BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Lưu THÀNH CÔNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐẶC DƯỢC LIỆU HÒE GIÁC GIÀU SOPHORICOSID KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI 2022 BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Lưu THÀNH C[.]
BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Lưu THÀNH CƠNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐẶC DƯỢC LIỆU HỊE GIÁC GIÀU SOPHORICOSID KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI - 2022 BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Lưu THÀNH CÔNG Mã sinh viên : 1701061 NGHIÊN CỨU ĐIÈƯ CHẾ CAO ĐẶC DƯỢC LIỆU HÒE GIÁC GIÀU SOPHORICOSID KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ Người hướng dẫn: PGS TS Bùi Hồng Cuông Noi thực hiện: Bộ môn Duực học cố truyền HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ƠN Trong q trình thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp, em nhận giúp đờ vô đõ quý báu thầy cô giáo, chuyên gia lĩnh vực nghiên cứu bạn bè gia đình Đâu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, phòng Đào tạo đại học tồn thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện dạy dồ em suốt năm học vừa qua Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biêt ơn sâu săc lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Bùi Hồng Cường, người tận tình hướng dẫn, quan tâm, bảo cách sát tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt q trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển thầy cô môn Dược học cổ truyền tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt q trình làm thực nghiệm Ci cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân người bạn đà ln bên cạnh, đồng hành ủng hộ em suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày 27 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Lưu Thành Công MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VÈ, sơ ĐỔ, ĐỔ THỊ ĐẶT VẤN ĐÈ CHƯƠNG TỒNG QUAN 1.1 Vị thuốc Hòe giác 1.1.1 Vị trí, phân loại đặc điểm thực vật Hòe 1.1.2 Bộ phận dùng 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Tác dụng công dụng theo y học cổ truyền 1.1.5 Tác dụng sinh học sophoricosid có trongdược liệu Hịe giác 1.1.6 Định tính, định lượng 1.2 Phương pháp điều chế cao đặc 1.2.1 Định nghĩa cao thuốc 1.2.2 Đặc điểm cao thuốc 1.2.3 Yêu cầu chất lượng cao thuốc 1.2.4 Phương pháp điều chế cao 1.2.5 Thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa thí nghiệm dựa mạng neuron nhân tạo CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨƯ 12 2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu 12 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.2 Thiết bị, máy móc 12 2.1.3 Hóa chất, chất chuẩn 12 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Xác định độ ắm, tính đặc hiệu xây dựng đường chuẩn định lượng cao đặc vị thuốc Hòe giác 13 222 Nghiên cứu điều chế cao đặc Hòe giác 15 2.3 Xử lý số liệu 17 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN cúư 18 3.1 Xác định tính đặc hiệu xây dựng đuờng chuẩn định lượng cao đặc Hịe giác 18 3.1.1 Tính đặc hiệu phương pháp 18 3.1.2 Xây dựng đường chuẩn 19 3.2 Nghiên cứu bào chế cao đặc 21 3.2.1 Xác định độ ấm hàm lượng SPH mẫu dược liệu Hòe giác 21 3.2.2 Kết khảo sát thông số điều chế cao 21 3.2.3 Thiết kế thí nghiệm 23 3.2.4 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất 25 3.2.5 Xác định giá trị tối ưu biến độc lập kiểm chứng mơ hình 27 CHƯƠNG BÀN LUẬN 30 4.1 Tối ưu hóa hàm lượng hiệu suât chiêt sophoricosid (SPH) thiết kế thí nghiệm nhằm đảm bảo an toàn hiệu vị thuốc Hòe giác 30 4.2 Lựa chọn kích thước dược liệu để chiết xuất bào chế cao đặc Hịe giác 30 4.3 Lựa chọn dung mơi chiết với hỗn họp ethanol- nước khoảng nồng độ 50- 90% để thiết kế thí nghiệm 31 4.4 Lựa chọn điều kiện chiết xuất khác (tỷ lệ DM/DL, thời gian chiết số lần chiết) để chiết xuất bào chế cao đặc 31 4.5 Chọn mô hình xử lý liệu 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỘT SỐ KÝ HIỆU VIẾT TẮT ANN Artificial Neural Network DĐVN Dược điển Việt Nam DĐTQ Dược điển Trung Quốc DM/DL Dung môi/Dược liệu EtOH Ethanol HPLC High Performance Liquid Chromatography MeOH Methanol SKLM Sac ký lớp mỏng SPH Sophoricosid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Cách pha, nồng độ kết mẫu chuẩn A-E 19 Bảng 3.2 Ket định lượng SPH mẫu dược liệu Hòe giác .21 Bảng 3.3 Khảo sát kích thước dược liệu Hịe giác 21 Bảng 3.4 Khảo sát dung môi 22 Bảng 3.5 Khoảng biến thiên biến độc lập 23 Bảng 3.6 Yêu cầu biến phụ thuộc 23 Bảng 3.7 Thiết kế thí nghiệm kết biến phụ thuộc 24 Bảng 3.8 Kết đánh giá mạng neuron nhân tạo 25 Bảng 3.9 Giá trị hàm hy vọng tuyến tính theo biến phụ thuộc 27 Bảng 3.10 Giá trị dự đoán kết thực nghiệm kiểm chứng (n = 3) 29 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, so ĐỊ, ĐỊ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc hóa học sophoricosid (SPH) .3 Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc điển hình ANN Hình 1.3 Sơ đồ buớc tối ưu hóa quy trình chiết xuât mạng neuron nhân tạo 11 Hình 2.1 Sơ đồ bào chế cao đặc .16 Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu nghiên cứu 18 Hình 3.2 Phố mẫu thử mẫu chuẩn SPH 18 Hình 3.3 Đồ thị biếu diễn mối tương quangiữa nồng độ diện tích pic 19 Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu chuẩn (A, B, c,D, E) 20 Hình 3.5 Sơ đồ mạng neuron nhân tạo 25 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn biến thiên biến phụ thuộc theo biến độc lập giá trị hàm hy vọng 26 Hình 3.7 Không gian thiêt kế theo Nồng độ ethanol Thời gian chiêt (vùng màu trắng) (Tỷ lệ DM/DL = 9; số lần chiết = 2) 28 ĐẶT VẤN ĐÈ Hòe giác chín phơi sây khơ Hòe (Sophora japonica L.), thường thu hoạch vào mùa đơng VỊ thuốc Hịe giác đà sử dụng Y dược học cố truyền, có cơng nhiệt giáng hỏa, lương huyết huyết, chủ trị nhiệt đường ruột gây đại tiện huyết, trĩ xuât huyết, can nhiệt gây đau đâu, chóng mặt, măt đỏ [18] Sophoricosid (SPH) isoflavon glycosid, thành phần hoạt chât Hịe giác, có tác dụng chống viêm, chống dị ứng [25], [28], [29], [33]; chống oxy hóa bảo vệ gan [22], [30]; cầm máu, chống béo phì, chống khối u, chống bệnh trĩ [25]; ngồi cịn có tác dụng làm tăng tạo xương, giảm hủy xương, giảm tình trạng lồng xương phụ nữ mãn kinh [13], [21] Do vậy, việc nghiên cứu chiết xuất nhằm thu cao đặc có hàm lượng hiệu suất chiết SPH cao cần thiết, đóng vai trị quan trọng quyêt định chất lượng cùa cao đặc vị thc Hịe giác Từ trước đến nay, phương pháp sắc phương pháp phố biến thông dụng đà dân gian áp dụng để sử dụng vị dược liệu, có Hịe giác Tuy nhiên, phương pháp sắc lại gây nhiều bất tiện sử dụng, đặc biệt tốn nhiều thời gian khó bảo quản Với mong mn phát huy tính ưu việt thuôc cô truyên, tiện lợi cho người bệnh, việc nghiên cứu điều chế phương thuốc thành dạng bào chế đại, cao đặc Hòe giác sử dụng nhiều làm bán thành phầm đề tiếp tục bào chế thành dạng thành phẩm bột cốm, viên nang, viên nén để người dùng dễ dàng sử dụng Phương pháp thiết kế thí nghiệm (experimental design) lựa chọn điều kiện tối ưu dựa nguyên tắc cùa mạng neuron nhân tạo (artificial neural network- ANN), với hồ trợ phần mềm máy tính [31] công cụ hiệu việc tối ưu hóa q trình chiết xuất Từ lý trên, đề tài “Nghiên cứu điều chế cao đặc dược liệu Hòe giác giàu sophoricosid” nghiên cứu với mục tiêu: “Tối ưu hóa quy trình chiết xuất để điều chế cao đặc Hịe giác có hàm lượng hiệu suất chiết sophoricosid cao” CHƯƠNG TÔNG QUAN 1.1 Vị thuốc Hịe giác 1.1.1 Vị trí, phân loại đặc điếm thực vật Hịe Vị trí phân loại: Cây Hịe có tên khoa học Sophora japonica (L.), syn Styphnolobium japonicum (L.) Schott, phân loại thực vật học sau [3],[35]: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lóp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa Hồng (Rosidae) Bộ Đậu (Fabales) Họ Đậu (Fabaceae = Leguminosae) Phân họ Đậu (Faboideae = Papilionoideae) Chi Sophora (= Styphnoỉobỉum) Loài Sophora japonica L Đặc điểm thực vật: gỗ, to, cao đến 15 m, thân thẳng có chỏm trịn, hoi nứt nẻ, màu nâu sẫm Cành nằm ngang, hình trụ, nhẵn, cong queo, màu lục nhạt có chấm trắng Lá kép lông chim lẻ, mọc so le, có - 13 chét mọc đối, hình trứng, đỉnh nhọn, gốc tròn, nguyên, dài cm, rộng 1,5 - 2,5 cm, màu lục nhạt, mặt dưới, có lơng, có kèm Cụm hoa hình chùy đầu cành, dài 20 cm, phân nhánh nhiều Hoa lưỡng tính, khơng đều, nhỏ, màu trắng vàng nhạt Đài hình chng, gần nhẵn.Tràng hoa hình bướm, có màu trắng ngà Quả loại đậu, khơng mở, hình tràng hạt, nhằn, dày thắt nhỏ lại khơng hạt Hạt 2-5, hình bầu dục, dẹt, màu đen bóng [1], [4], [3], [11] Tại Việt Nam, Hòe trồng phố biến số tỉnh miền Bắc, nhiều tỉnh Thái Bình Ở nước khác Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc Triều Tiên có trồng Ở số nước châu Ầu, Hòe trồng làm cảnh [4], [26] Cây Hòe hoa vào khoảng tháng đến tháng 8, chín từ tháng đến tháng 11 [1 ] 1.1.2 Bộ phận dùng Trong y học cổ truyền, nhiều phận Hòe sử dụng đề làm thuốc Dược liệu nụ hoa gọi ‘Hòe mễ\ hoa đà nở gọi ‘Hịe hoa ’ Hịe chín gọi ‘Hịe giác ’ [4] Ngồi ra, rễ, lá, cành non vỏ Hòe sử dụng làm thuốc với số công dụng định [26] Hịe giác (Fructus Sophorae) chín Sophora japonica L (Fam Leguminosae), thu hái vào mùa đông, loại bỏ tạp chất phơi khơ Hịe giác có chiêu dài - cm, đường kính 6-10 mm, bên màu vàng lục đên nâu vàng, nhăn nheo thơ ráp Mặt bên có đường khóp màu vàng Ket cấu mềm, nhăn sau khô, dễ Phụ lục 4: Kết kiếm chứng mơ hình (n=3) thí nghiệm kiểm chứng (KC1, KC2, KC3) thực nhiệt điều kiện: tỷ lệ DM/DL = ml/mg; dung môi chiết: ethanol 80%; thời gian chiết: 90 phút; số lần chiết: Trung bình SD 9,14 9,06 0,1 81,84 79,05 2,46 Thí nghiệm KC1 KC2 KC3 Khối lượng cao 11,29 11,41 11,84 (g) Hàm âm 17,07 18,26 18,22 (%) Hàm lượng SPH 9,03 8,95 (%) Hiệu suất chiết SPH 78,13 77,19 (%) F » 'i Phụ lục 5: Phiêu kiêm nghiệm dược liệu nguyên liệu Hòe giác OO-AO-O- -00—0 G-00 Nữ 121837 21010793 □□ 112008202 «98% linmj&M fiffljgaa "■ 34xũ^^ sA À *a(Rtt£££M¥M5SfO T4H^-TẤW ii iij« & h'i «if 1ft J _ EM# #awđ BPffl Jt # 4-CSit ifc: /*aflftft>tiằ, ô ifljSflfliaằ*ểJ8, ffl^ttSJ*afllSùBP«ttíi|i4 opeor: i’J# Q c Bânager: m I 9i n Iô( Hớ* -lOug nil ằ8 60đtoft iit ô/Jjll: W^ô-Z1-0.07%ô|đj8)S (I2:2C;68)M?M|; 260nm K-f Wf* HPLCffii» Peak RetTime Type [min] • 1 A 4* 2.309 V/ 5.685 w 6.924 w 8.514 w 9.546 w 15.927 VB 17.099 w Width [min] Area [mAU*s] 0.0877 0.1151 Height [mAUJ Area % 15.10960 2.60195 7.6C338 9.80901e-l 0.0980 0.0497 10.32791 1.26761 0.1206 •53131e4 2016.07812 0.2051 7.44134 4.69037e-l 0.1063 8.87881 1.25873 0.1686 51.70213 4.69168 0.0670 0.1231 ■T 2« i> Ifi 99.3440 0.0483 0.0576 0.3354 Phụ lục 8: Săc ký đô mâu kiêm chứng quy trình Phụ lục 8.1 sắc ký đồ cao đặc dưọc liệu (mẫu kiểm chứng quy trình) ỏ’ bước sóng 260nm PDA Ch2 260nm Peak# Ret Time 0.278 2.476 2.756 3.012 3.536 4.202 4.853 5.238 5.608 10 6.029 11 6.471 12 7.468 13 8.315 14 9.088 15 10.043 16 10.832 Totali Area 21006 203954 696599 304879 1189850 596900 71056 1033051 134203 355778 124619 500368 251325 2195504 3018551 405456 11103099 Heiqht 528 12690 99743 25476 58459 44654 5066 85043 9343 25084 4537 23775 13209 112300 141498 12235 673639 Cone 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 Unit Mark V V V V V V V V V V V V V V Name Phụ lục 8.2.sắc ký đồ cao đặc dược liệu (mẫu kiểm chứng quy trình) ỏ’ bước sóng 260nm PDA Ch2 260nm Peak# Ret Time Ị_ 2.480 2.759 3.018 3.541 3.968 4.212 4.861 5.246 5.614 10 6.039 11 6.475 12 7.478 8.330 13 14 9.104 10.056 15 16 10.843 Total Area 209730 669670 314361 1112601 51415 586261 74631 1014568 134541 352582 130471 497247 248239 2134539 3062990 423725 11017571 Heiqht 12456 96694 25168 59285 7054 43810 5397 83027 9403 24895 4688 23557 12980 107466 142940 12794 671615 Cone 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 Unit Mark V V V V V V V V V V V V V V V Name Phụ lục 8.3 sắc ký đồ cao đặc dược liệu (mẫu kiếm chứng quy trình) ỏ’ bưóc sóng 260nm 9.095 in 100- I 50- i J i s i'f PDA Multi 260nm.4nm| ẵ CM in " s „ I 2ị 150“ 2Í5 5.0 7.5 V 1Ổ.0 12.5 lể.o 17*.5 x»x« o.oocI o.oocI o.ooc) o.oocI o.ooc) o.ooc) o.ooc I o.oocI o.oocI Unit Mark V V V V V V V V V V V V V V Name Phụ lục 9.3 Săc ký đô mâu cao 10 PDA Ch2 260nm Peak# Ret Time 2.481 2.759 3.025 3.519 3.914 4.136 4.777 5.129 5.530 10 5.902 11 6.351 12 7.320 13 8.140 14 8.922 15 9.838 16 10.660 17 12.453 18 14.623 Total Area 165625 704039 243920 1072253 57460 640183 6652 1040633 134013 363741 129187 435212 285815 2237702 3227635 440843 3434 97447 11285795 Height 10659 113160 23747 54276 7168 47225 925 88486 9241 26284 4629 25235 13839 116541 158214 13387 179 1742 7149371 Cone 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 Unit Mark V V V V SV T V V V V V V V V V Name Phụ lục 9.4 Săc ký đô mâu cao 11 mAU PDA Ch2 260nm Peak# Ret Time 0.385 2.478 2.757 3.007 3.539 4.221 4.872 5.270 5.629 6.067 10 11 6.505 7.517 12 13 8.383 14 9.158 15 10.133 16 10.915 Total Area 44381 238956 676596 302290 1152408 571804 75650 967999 137001 336776 118378 443089 231190 2029123 2539953 360860 10226456 Height 1005 13625 91446 25329 55312 42461 5440 78622 9342 23799 4474 21609 12036 102649 115255 10915 613321 Cone 000 0 0 0 0 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 Unit Mark 22 22 EE EE EE EE 22 V V V V V V V V V V V V V V Name Phụ lục 9.3 Săc ký đô mâu cao 23 PDACh2 260nm Peak# Ret Time Area Height Cone Unit Mark 0.163 10785 294 0.000 2.475 224116 13076 0.000 2.756 684844 96382 0.I V 3.005 329678 26389 0.000 V 3.537 1169937 55703 0.000 V 4.214 583603 42952 0.000 V 4.864 73731 5380 0.000 V 5.258 1003298 80977 0.000 V 5.618 142421 9907 0.000 V 10 11 6.052 362932 25404 0.000 V 6.492 126130 4791 0.000 V 12 7.498 475268 23110 0.I V 13 8.354 240686 12495 0.000 V 14 9.129 2128934 107041 0.000 V 15 10.099 3166894 145948 0.000 V 16 10.876 459305 14225 0.000 V 11182561 664076 Total Name Phụ lục 9.4 Săc ký đô mâu cao 24 PDACh2 260nm Peak# Ret Time 2.472 3.968 10 11 12 13 14 15 16 Totali 2.753 3.005 3.527 4.211 4.851 5.254 5.628 6.051 6.508 7.496 8.358 9.130 10.104 10.901 Area 158359 645560 323553 1078884 52632 642819 8493 1056820 147088 356196 131837 469576 249695 2258743 3138636 433296 11152186 Height 10464 95211 25945 53017 Cone 0.000 0.000 0.000 0.000 6658 44397 1074 85844 10003 24775 4821 23804 12942 113542 0.000 143922 13498 669917 Unit Mark V V V 0.000 V SV T 0.000 0.000 V V 0.000 0.000 V V V V V 0.000 0.000 V V 0.000 0.000 0.000 0.000 Name