Bg thuc tap duoc lieu 1 2003

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VÕ TRƯỜNG TOẢN KHOA DƯỢC  Bài giảng thực tập DƯỢC LIỆU Đơn vị biên soạn: TT TH Y DƯỢC Hậu Giang – Năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BÀI GIẢNG MÔN HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC VÕ TRƯỜNG Tên môn học: THỰC TẬP DƯỢC LIỆU Trình độ: Đại học TOẢN Số tín chỉ: Giờ lý thuyết: Giờ thực hành: 30 tiết Thông tin Giảng viên:  Tên Giảng viên: Phạm Duy Lân  Đơn vị: Trung Tâm Thực Hành Y Dược  Điện thoại : 01202166774  Email: phamduylan1911@gmail.com BÀI 1: NHẬN THỨC BỘT DƯỢC LIỆU BẰNG KÍNH HIỂN VI Mục tiêu Sau thực hành “Nhận thức bột dược liệu kính hiển vi”, sinh viên phải: - Thực tiêu bột dược liệu đạt yêu cầu, quan sát bột dược liệu kính hiển vi - Tìm vẽ phần tử đặc trưng bột dược liệu, xác định bột dược liệu, độ tinh khiết giả mạo có liệu học I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Mỗi dược liệu có đặc điểm mơ học đặc trưng, chúng thể phần qua đặc điểm bột dược liệu Những đặc điểm dùng để phân biệt dược liệu với dược liệu khác, để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm Khảo sát bột dược liệu kính hiển vi tìm đặc điểm vi học đặc trưng bột dược liệu, giúp cho việc định danh, xác định độ tinh khiết dược liệu, phân biệt với dược liệu dễ bị nhầm lẫn phát giả mạo có - Bột thường có màu xanh lục tới nâu Các cấu tử thường thấy là: biểu bì mang khí khỗng, lơng che chở, lơng tiết, tinh thể calci oxalat, mạch gỗ v.v - Bột vỏ thân, vỏ rễ thường có màu vàng nâu tới nâu Các cấu tử thường thấy mảnh bần, mô mềm, loại sợi (vách dày hay mỏng, khoang rộng hay hẹp), tinh thể calci oxalat hay calci carbonat (với hình dạng khác nhau), mơ cứng Mơ mềm chứa tinh bột, ống nhựa mủ gặp số dược liệu - Dược liệu cành hay tồn rễ ngồi đặc điểm vỏ cịn thấy loại mạch gỗ mơ gỗ - Các loại rễ củ, thân ngầm phình thành củ cần ý tới đặc điểm cấu tao hạt tinh bột (hình dạng, kích thước, vân, tễ …) - Bột hoa, quả, hạt có màu sắc thay đổi tùy theo dược liệu - Các dược liệu hoa cần ý tới cấu tạo hình dạng hạt phấn, biểu bì loại lơng che chở, lông tiết bao hoa - Các dược liệu hạt cần ý biểu bì, mơ chứa chất dự trữ (carbohydrat hay dầu béo), phôi Khi khảo sát vi học dược liệu mới, để xác định cấu tử có liệu thuộc phận nào, loại mô thường cần kết hợp so sánh với việc khảo sát riêng rẽ phận dược liệu Ví dụ, cần xác định cấu tử bột dược liệu biểu bì cánh hoa phải so sánh với mảnh biểu bì quan sát bột từ cánh hoa tách riêng Cách soi, làm sáng nhuộm màu tiêu Trong nhiều trường hợp, dùng trực tiếp bột dược liệu chưa xử lý để quan sát thành phần bột Tuy nhiên có trường hợp bột cần xử lý để tiêu sáng, dễ quan sát Soi thường Là phương pháp thường dùng Bột dược liệu phân tán nước cất Đối với tinh bột dược liệu có nhiều tinh bột (như hạt, củ - bột thường có màu trắng ngà), để quan sát cấu trúc hạt tinh bột giảm bớt ánh sáng Nếu khơng thấy rõ vân tễ, thêm giọt dung dịch KOH 5% mép lamelle quan sát ngay, dung dịch KOH khuếch tán vào bột làm cho vân tễ hạt tinh bột rõ Phương pháp làm sáng Phương pháp thực cần tìm phần tử bột bì che lấp soi thường Có thể chọn cách sau : - Lấy bột đun sơi vài phút dung dịch NaOH 5% dung dịch KOH 5%, để nguội Soi kiềm rửa nước sôi dung dịch glycerin - Ngâm bột nước Javel 50%, khuấy Thay dung dịch đến bột màu, rửa nhiều lần nước cất - Dược liệu có nhiều tinh bột (hạt, củ) làm sáng bột sau: Lấy bột đun nhẹ dung dịch cloral hydrat 50% vài phút Soi dung dịch cloral hydrat Đối với bột khơng thân nước, dùng hỗn hợp cloral hydrat với glycerin tỉ lệ 1:2 ngâm 15 phút đun sơi - Dược liệu có nhiều chất béo (quả hạt) loại chất béo làm sáng sau: Lấy bột đun sơi acid nitric lỗng phút Lọc, rửa cắn với nước sơi Đun sôi cắn phút dung dịch kiềm Lọc rửa cắn với nước sôi Soi glycerin Phương pháp nhuộm Để phân biêt màng tế bào cellulose hav tẩm lignin (hóa gỗ), bột nhuộm kép dung dịch carmin 1% lục iod 0,1% (hoặc thuốc nhuộm tương tự) Sau giai đoạn, ly tâm để lấy tất phần tử bột Để nhuộm màu hạt tinh bột, đặt mép lamelle giọt dung dịch iod 1% (TT) (dung dịch Lugol) Dung dịch iod thấm vào làm hạt tinh bột nhuộm màu xanh tím Để phát giọt dầu béo, tinh dầu hay chất nhựa, nhỏ vài giọt Sudan III lên bột, đế yên vài phút Đậy lamelle quan sát kính hiển vi: tinh đầu, chất béo, chất nhựa cho màu đỏ cam tới đỏ II THỰC HÀNH Nguyên vật liệu thí nghiệm 1.1 Hoá chất thuốc thử - Nước cất, glycerin 30%, dung dịch NaOH 5% (hay dd KOH 5%), dung dịch lavel 50%, dung dịch cloral hydrat 50%, dung địch carmin %, dung dịch lục iod 0,1% 1.2 Dược liệu - Trúc đào (Folium Nerii) Trúc đào (.Nerium oleander L., Apocynaceae) - Hòe (Flos Styphnolobii japonici) nụ hoa cùa Hòe (Styphnolobium japonicum (L.) Schott = Sophora japonica L., Fabaceae) - Cam thảo (Radix Glycyrrhizae) rễ Cam thảo bắc (Glycyrrhiza uralensis Fisch ex DC., Fabaceae) - Ngũ gia bì chân chim (Cortex Schefflerae heptaphyllae) vỏ thân Ngũ gia bì chân chim (Schefflera heptaphylla (L.) Frodin, Araliaceae) - Đại hoàng (Rhizoma Rhei) thân rễ Đại hoàng (Rheum officinalis Baill., Polygonaceae) - Muồng trâu (Folium Cassiạe alatae) Muồng trâu (Senna alata (L.) Roxb = Cassia alata L-, Fabaceae) - Nhàu (Radix Morindae citrifoliae) rễ Nhàu (Morinda citrifolia L., Rubiaceae) - Ba dót (Folium Eupatorii) Ba dót (Eupatorium Jriplinerve Vahl., Asteraceae) - Ngũ bội tử (Galla Chinensis) tổ sâu ký sinh Muối (Rhus chinensis Mill., Anacardiaceae) Các dược liệu xay mịn, rây để vào lọ riêng biệt có dán nhãn Mỗi bột dược liệu có dụng cụ lấy bột riêng Phương pháp tiến hành Ghi nhận đặc điểm cảm quan (màu sắc, mùi, vị, thể chất) bột Lấy lượng bột dược liệu khoảng đầu tăm cho lên phiến kính (lame), nhỏ 1-2 giọt chất lỏng để soi (thường nước), khuấy kỹ Đậy lamelle cách đặt nghiêng cạnh lamelle lên lame hạ dần đầu lamelle lamelle nằm ngang mặt lame Dùng ngón tay nhẹ lamelle cho bột phân tán Dùng giấy lọc thấm nhanh nước thừa mép lamelle Soi kính hiển vi, với vật kính 10x, sau với vật kính 40x Mỗi dược liệu có đặc điểm bột khác (Nếu có thể, nên xem vi phẫu trước đối chiếu đặc điểm vi phẫu để tìm đặc điểm bột) Ghi nhận vẽ đặc điểm quan sát bột, ý thành phần đặc trưng Mỗi bột nên soi - mẫu 6 Trúc đào Lông che chở đơn bào Mảnh buồng ẩn khỗng Mảnh mơ mềm Mạch vạch, vịng Sợi có kèm tinh thể Calci oxalate hình khối Tinh thể calci oxalate hình cầu gai Cam thảo Mảnh bần Mảnh mô mềm chứa hạt tinh bột Sợi kèm tinh thể Calci oxalate hình khối Tinh bột Mạch mạng Mạch chấm đồng tiền Tinh thể calci oxalate hình khối rời Hoa hịe Lơng che chở đơn bào Lơng che chở đa bào hạt phấn có lỗ nảy mầm Mảnh đài mang lông che chở Mảnh cánh hoa mang lơng che chở lỗ khí Mạch vạch, mạch xoắn Ngũ gia bì chân chim Sợi có vách dày có khoang trao đổi Các loại tế bào mô cứng Mảnh bần Mảnh mô mềm Hạt tinh bột Tinh thể calci oxalate hình khối Rễ nhàu Mảnh bần Mảnh mơ mềm Bó sợi Tinh bột Tinh thể calci oxalate hình kim Mạch điểm III - CÂU HỎI THẢO LUẬN Khi soi bột dược liệu, khơng tìm thấy cấu tử quan trọng dược liệu bạn có suy nghĩ gì? (lấy ví dụ từ dược liệu trên) - Để tiêu bột dược liệu có đầy đủ phần tử tài liệu mơ tả cần phải chuẩn bị mẫu bột soi nào? BÀI 2: KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA CARBOHYDRAT Mục tiêu Sau thực hành “Dược liệu chứa carbohydrat”, sinh viên phải: - Phân biệt số loại tinh bột thường gặp kính hiển vi - Định tính tinh bột sản phẩm thủy phân phần tinh bột - Xác định số nở dược liệu có chứa gơm, pectin hay chất nhầy I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Các polysaccharid tự nhiên chia thành nhóm lớn: - Homopolysaccharid: polysaccharid tương đối cấu tạo gồm loại monosaccharid Homopolysaccharid quan trọng ngành dược tinh bột - Heteropolysaccharid: polysaccharid có cấu tạo phức tạp không loại monosaccharid Theo truyền thống, heteropolysaccharid thường xếp vào nhóm: gơm, chất nhày, pectin, thạch, alginat.v.v… Trong tự nhiên, tinh bột tồn dạng kết tinh tạo thành hạt tinh bột tế bào thực vật Tinh bột loài thực vật khác phân biệt hình dạng kích thước chúng kính hiển vi Quan sát tinh bột kính hiển vi kiểm tra độ tinh bột phát giả mạo Tinh bột sản phẩm thối giáng phần tinh bột định tính dung dịch Iod 1% (TT) (dung dịch Lugol) Các dược liệu chứa gơm, pectin, chất nhầy đánh giá số nở dựa vào tính chất hút nước trương nở hợp chất 1.Hình dáng kích thước hạt tinh bột Hình dạng Loại tinh bột Đặc tính Nhỏ (2-12μm) hạt đơn, hình đa giác nhiều cạnh, Tinh bột gạo (Amylum Oryzae) Hình Đa giác Tinh bột Bắp (Amylum Maydis) Hình chỏm cầu Đĩa hạt tế bào chấm nhỏ, vân tăng trưởng khơng rõ Hình dạng đa giác, hình trịn, kích thước 25 μm Tễ hình chấm, hình sao, phân nhánh, khơng rõ Tinh bột Sắn dây Hình chõm cầu, hay hình chng nhỏ (2 - 10 μm) (Amylum Puerariae) Tễ điểm Tinh bột khoai tây (Amylum Manihot Tinh bột Lúa mì Hình Thường gặp hạt kép, có kết thành đám nhiều (Amylum Tritici) Tinh bột Ý dĩ Hình chõm cầu, hay hình chng nhỏ, kích thước từ 530μm Tễ hình sao, rõ Hình dĩa, hình lê, đơi có rìa sứt mẻ, hạt to (3040 μm), hạt nhỏ (2-8μm), có hạt có kích thước trung bình, tễ khơng rõ Tễ phân nhánh hình sao, hạt có kích thước trung bình (Amylum Coicis) Tinh bột Khoai tây (Amylum Solani Hình trứng Kích thước trung bình 50μm, có hạt lên đến 80100μm Thỉnh thoảng có hạt kép, đến Tễ điểm, có đầu hẹp, vân rõ Tinh bột Hoàng tinh Tễ vạch ngắn nằm vuông gốc với với trục dài (Amylum hạt tinh bột Dioscoreae) Hạt tinh bột có lẹm Tinh bột Đậu xanh Kích thước 50 μm (Amylum Phaseoli) Tễ dài, phân nhánh hình xương cá Tinh bột Hồi sơn Hạt tinh bột hình chng, dài 20-80 μm, rộng 20 μm (Amylum Tễ hài, không phân nhánh, nhiều hạt không thấy tễ Dioscoreae) 10 S1 = benzen - ethyl acetat (10:1) S2 = benzen – aceton (10:1) - Bản mỏng Silicagel GF254 tráng sẵn 1.2 Dược liệu - Ba dót (Folium Eupatorii), ba dót (Eupatorium triplinerve Vahl.), họ Cúc (Asteraceae) - Bạch (Radix Angelicae dahuricae), rễ củ bạch hcir (Angelica dahurica (Fisch Ex Hoffm) Benth Et Hook f.), (Angelica dahurica (Fisch ex Hoofm) Benth et Hook f.var.formosana (Boiss) Shan et Yuan.), họ Hoa tán (Apiaceae) - Tiền hồ (Radix Peucedani), rễ tiền hồ (Peucedanum prearuptorum Dunn.), P decursivum (Miq) Maxim.), họ Hoa tán (Apiaceae) - Rễ tranh (Rhizoma Imperatae) thân ngầm Cỏ tranh (mperata cylindrica Beauv., Poaceae) Nội dung thực tập 2.1 Chiết xuất coumarin Cân khoảng 1g bột dược liệu, cho vào bình nón 100ml Thêm 20ml cồn 96%, đun nồi cách thủy sôi phút Lọc qua Dịch chiết thu để làm phản ứng định tính sắc ký lớp mỏng 2.2 Định tính coumarin phản ứng hóa học 2.2.1 Phản ứng với dung dịch FeCl3 Cho ml dịch chiết vào ống nghiệm, cho 2-3 giọt FeCl3 1%, cho màu xanh (phản ứng dương tính coumarin có OH phenol tự do) 2.2.2 Phản ứng mở đóng vịng lacton Cho vào ống nghiệm ống ml dịch chiết - Ống 1: thêm ml nước cất, dung dịch trở nên đục - Ống 2: thêm ml dung dịch NaOH 10% Ðun cách thủy ống 2-3 phút Ðể nguội, thêm vào ống ml nước cất Thấy ống ống Acid hoá ống vài giọt HCl đặc thấy ống đục 2.2.3 Phản ứng diazo hoá Cho vào ống nghiệm ml dịch chiết Thêm vào ml dung dịch NaOH 5% 24 Ðun cách thuỷ đến sôi để nguội Cho vài giọt thuốc thử Diazo có màu đỏ đỏ cam 2.2.4 Sự tăng huỳnh quang môi trường kiềm tác dụng tia UV Quan sát huỳnh quang vết coumarin ánh sáng tử ngoại tác dụng với dung dịch kiềm (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans tác dụng tia tử ngoại) Nhỏ giọt dịch chiết (ở mục 2.1) lên giấy lọc., chờ khô dung môi lặp lại lần Nhỏ tiếp giọt dung dịch NaOH 5% Sấy khô Che nửa vết dịch chiết miếng kim loại (chìa khố, đồng xu v.v ) đem soi UV 365 nm 1-2 phút Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp đèn tử ngoại thấy: phần khơng bị che có huỳnh quang sáng phần bị che Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sáng dần lên, sau vài phút hai phần phát quang 2.2.5 Thử nghiệm vi thăng hoa - Cho bột dược liệu vào chén nung nhỏ, trải dược liệu thành lớp mỏng đáy chén Đặt chén nung lên bếp điện nồi cách cát Đảo dược liệu đến khơng cịn nước bốc lên Đặt phiến kính lên miệng chén Trên phiến kính đặt miếng thấm nước lạnh, liên tục thay miếng Sau khoảng 10 – 15 phút, lấy phiến kính đem soi kính hiển vi thấy có tinh hình kim khơng màu 2.3 Định tính coumarin sắc ký lớp mỏng - Bản mỏng Silicagel GF254 tráng sẵn - Dịch chấm sắc ký: Dịch chiết cồn dược liệu bốc cách thủy đến cắn Hòa tan cắn với CHCl3, dùng dịch chấm sắc ký, chấm lần, sau lần chấm để khô 15 giây chấm tiếp - Dung môi khai triển: S1 S2 (xem phần 1.1) - Phát hiện: Sau triển khai, mỏng để bay hết dung môi, quan sát mỏng đèn UV 254, 365nm - Vẽ sắc ký đồ tính giá trị Rf vết coumarin 25 III GỢI Ý THẢO LUẬN Điều kiện thực phản ứng diazo định tính coumarin Nếu khơng mở vịng lacton, phản ứng có xảy khơng ? Giải thích thử nghiệm đóng mở vịng lacton coumarin Giải thích tăng huỳnh quang coumarin môi trường kiềm chiếu tia UV 365 nm, yếu tố ảnh hưởng tới thử nghiệm 26 BÀI 5: DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID Mục tiêu Sau thực hành “Dược liệu chứa flavonoid” sinh viên phải : - Chiết xuất flavonoid từ dược liệu cho định tính - Thực phản ứng hóa học nhận định kết phản ứng định tính flavonoid từ dịch chiết dược liệu I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Flavonoid hợp chất có khung C6-C3-C6 với C6 vịng thơm (A B) Vị trí 3, 5, 7, 3’,4’, 5’ nhân thơm thường có nhóm –OH Mạch carbon thường tạo dị vòng oxy hay cạnh (C) Việc định tính flavonoid chủ yếu dựa vào phản ứng nhóm OH phenol dị vòng C - Flavon, flavanon dẫn chất 3-hydroxy Phản ứng vòng γ-pyron Dưới tác dụng tác nhân khử (Mg/HCl; Zn/HCl; NaBH4 v.v…) vòng γ- pyron flavon(ol), flavanon(ol) bị khử thành nhân pyrilium ( tạo thành dẫn chất anthocyanidin tương ứng) làm cho dung dịch chuyển thành màu đỏ cam tới đỏ ( phản ứng cyanidin, phản ứng Shibata…) Các chalcon môi trường acid trở thành flavanon nên sẽdương tính với phản ứng Phản ứng OH phenol Các nhóm OH phenol phân tử flavonoid tạo phenolat với chất kiềm làm dung dịch tăng màu môi trường kiềm; tạo phức với ion kim loại đa hóa trị Fe+++, Cr++, Pb++, Zr++, v.v….cho phản ứng có màu và/hoặc kết tủa Các tính chất ứng dụng định tính chung polyphenol Trong môi trường kiềm nhẹ, flavonoid có vịng thơm mà vị trí ortho hay para ( so với nhóm –OH phenol) khơng có nhóm không bị cản trở lập thể tạo với thuốc thử diazonium sản phẩm cộng hợp azoic có màu từ đỏ cam đến đỏ - Anthocyanin Do có nhân pyrilium, anthocyanidin có màu thay đổi tùy pH mơi trường Trong mơi trường acid, trung tính kiềm, anthocyanidin cho màu đỏ, tím xanh Khi thực phản ứng cyaniding (Mg + HCl), AC cho màu đỏ (do mơi trường có tính acid; khơng phải AC bị khử hóa tiếp tục) 27 - Leucoanthocyanidin Trong mơi trường acid đun nóng, LAC khơng màu bị oxy hóa phần thành dẫn chất AC tương ứng có màu đỏ cam tới đỏ Khi kiềm hóa dung dịch sau đó, dung dịch chuyển thành màu xanh II THỰC NGHIỆM Ngun vật liệu thí nghiệm 1.1 Dụng cụ, hóa chất thuốc thử - Cồn 25%, 96% - Dung dịch AlCl3 1% MeOH - Bột Mg kim loại - Dung dịch chì acetat trung tính 1% - Dung dịch HCl 1% - Dung dịch Na2CO3 10% - HCl đậm đặc - Dung dịch NaOH 1% - Dung dịch FeCl3 1% - Thuốc thử diazonium 1.2 Dược liệu - Hòe ( Flos styphnolobii immaturus japonici) nụ hoa Hòe ( Styphnolobium japonicum (L.)., Fabaceae) - Vỏ Bưởi ( Pericarpium Citri grandi) vỏ Bưởi ( Citrus grandis (L.) Osbeck, Rutaceae) - Gổ Me (Lignum Tamarindi) gỗ Me ( Tamarindus indica L, Fabaceae) - Đậu đen ( Semen Vignae unguiculatae) hạt Đậu đen (vigna unguiculata (L.) Walp., Fabaceae) - Rễ Tranh ( Rhizhoma Imperatae) thân ngầm Cỏ Tranh (Imperata cylindric (L.) P.Beauv., Poaceae) Mẫu Dược liệu Thành phần định tính H bột hoa hịe flavonol B bột vỏ bưởi tươi flavanon M bột gỗ Me leucoanthocyanidin Đ hạt Đậu đen anthocyanidin T bột rễ Tranh mẫu chứng khơng có flavonoid 28 Chiết xuất Lấy 0,5 g dược liệu cho vào bình nón 100 ml (5 mẫu / bình riêng biệt có dán nhãn) Thêm 25 ml cồn 96% vào bình (riêng mẫu đậu đen Đ dùng cồn 25%) Đậy nút đun bếp cách thủy phút, lắc nhẹ Lọc nóng dịch chiết qua bơng, thu dịch lọc vào ống nghiệm (ghi tên mẫu) Các dịch chiết dùng để làm phản ứng hóa học giấy lọc ống nghiệm 3.Định tính 3.1 Định tính giấy lọc Trên tờ giấy lọc 15 x 18 cm dùng bút chì kẻ thành hàng x cột Mỗi hàng gồm ô ghi ô thử, cột gồm ô ghi ô thử tương ứng với loại dược liệu Trong hàng, dùng pipet Pasteur nhỏ thật gọn vào ô giọt dịch chiết loại dược liệu, để khô tự nhiên Lặp lại lần Vẽ vòng đánh dấu dịch chiết bút chì Để định tính, cột số dùng để ghi tên mẫu, cột số dùng làm mẫu chứng Chứng NaOH 1% AlCl3 1% FeCl3 1% H B M Đ T Nhỏ riêng biệt lên cột lại loại thuốc thử dung dịch NaOH 1%, dung dịch AlCl3 1% MeOH dung dịch FeCl3 1% Chú ý nhỏ dung dịch thuốc thử thành vòng bé, nằm gọn vết dịch chiết Để khô tự nhiên, quan sát màu ánh sáng thường đèn UV 365 nm Ghi nhận màu sắc vết khơng có có thuốc thử , ánh sáng thường UV 365 nm 3.2.Định tính ống nghiệm 3.2.1 Phản ứng nhóm OH phenol nhân thơm 29 Với dược liệu, lấy ống nghiệm cho vào ống ml dịch chiết để làm phản ứng sau: a phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1% b phản ứng tạo phức với dung dịch AlCl3 1% MeOH c phản ứng tạo phức với dung dịch FeCl3 1% d phản ứng tạo phức với dung dịch chì acetat trung tính e phản ứng với thuốc thử diazonium Cách thực hiện: ml dịch chiết + 2-3 giọt thước thử, lắc đều, quan sát màu, tủa so sánh với mẫu chứng (riêng mẫu B, phản ứng với NaOH 1%; quan sát màu ống nghiệm trước nhúng vào nồi cách thủy 2-3 phút) Thực hiện: cho vào ống nghiệm ml dịch chiết, kiềm hóa vài giọt dung dịch NaOH 10%, thêm 1-2 giọt thuốc thử diazonium lạnh Lắc quan sát màu dung dịch Ghi chú: thay NaOH 10% Na2CO3 10% Chỉ dùng 1-2 giọt thuốc thử diazonium 3.2.2 Phản ứng vòng γ-pyron (phản ứng Cyanidin) Cho ml dịch chiết mẫu H, B T vào ống nghiệm riêng biệt có sẵn bột Mg kim loại Thêm từ từ theo thành ống nghiệm 0,5 ml HCl đậm đặc (làm giá ống nghiệm đặt tủ hốt) Quan sát chuyển màu dung dịch Ghi chú: thao tác với acid đặc Chú ý tránh dịch acid trào khỏi ống nghiệm 3.2.3 Phản ứng nhóm anthocyanidin Cho vào ống nghiệm riêng biệt ống ml dịch chiết Đậu đen (Đ) Ống thứ thêm giọt HCl 1%, ống thứ thêm giọt NaOH 1%, ống thứ để nguyên Quan sát mẫu ống nghiệm 3.2.4 Phản ứng nhóm leucoanthocyanidin Cho vào ống nghiệm ml dung dịch chiết gỗ Me (M) cồn giọt HCl đậm đặc Đun cách thủy vài phút, lắc Quan sát màu dung dịch, so với ống chứng Sau phản ứng, kiềm hóa mơi trường với giọt dung dịch NaOH 1% để xem chuyển màu dẫn chất anthocyanidin tạo thành 30 III GỢI Ý THẢO LUẬN Kể tên phản ứng dược cho đặc trưng cho: flavonoid, anthocyanin anthocyanidin Các phản ứng với ion kim loại đa hóa trị (Fe, Al, Pb v.v…), phản ứng với thuốc thử diazonium, tăng màu cho mơi trường kiềm có phải phản ứng đặt trưng cho flavonoid không Trong phần định tính flavonoid giấy lọc (3.1.), thuốc thử có ý nghĩa phân tích UV 365 nm; thuốc thử có ý nghĩa phân tích ánh sáng thường 31 BÀI 6: DƯỢC LIỆU CHỨA ANTHRANOID Mục tiêu Sau thực hành “Dược liệu chứa Anthranoid”, sinh viên phải: - Thực phương pháp định tính Anthranoid: phản ứng Borntrager, thử nghiệm vi thăng hoa, sắc ký lớp mỏng I CƠ SỞ LÝ THUYẾT - Anthranoid chất hữu có khung 9,10-diceton anthracen, khung dạng khử (anthron, anthranol, dihydroanthranol) dạng oxy hoá (anthraquinon) Trong dược liệu Anthranoid dạng kết hợp (glycosid, anthraglycosid) dạng tự (aglycon, anthraquinon) - Dạng glycosid tan dung môi phân cực Dạng aglycon tan dung môi phân cực (benzen, toluen, cloroform, dicloromethan, ether ethylic) - Dựa vào tính tan này, chiết dạng glycosid hay dạng aglycon khỏi dược liệu dung mơi thích hợp - Để định tính Anthranoid dạng oxy hóa, người ta dùng phản ứng Borntrager (các hợp chất Anthranoid phản ứng với kiềm tạo phenolat có màu đỏ, đỏ tím… tan nước) - Người ta ứng dụng phản ứng để định lượng Anthranoid phương pháp quang (so màu, đo quang) Ngồi ra, Anthranoid dạng aglycon thăng hoa nên cịn định tính thử nghiệm vi thăng hoa II THỰC NGHIỆM Nguyên vật liệu thí nghiệm 1.1 Hóa chất thuốc thử - Dicloromethan (DCM) hay cloroform - NaOH 10% - H2SO4 25% - NH4OH 10% - Hệ dung môi sắc ký lớp mỏng S1 = benzen - ethyl acetat - acid formic (75:24:1) S2 = benzen - ethyl acetat (9:1) - Bản mỏng Silicagel GF254 tráng sẵn 1.2 Dược liệu 32 - Muồng trâu (Folium Cassiae alatae), muồng trâu (Cassia alata L.), họ Đậu (Fabaceae) - Thảo minh (Semen Cassiae torae), hạt thảo minh (Cassia tora L.), họ Đậu (Fabaceae) - Đại hoàng (Rhizoma Rhei), thân rễ đại hoàng (Rheum palmatum L.), họ Rau răm (Polygonaceae) - Nhàu (Radix Morindae citrifoliae), rễ nhàu (Morinda citrifolia L.), họ Cà phê (Rubiaceae) Nội dung thực tập 2.1 Định tính Anthranoid phản ứng Borntrager 2.1.1 Định tính Anthranoid tự dạng oxy hóa (aglycon, anthraquinon) - Lấy g bột dược liệu cho vào erlen 50ml, thêm dicloromethan (DCM) hay ether chloroform cho thấm ngập mặt dược liệu cm, lắc kỹ Lọc dịch chiết qua vào erlen 50ml Giữ lại bã dược liệu Thêm ml dung dịch NaOH 10%, lắc kỹ Lớp kiềm có màu đỏ Rút bỏ lớp DCM Giữ lại lớp kiềm 2.1.2 Định tính Anthranoid dạng kết hợp (glycosid, anthraglycosid) - Cho vào bã dược liệu để khô dung môi lượng acid sulfuric 25% đủ để thấm ngập mặt dược liệu cm Đặt erlen cách thủy 10 phút để thủy phân Để nguội, thêm 10 ml DCM, lắc kỹ Lọc qua vào becher 50ml Tách lấy lớp DCM cho vào bình lắng gạn có chứa sẵn ml dung dịch NaOH 10%, lắc kỹ Lớp kiềm có màu đỏ Rút bỏ lớp DCM Cho lớp kiềm 2.1.2 vào bình lắng gạn 2.1.3 Định tính acid chrysophanic Cho vào bình lắng gạn dung dịch H2SO4 25% đến có màu vàng Thêm 20 ml DCM, lắc kỹ Rút bỏ lớp H2SO4 bình lắng gạn Rút ml DCM vào bercher 50 ml để dành chấm sắc ký Cho 10 ml NH4OH 10% vào lắc gạn bỏ Chiết đến lớp NH4OH khơng màu ngưng Lớp DCM lắc tiếp với dung dịch NaOH 10% Nếu lớp NaOH có màu hồng tới đỏ hỗn hợp có chứa acid chrysophanic 2.2 Thử nghiệm vi thăng hoa - Cho bột dược liệu (Đại hồng) vào chén nung nhỏ, trải dược liệu thành lớp mỏng đáy chén Đặt chén nung lên bếp điện nồi cách cát Đảo dược liệu đến khơng cịn nước bốc lên Đặt phiến kính lên miệng chén Trên 33 phiến kính đặt miếng thấm nước lạnh, liên tục thay miếng Sau khoảng 10 – 15 phút, dẫn chất anthraquinon thăng hoa bám vào mặt nước phiến kính - Đem soi kính hiển vi thấy có tinh hình kim màu vàng Sau nhỏ vào phiến kính giọt NaOH 10% tinh thể tan chuyển thành dung dịch có màu hồng 2.3 Ðịnh tính hợp chất anthranoid sắc ký lớp mỏng - Bản mỏng Silicagel GF254 tráng sẵn - Dịch chấm sắc ký: lấy 0,5 ml dịch DCM phần 2.1.3, chấm lần, sau lần chấm để khô 15 giây chấm tiếp - Dung môi khai triển: S1 S2 (xem phần 1.1) - Phát hiện: Sau triển khai, mỏng để bay hết dung môi, quan sát mỏng đèn UV 254, 366nm - Vẽ sắc ký đồ tính giá trị Rf vết anthraquinon III GỢI Ý THẢO LUẬN Giải thích nguyên tắc định tính acid chrysophanic dược liệu Nhận xét sắc ký đồ (Rf, màu sắc vết ) mẫu dược liệu triển khai với hệ dung môi S1 S2 34 BÀI 7: DƯỢC LIỆU CHỨA GLYCOSID TIM Mục tiêu Sau thực hành Dược liệu chứa glycosid tim, sinh viên phải: - Chiết xuất tinh khiết hóa glycosid tim từ dược liệu để dùng cho định tính - Xác định glycosid tim dược liệu phản ứng hóa học đặc hiệu I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Glycosid tim nhóm hợp chất có cấu tạo đặc trưng có tác dụng đặc hiệu tim theo quy tắc 3R Potair Cấu tạo chung glycosid tim gồm phần: - Phần đường: đường gặp glycosid tim đường Hexose pentose thơng thường ( glucose, rhamnose v.v…) hay đường desoxy thường gặp glycosid tim (đường 2-desoxy, 2,6-desoxy hexose) - Phần aglycon gồm có phần: ▪ Khung hydrocacbon có cấu trúc steroid ( nhân androstan) ▪ Vịng lacton hay cạnh gắn vào vị trí C17 ( hướng Beta) khung Các phản ứng định tính glycosid tim chủ yếu thực phần đường 2desoxy vòng lacton cạnh - Phản ứng với phần đường 2-desoxy nhân steroid tiến hành môi trường acid - Phản ứng với vòng lacton cạnh thường thực môi trường kiềm thuốc thử cho phản ứng thường dẫn chất nitro thơm Các glycosid tan cồn, nước nóng; tan dung môi phân cực, tính tan dạng aglycon ngược với tính tan dạng glycosid Trong định tính, chiết glycoside tim phương pháp sau: - Chiết cồn thấp độ (25%) - Chiết cồn cao độ, thu hồi dung mơi, hịa tan cao cồn cồn thấp độ Các tạp chất ảnh hưởng tới định tính thường loại dung dịch chì acetat II THỰC HÀNH Nguyên vật liệu thí nghiệm 1.1 Dung mơi, hóa chất thuốc thử - Cồn 20%, cồn 90% * Thuốc thử Xanthydrol - CHCl3 * Thuốc thử Keller – Kiliani - Dung dịch chì acetar 30% * Thuốc thử Raymond – Marthoud 35 - Dung dịch natri sulfat 15% * Thuốc thử Kedde - Acid sulfat đậm đặc * Thuốc thử Legal - Anhydrid acetic * Thuốc thử Baljet - Dung dịch NaOH 10% cồn Cách pha số thuốc thử Thuốc thử Xanthydrol : Lấy 10 mg xanhthydrol, hòa tan 99 ml acid acetic đậm đặc thêm ml HCl đậm đặc, trộn ( thuốc thử dùng 1-2 ngày, dùng pha) Thuốc thử Keller – Kiliani: Dung dịch 1: ml dung dịch FeCl3 5% 100 ml acid acetic đậm đặc Dung dịch 2: ml dung dich FeCl3 5% 100ml acid sulfuric đậm đặc Thuốc thử Baljet: Lấy 0,1 g acid picric hòa tan 25 ml cồn etylic 90%, cho thêm đủ 50 ml hỗn hợp gồm 5g NaOH 15% 70 ml nước, trộn ( dùng pha) Cũng sử sụng thuốc thử pha theo cách sau: TT Baljet 1: dung dịch 0,2% acid picric cồn 90% TT Baljet 2: dung dịch NaOH 1,5% nước Khi sử dụng pha đồng lượng thuốc thử Baljet Baljet Lưu ý: tất dụng cụ phải khô 1.2 Dược liệu - Trúc đào ( Folium Nerii) Trúc đào( Nerium oleander L., Apocynaceae) - Đay (Semen Corchori) hạt Đay dài (Corchorus olitotius L., Tiliaceae) 2.Chiết xuất glycosid tim 2.1 Từ Trúc Đào Lấy 5g bột Trúc đào ngâm bình nón 100ml với 30ml ethanol 25% 24 sau đun nóng 5-10 phút ( lắc) bếp cách thủy sôi Gạn hay lọc dich lọc vào becher Phần bả cịn lại chiết tiếp bếp cách thủy sơi thêm lần nữa, lần với 15 ml ethanol 25% Gộp chung dịch lọc 36 Thêm vào dịch chiết ml dung dịch chì acetat 30% khuấy kỹ, để lắng gạn lọc qua giấy lọc Kiểm tra việc loại tạp cách nhỏ thêm vào dung dịch lọc giọt dung dịch chì acetat, cịn xuất tủa phải cho thêm dung dịch chì acetat lọc lại Thêm vào dịch lọc 6ml dung dịch natri sulfat 15%, khuấy kỹ, để lắng gạn lọc qua giấy lọc (Kiểm tra việc loại chì acetat thừa giọt natri sulfat) Dịch lọc sau loại hết muối chì thừa lắc với CHCl (10 ml x lần) bình lắng gạn Gộp chung dịch CHCl3 làm khan bột Na2SO4 khan Chia dịch CHCl3 thành phần( gồm ống nghiệm chén sứ) Bốc CHCl3 ống nghiệm cách thủy cắn khô ( thực tủ hốt) dịch CHCl3 ống nghiệm thứ dùng để làm phản ứng LiebermannBurchard (3.2.1) Dịch CHCl3 chén sứ dùng để thực phản ứng Raymond-Marthoud(3.2.2.c) 2.2 Chiết xuất glycosid tim từ hạt Đay Lấy gam bột hạt Đay cho vào bình nón 100 ml, thêm 30 ml cồn 50% Đun nóng bếp cách thủy khoảng phút, lắc để nguội lọc dịch chiết qua vào becher 100ml tiếp tục chiết thêm lần nữa, lần với 15 ml cồn 50% lọc nguội vào becher Cơ dịch lọc cịn ½ thể tích Dịch lắc với CHCl3 (15 ml x lần) bình lắng gạn tiến hành tiếp (chia thành phần…) phần dịch CHCl3 chiết từ Trúc đào Các phản ứng định tính glycosid tim 3.1 Các phản ứng phần đường a Phản ứng Keller – Kiliani Cho vào phần cắn ống nghiệm ml thuốc thử Keller, khuấy kỹ cho tan Thêm nhẹ nhàng ml thuốc thử Kiliani dọc theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính mặt ngăn cách lớp thuốc thử xuất vòng màu đỏ đỏ nâu có màu xanh khuếch tán dần lên lớp b Phản ứng với thuốc thử Xanthydrol Thêm 5ml thuốc thử Xanthydrol (bằng pipet khô) vào ống nghiệm khơ có chứa cắn glycosid tim, khuấy kỹ cho tan cắn Đậy ống nghiệm nút bơng nhúng vào becher chứa nước nóng phút, quan sát Phản ứng dương tính dung dịch có màu đỏ mận lan dần từ xuống 3.2 Các phản ứng phần aglycon 37 3.2.1 Phản ứng khung steroid Phản ứng Liebermann-Burchard Cho ml anhydrid acetic vào ống nghiệm khơ có chứa sẵn ml dung dịch glycosid tim CHCl3, lắc Để ống nghiệm nghiêng vào giá vào becher, cho nhẹ nhàng theo thành ống nghiệm khoảng ml acid sulfuric đậm đặc Phản ứng dương tính lớp thuốc thử xuất vòng ngăn cách, sát phía vịng có màu hồng tím, phía vịng có màu xanh tới xanh chàm 3.2.2 Phản ứng vòng lacton cạnh a Phản ứng Baljet Cho ml thuốc thử Baljet ( dung dịch đồng lượng Baljet + Baljet 2) vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim khuấy hay lắc kỹ Phản ứng dương tính dung dịch có màu đỏ cam đậm so với ống chứng( chứa Baljet + Baljet 2) b Phản ứng Legal Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 3-4 giọt cồn 95% để hòa tan cắn Thêm vào 1-2 giọt dung dịch NaOH 10% cồn ( pyridin), thêm tiếp dung dịch natri nitroprussiat 0,5% Phản ứng dương tính dung dịch xuất màu đỏ cam So sánh màu với ống chứng dịch chiết khơng có thuốc thử c Phản ứng Raymond – Marthoud Cơ chén sứ có chứa dịch glycosid tim CHCl3 đến khô, thêm vào chén 2-3 ml thuốc thử meta-dinitrobenzen 1% cồn tuyệt đối, khuấy thêm nhẹ nhàng theo thành chén sứ 1-2 giọt NaOH 10% cồn Phản ứng dương tính xuất màu tím khơng bền Phản ứng thực hiên ống nghiệm hay giấy lọc III GỢI Ý THẢO LUẬN Có nhận xét kết luận nhóm phản ứng âm tính Giải thích cho trường hợp 38