phần mẫu bột hạt Cà độc dược (tính theo hyoscyamin: M = 289,35) Cho biết độ ẩm mẫu h (%) 23 KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA TINH DẦU CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHUNG Tính chất chung tinh dầu Tinh dầu hỗn hợp chất bay phức tạp, có cấu tạo chủ yếu hydrocacbon mono sesquiterpen, thường có mùi thơm, thu chủ yếu từ thực vật, cất kéo nước Đa số tinh dầu khơng có màu hay màu vàng nhạt, dạng lỏng nhiệt độ thường, tỉ trọng < (một vài tinh dầu có màu đặc biệt, số có tỉ trọng > 1) Khi bị oxi hóa, tinh dầu bị hóa nhựa làm thay đổi tính chất lý hóa tinh dầu Các tinh dầu dễ tan dung môi phân cực ether dầu hỏa, n-hexan, benzene, chloroform, ether; tan dung mơi phân cực aceton, cồn; gần không tan nước Tinh dầu thường có hay vài thành phần có hàm lượng trội hẳn thành phần lại, gọi cấu tử tinh dầu Ở trạng thái tinh khiết, cấu tử tinh dầu chất lỏng hay chất rắn nhiệt độ thường Có thể lấy tinh dầu khỏi dược liệu chưng cất lôi theo nước, ép, chiết dung mội hay hấp phụ, phương pháp chưng cất thông dụng Kiểm định tinh dầu Trong kiểm định tinh dầu, người ta thường thực nội dung sau: cảm quan: màu sắc, mùi, vị thể chất tinh dầu xác định số vật lý tinh dầu: số khúc xạ, suất quay cực, tỷ trọng, độ hòa tan cồn độ cồn khác (70%, 95%,…) … Các số tinh dầu thường nằm giới hạn cụ thể Xác định số góp phần vào việc kiểm nghiệm mức độ tinh khiết tinh dầu Thử tinh khiết: nhằm phát tạp chất có tinh dầu Tạp chất chất vốn khơng có (hay có giới hạn đó) thành phần tinh dầu Sự diện giới hạn cho phép tạp chất tinh dầu q trình chế tạo, bảo quản hay cố ý giả mạo Các tạp chất thường tìm kiểm nghiệm tinh dầu nước, cồn chất béo Các tạp chất cịn có dầu hỏa, tinh dầu rẻ tiền… 24 hay sản phẩm oxy hóa tinh dầu q trình bảo quản Các tạp chất nhận biết phương pháp vật lý hay hóa học Định tính, định lượng thành phần đặc trưng tinh dầu: dựa vào tính chất lý hóa đặc trưng chất, nhóm chất để xác định có mặt chất (nhóm chất) tinh dầu, gián tiếp xác nhận tinh dầu Tương tự, xác định định lượng thành phần để đánh giá chất lượng tinh dầu 25 BÀI 4: KIỂM NGHIỆM TINH DẦU SẢ Mục tiêu Sau thực hành “Kiểm nghiệm tinh dầu sả”, sinh viên phải: - Kiểm nghiệm thành phần pha trộn tinh dầu để phát giả mạo - Định tính định lượng citral tinh dầu sả I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Đại cương tinh dầu sả Chanh citral Các loài sả chia thành nhóm là: sả chanh cho citral, sả hoa hồng sả cho citronellal Tinh dầu sả chanh tinh dầu thu cách cất lôi nước số loài sả [Cymbopogon citratus Stapf, C flexuosus Stapf hay C pendulus (Ness ex Steud.) Wats, Poaceae] Tinh dầu sả chanh chất lỏng suốt, khơng màu hay màu vàng nhạt, có mùi thơm đặc trưng Các số vật lý tinh dầu sả chanh: - số khúc xạ 20oC (n20D): 1,4910 - suất quay cực 20oC (αD): -0,62o - tỷ trọng 20oC (d20): 0,8986 Thành phần chủ yếu tinh dầu sả chanh citral Citral hỗn hợp gồm đồng phân citral a citral b Citral chất lỏng khơng màu, có mùi đặc biệt Kiểm định tinh dầu sả Việc kiểm định tinh dầu sả giống kiểm định tinh dầu khác, bao gồm: - cảm quan - xác định số vật lý - thử tinh khiết - định tính, định lượng thành phần tinh dầu (citral) 2.1 Tìm tạp chất Các tạp chất thường tìm kiểm nghiệm tinh dầu nước, cồn chất béo 26  Nước: thường lẫn vào phương pháp chiết (cất kéo theo nước), phát cách dựa vào tính chảy ướt Na2SO4 khan chuyển sang màu xanh CuSO4 khan gặp nước  Alcol: phát dựa vào tính tan alcol nước khả hịa tan fuschin alcol  Dầu mỡ: dựa vào tính khơng bay khơng hịa tan alcol dầu mỡ 2.2 Định tính, Định lượng citral Citral ahdehyd khác tinh dầu xả phản ứng với NaHSO3 cho hợp chất cộng bisulfit; với hydroxylamine cho oxim; với semicarbazit, thiosemicarbazit hay phenylhydrazin cho semicarbazon, thiosemicarbazon hay phennylhydrazon chất kết tinh có điểm chảy xác định, dung để định tính Để định lượng citral aldehyd khác tinh dầu, người ta thường áp dụng phương pháp Lagneau Nguyên tắc: Citral aldehyd khác phản ứng với hydroxylamine hydroclorid cho aldoxim HCl Acid hydroclorid giải phóng định lượng dung dịch kiềm Từ lượng kiềm sử dụng suy lượng hydroxylamine hydroclorid tham gia phản ứng từ tính lượng aldhyd tồn phần có tinh dầu II THỰC HÀNH Nguyên vật liệu thí nghiệm 1.1 Hóa chất thuốc thử - Na2SO4 khan, CuSO4 khan, cồn 96% - Dung dịch NHSO3 bão hòa (mới pha) - Dung dịch hydroxylamine HCl 0,5N - Dung dịch 2,4-DNPH HCl - Hệ dung môi: ( S1) = benzene khan (S2) = benzene-EtOAc (9:1) - Iod ( để phát sắc ký ) - Dung dịch methyl da cam 2% 27 - Dung dịch KOH 0,5N nước - Thuốc thử vanillin-sulfuric 1.2 Dược liệu thực tập Tinh dầu Sả, tinh dầu tràm Nội dung thực tập 2.1 Kiểm nghiệm tạp chất 2.1.1 Tìm nước Cho vào ống nghiệm thật khô ml tinh dầu, them tinh thể Na2SO4 khan, lắc kỹ Nếu thấy Na2SO4 chảy ướt tinh dầu có nước Có thể dung CuSO4 khan thay cho Na2SO4 Nếu tinh dầu có nước làm CuSO4 chuyển từ màu lam nhạt sang màu xanh dương đậm CuSO4.5H2O 2.1.2 Tìm chất béo + Nhỏ giọt tinh dầu lên miếng giấy mỏng Hơ nhẹ bếp điện cho bay hết kết tinh dầu Nếu tờ giấy lại vết mờ có dầu mỡ + Cho vào ống nghiệm ml tinh dầu ml cồn 95%, lắc Tinh dầu tan vào cồn, chất béo không tan cồn bị đẩy dạng giọt lắng xuống hay bám thành ống nghiệm Nếu lượng chất béo thấy dung dịch bị đục 2.1.3 Tìm alcol + Cho vào ống nghiệm lớn, khô 1ml tinh dầu Nút miệng ống nghiệm (không chặt) miếng bơng có gói vài tinh thể fuschin Hơ nhẹ ống nghiệm đèn cồn cho hỗn hợp bốc (không đun sôi ống nghiệm) Nếu nút bơng nhuộm đỏ tinh dầu có alcol + Dùng bình cassia có dung tích 50 ml, thể tích cổ khắc vạch 1,5 ml Cho vào bình 1,5 ml tinh dầu cần thử 30 ml nước, lắc kỹ Để yên 30 phút Tiếp tục thêm nước vào bình để đưa mức lớp tinh dầu nằm vạch số khoảng có khắc vạch cổ bình Đọc thể tích tinh dầu cịn lại Nếu thể tích tinh dầu nhỏ 1,5ml tinh dầu có alcol 2.2 Định tính định lượng aldehyd tinh dầu 2.2.1 Định tính 28 a) Phản ứng: Cho vào ống nghiệm ml tinh dầu, ml dung dịch NaHSO3 bão hòa (mới pha) Đặt ống nghiệm vào hỗn hợp sinh hàn khuấy kỹ vài phút hợp chất cộng tạo chất giống kem b) Sắc ký lới mỏng: Bản sắc ký: Dùng silica gel G tự tráng hay mỏng silica gel F254 tráng sẵn - Bản tự tráng: kích thước x 15 cm, chất hấp phụ silica gel G - Sau tráng lên kính, để n cho mặt, hoạt hóa 110 – 120 độ C giây Lấy để nguội bình hút ẩm - Bản tráng sẵn silica gel F254 (Merck), kích thước 2,5x10 cm (khơng cần hoạt hóa) Dung mơi triển khai: (S1) = benzene hay (S2) = benzene- ethyl acetate (9:1) Mẫu thử: Tinh dầu sả, tinh dầu tràm, cineol (đều pha loãng 1/5 chloroform) Thuốc thử phát hiện: (1) Thuốc thẻ Vanillin-sulfuric Phun (trong tủ hốt!) nhúng nhanh thuốc thử, sấy 110oC 2-3 phút Sẽ xuất cấc vết có màu từ xanh đến đỏ tím (2) Dung dịch 2,4-DNPH HCl Các anhehyd cho vết có màu vàng đến da cam Chú ý: Sau triển khai, cần phát ngay, tránh tinh dầu bay Báo cáo kết quả: Vẽ lại sắc kí đồ tinh dầu SẢ sau phun thuốc thử VS, ghi nhận màu sắc, tính Rf vết thu 2.2.2 Định lượng andehyd toàn phần phương pháp Lagneau Tiến hành: Cân xác khoảng 1gam tinh dầu Sả bình nón 100ml Thêm 10 ml cồn 96% 10ml (chính xác) hydroxylamine hydrochloric 0,5N giọt methyl da cam 2% Đậy nắp lắc phút Định lượng dung dịch KOH 0,5N đến chuyển thành màu vàng bền vững 15 phút Tiến hành song song với mẫu trắng Kết tính theo cơng thức sau: 29 X= ( n  n ' ) x ,6 % P Trong đó: n: số ml dung dịch KOH 0,5N cảu mẫu thử n’: số ml dung dịch KOH 0,5N cảu mẫu trắng P: khối lượng tinh dầu Sả X: hàm lượng (%) aldehyd tồn phần tính theo citral III GỢI Ý THẢO LUẬN, CÂU HỎI Nêu nguyên tắc phát nước, dầu mỡ, alcol Trong định lượng, thay thị methyl da cam phenolphthalein khơng? Giải thích? 30 KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA CHẤT BÉO CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHUNG TÍNH CHẤT CHUNG CỦA CHẤT BÉO Chất béo sản phẩm tự nhiên, gặp động thực vật, có thành phần cấu tạo chung ester acid béo với alcol (đôi amid với amino alcol) Chất béo phổ biến ester acid béo với glycerin (glycerid hay acyl glycerol) Chất béo dễ tan dung môi hữu phân cực yếu hay trung bình ether dầu hỏa, n-hexan, benzene, toluene, xylem, chloroform, ether,… tan dung mơi hữu phân cực mạnh alcol; không tan nước Có thể lấy dầu béo khỏi nguyên liệu cách ép (ở nhiệt độ thường hay nhiệt độ cao), phương pháp chiết dung môi hay phương pháp nhiệt (thắng, rán mỡ) Phương pháp ép thông dụng điều chế dầu béo từ nguyên liệu thực vật Các chất béo có tỷ trọng