Bg duoc ly 3 c3 3748

DƯỢC LÝ PHÂN TỬ KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH KIỂU GEN GV Mai Thị Thanh Thường Ý NGHĨA Sự bùng phát bệnh truyền nhiễm thường xuất phát từ việc tiếp xúc với nguồn lây chung tác nhân gây bệnh Tác nhân gây dịch có “quan hệ dịng”, hay nói cách khác chúng có  có chung thuộc tính sinh hóa, yếu tố độc lực đặc tính di truyền Sự đa dạng mức loài đủ để vi sinh vật phân lập từ nguồn khác nhau, thời gian khác vị trí địa lý khác phân biệt hay phân loại thành typ hay chủng 1 Ý NGHĨA Việc định typ có ý nghĩa quan trọng dịch tể học để nhận biết dịch, phát lây truyên chéo tác nhân bệnh viện, nhận diện chủng có độc lực đặc biệt theo dõi chương trình tiêm chủng Từ thời Pasteur, tiếp cận dịch tể học liên quan đến việc định typ phân biệt vi khuân dựa chủ yếu vào phương pháp kiểu hình hay kiểu sinh học (nhuộm Gram), bị ảnh hưởng: + Các thay đổi điều kiện nuôi cấy + Sự thiếu hụt số đặc tính kiểu hình + Sự hội tụ tiến hóa đặc tính Ý NGHĨA Ngày định typ phân biệt VK việc so sánh trình tự 16S rADN Chủng: thường hiểu ngữ cảnh đa dạng nucleotid khơng đặc hiệu có liên quan đến số kiểu hình (ví dụ tính trạng khả gây bệnh) 2 TIÊU CHÍ CỦA MỘT PP ĐỊNH TYP TỐT  Tất vi sinh vật lồi phải định typ phương pháp chọn Tuy nhiên số PP khơng, Ví dụ: dựa vào kháng thê hay diện thụ thể thực khuẩn, đặc tính khơng có tất chủng loài + Typ huyết gán cho chủng có diện dấu hiệu huyết học cụ thể Ví dụ, 10 - 15% chủng Mycobacterium avium không thê định typ huyết chúng khơng phản ứng với kháng huyết có +Tương tự, typ thực khuẩn thường dùng cho Staphylococcus aureus, S aureus khơng có thụ thể thực khuẩn khơng thể bị nhiễm khơng thể định typ 2 TIÊU CHÍ CỦA MỘT PP ĐỊNH TYP TỐT  Các phương pháp định typ phải có khả phân biệt cao Nó phải có khả phân biệt rõ ràng chủng khơng có liên quan Ví dụ chủng có nguồn gốc địa lý hồn tọàn khác, đồng thời phải chứng minh quan hệ chủng phân lập từ nguồn gốc 2 TIÊU CHÍ CỦA MỘT PP ĐỊNH TYP TỐT  Độ lặp lại + Đặc biệt quan trọng xây dựng sở liệu chúng biết dùng so sánh với chủng chưa biết + Sự biểu kiểu hình khơng ổn định, ví dụ biểu gen độc lực khơng liên tục, gây khó khăn cho việc lặp lại  Tính dễ dùng giá thành phương pháp TIÊU CHÍ CỦA MỘT PP ĐỊNH TYP TỐT  Các phương pháp định typ dựa kiểu hình nói chung khơng đáp ứng hết yêu cầu  Các phương pháp dựa trình tự ADN hay kiểu gen cho phép khắc phục yếu điểm này: + Tránh nhu cầu môi trường nuôi cấy + Tăng độ nhạy độ ổn định thử nghiệm + Rút ngắn thời gian  Việc định typ phân tử xuất phát từ dấu ấn ADN hay trình tự nuclceotid thu nhiều thông tin 3 PHÂN LOẠI PP ĐỊNH TYP PHÂN TỬ  Các phương pháp định typ phân tử chia làm ba nhóm: a) Phân tích dấu ấn nhiễm sắc thể sử dụng kỹ thuật khuếch đại gen b) Cắt giới hạn nhiễm sắc thể vi khuẩn c) Khuếch đại gen phân tích trình tự LỰA CHỌN GEN ĐỂ PHÂN TÍCH BẰNG PP PHÂN TỬ  Việc phân tích chủng từ trình tự nucleotid đủ mạnh để phân biệt vi khuẩn cụ thể, phối hợp với PCR đoạn gen với định trình tự tự động, cung cấp thơng tin chi tiết kiểu gen cách nhanh chóng + Các trình tự ADN ribosom đươc chứng minh hữu hiệu việc phân biệt nhánh sinh loài họ vi khuẩn có quan hệ xa + Các trình tự rARN tiểu đơn vị nhỏ, chứng minh hữu hiệu quan hệ tiến hóa ngành khuẩn lam 4 LỰA CHỌN GEN ĐỂ PHÂN TÍCH BẰNG PP PHÂN TỬ  Có nhiều yếu tố bên gen mã hóa vi khuẩn dẫn đến việc xem xét chúng hữu dụng dấu phân tử để phân biệt chủng: a) Mức độ biến thiên trình tự nucleotid vượt xa trình tự rADN tiểu đơn vị nhỏ lớn b) Protein mã hóa có chức bảo tồn xuyên suốt nhiều chi, chứng tỏ gen toàn vẹn lồi có liên hệ xa c) Vị trí vật lý gen nhiễm sắc thể vi khuẩn chứng tỏ có điều hưởng đơn vị phân loại khác xa 4 LỰA CHỌN GEN ĐỂ PHÂN TÍCH BẰNG PP PHÂN TỬ Nhược điểm phương pháp phân tử  Việc sử dụng đoạn dò phân tử locus nhiễm sắc thể khác để phác họa kiểu gen vi khuẩn phát sinh sai sót  Gen sử dụng để phân biệt lồi khơng chứa trình tự biến thiên cần thiêt để phân biệt với chủng lồi khơng liên quan khác  Việc xác định hiệu định typ thực nghiệm đơn vị phân loại cụ thể tốn thời gian tiền bạc  Đặc tính siêu nhạy kỹ thuật định typ phân tử, kỹ thuật có liên quan đến PCR, làm cho việc phòng tránh ngoại nhiễm trở thành vấn đề lớn 4 LỰA CHỌN GEN ĐỂ PHÂN TÍCH BẰNG PP PHÂN TỬ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐANG ĐƯỢC ỨNG DỤNG  Dấu ấn dựa PCR nhiễm sắc thể vi khuẩn  Các phương pháp cắt giới hạn gen  Định trình tự DNA PHƯƠNG PHÁP PCR KỸ THUẬT CHUNG Có nhiều phương pháp để làm dấu ấn gen vi khuẩn dựa phản ứng khuếch đại  Phân tích dấu ấn PCR mồi lặp, rep-PCR, dựa vào số nhóm trình tự bảo tồn yếu tố ADN lặp phân bố nhiễm sắc thể vi khuẩn Tương tự phân tích VNTR nhân thật, oligonucleotid Sử dụng rep-PCR phát đa hình kích thước cách khuếch đại vùng nhiễm sắc thể nằm yếu tố lặp Bằng cách này, sơ đồ mảnh khuếch đại làm hàm số vị trí vật lý yếu tố lặp nhiêm sắc thể 5 PHƯƠNG PHÁP PCR KỸ THUẬT CHUNG  Phân tích PCR vùng xen 16S 23S, “ribotyp”, cho thông tin kiểu gen chủng dạng đa hình kích thước Mỗi oligonucleotid thiết kế từ đâu 3’ 16S rADN đầu 5’ 23S rADN để khuếch đại vùng xen (IGS) hai tiểu đơn vị rARN  Phân tích ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RAPDPCR), sử dụng phản ứng khuêch đại phần ADN nhiễm sắc thể nhờ hay nhiều đoạn mồi tùy ý ngắn Phân tích gel agarose cho phổ sản phẩm khuếch đại thường đặc trưng cho chủng cụ thể  Sự đa hình chiều dài đoạn khuếch đại (AFLP) kỹ thuật hiệu khác đê phân biệt chủng vi khuẩn có liên quan gần dựa PCR AFLP khuêch đại ADN sau căt với enzym giới hạn Một cách vắn tắt, ADN vi khuẩn PHƯƠNG PHÁP PCR KỸ THUẬT CHUNG  Sự đa hình chiều dài đoạn khuếch đại (AFLP) kỹ thuật hiệu khác để phân biệt chủng vi khuẩn có liên quan gần dựa PCR AFLP khuếch đại ADN sau cắt với enzym giới hạn  ADN vi khuẩn cắt trước với enzym giới hạn (ví dụ EcoRI MseI) tạo hỗn hợp mảnh ADN có chiều dài khác Các đoạn nối oligonucleotid Sợi đôi lúc nối vào cuối mảnh ADN Các đoạn mồii đặc hiệu với đoạn nối với nucleotid chọn lọc 3’ khác dùng để khuếch đại số mảnh từ hỗn hợp AFLP khác với RAPD-PCR chổ bước khuếch đại khơng hồn tồn ngẫu nhiên khác với REP-PCR chổ khơng dựa vào trình tự chung biêt vi khuân Nói cách khác, AFLP dựa vào khuếch đại chọn lọc phần mảnh có trình tự tương đồng với mồi PCR 5 PHƯƠNG PHÁP PCR KỸ THUẬT CHUNG  Sự đa hình chiều dài đoạn khuếch đại (AFLP) kỹ thuật hiệu khác đê phân biệt chủng vi khuẩn có liên quan gần dựa PCR AFLP khuêch đại ADN sau căt với enzym giới hạn Một cách vắn tắt, ADN vi khuẩn cắt trước với enzym giới hạn (ví dụ EcoRI MseI) tạo hỗn hợp mảnh ADN có chiêu dài khác Các đoạn nối oligonucleotid Sợi đôi lúc nối vào cuối mảnh ADN Các đoạn môi đặc hiệu với đoạn nối với nucleotid chọn lọc 3’ khác dùng đê khuêch đại Sô mảnh từ hỗn hợp AFLP khác với RAPDPCR chổ bước khuếch đại khơng hồn tồn ngẫu nhiên khác với REP-PCR chổ khơng dựa vào trình tự chung biêt vi khuân Nói cách khác, AFLP dựa vào khuếch đại chọn lọc phần mảnh có trình tự tương đồng với mồi PCR 6 PHƯƠNG PHÁP CẮT GIỚI HẠN BỘ GEN KỸ THUẬT CHUNG  Được áp dụng allen biến thiên nhiễm sắc thể người, ví dụ để phân biệt cá thể với quần thể  Việc cắt giới hạn nhiễm sắc thể vi khuẩn phương pháp nhạy cảm có độ lặp lại cao để phát biến dị trình tự ADN để phân biệt chủng vi khuân  Kỹ thuật dựa tiền đề ADN hai chủng Vi khuẩn khác có trình tự nucleotid khác nhau, bị cắt với enzym tạo hỗn hợp mảnh cắt khác 6 PHƯƠNG PHÁP CẮT GIỚI HẠN BỘ GEN KỸ THUẬT CHUNG  Do nhiễm sắc thể vi khuận chi 1/1000 kích thước nhiễm sắc thể người, nên phân tích giới hạn tồn nhiễm sắc thể lần phân tích điện di mà khơng cần đánh dấu phóng xạ hay enzym với đoạn dò đặc hiệu cho Vùng đặc hiệu gen  Phương pháp rât nhạy cảm với biến động trình tự xác định dịng riêng biệt Vi khuân 6 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA KỸ THUẬT CHUNG  Các phương pháp di truyền phân tử để phân biệt typ vi sinh vật dựa khác trình tự ADN, phương pháp định trình tự lý thuyêt cách triệt để Tuy nhiên, thực tế + Việc định trình tự ADN thực đoạn ADN ngắn, việc định trình tự nhiều gen hay vùng lớn nhiễm sắc thể khơng thực tiễn 6 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA KỸ THUẬT CHUNG Do đó, ngược lại với kỹ thuật PFGE, Rep-PCR, hay RAPD, toàn nhiềm sắc thể sử dụng để phân tích, định trình tự ADN khảo sát phần nhỏ vị trí có tiêm khác biệt chủng Nên khả có đa hình để phân biệt thấp 6 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA Vùng ADN chọn để định trình tự phải đáp ứng số yêu cầu: - Về câu trúc: phải chứa vùng trình tự biến thiên cao nằm vùng trình tự có tính bảo tồn cao, cần thiết để thiết kề mồi có khả khuếch đại cho tất chủng loài hay cho nhiều loài khác - Vùng biến thiên trình tự phải đủ để phân biệt chủng tập hợp cần khảo sát Ngồi ra, trình tự chọn phải không di chuyển dễ dàng sang chủng khác loài HẾT