i LỜI CẢM ƠN T ự ệ ề , ợ ự ỡ ớ ủ ể ủ ệ V T ọ ộ ế ớ ự ỡ ủ ọ ự ỡ ề ủ ọ ệ – TS ù T Tù ( Y ợ , ọ ộ ); T ể k Y ợ , ọ ộ , V ệ ợ ệ ộ Y ế, ọ ợ ộ , V ệ T ự ẩ ứ , Biotrade T T ể T S ọ V ệ , ổ ầ ợ , ợ khoa DK Ph[.]
LỜI CẢM ƠN T ự ỡ ệ ề ủ T ế T - ọ ự ỡ ủ Y k ọ ợ T Tù ợ , ( ủ Y ợ , ọ ộ ); ộ,Vệ ẩ ứ , khoa DK Pharma, TS V ỡ ề ọ ọ Vệ ệ ủ ộ,Vệ T ự S ự ộ ự ệ – TS ù T ể ợ ể ọ ọ , ệ - ộ Y ế, , Biotrade - T ổ V ợ ầ T ể ợ , ợ ( , , U ỡ ề ), ù ệ ể ợ ự ệ ề X ợ ủ ọ ể ự ó ọ T, T SV , ề ệ ự ể ề ự ệ ề T ; Sự , ù ệ ỡ T T, Y ế ệ , ọ ứ ề ệ T ủ ụ , ỉ ợ ựủ ộ, ỡ ể , ệ ọ ộ S ộ ự q ý ệ ệ ị , ỡ ủ ề ệ ỡ ợ ủ S , ể ị ủ ị , ỉ X ỉ ệ , - ề ệ ề ợ ọ ể ệ ề ó! S La, ăm 2017 C TS P i Vă N ã MỤC LỤC MỞ ẦU ụ ứu 3 Nộ ứu PHẦN 1: TỔNG QUAN 1 Tổ ề 1.1.1 ù ệ 112 ặ ể 113 ị ợ 1.1 ọ ệ ể ệ Cordyceps militaris Cordyceps militaris ự 1.2.1 Tỉ ủ ủ ứ 1.2 ặ ế C militaris , ế, ộ ủ ệ , Vệ 12 ,S 18 18 2 Tỉ 20 S 1.2.3 Tỉ 23 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 21 V ệ 211 V 212 ứ , ó , ế ị 29 ệ 29 ó ết bị 29 22 ứ 29 221 ề 222 , ó ực nghiệm 30 23 T í 231 T 232 X 29 ệ 47 ệ 47 í ệ 48 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 49 31 Ặ IỂM CỦA NẤM C militaris NBRC 100741 49 3.1.1 ế ứ ặ ể ể ủ C militaris NBRC 100741 49 3.1.2 Kết qu t ếu t ù c 313 ó ĩ ến t o nguồn gi ng n m C militaris cung ữ gi ng 52 th 57 ii 32 ẾT UẢ IÊ C militaris Ở UI Ô ỨU XÂY Õ T Í ứ 3.2.1 Kết qu Ự UI TRÌ UÔI TRỒ Ấ IỆ 59 , ển n m C militaris ể bột nhộng tằm 59 ếu t 3.2.2 Kết qu t ể tự C militaris ến ( ằm/nhộng tằ ịnh th 3.2.3 Kết qu ở ển n m ) 82 ểm thu ho ù th o C militaris 98 324 ùng h th o C militaris IÊ 3.3 KẾT QUẢ ỨU XÂY Cordyceps militaris NBRC 100741 Ở UI 331 Ự Ơ I ng n m NBRC 100741 í UI TRÌ ệm 104 I TRỒNG NẤM T 108 ể C militaris NBRC 100741 108 3.3.2 Sự í ển NBRC 100741 pilot sau xu t thể qu t i ệm 108 3.3.3 Sự ển NBRC 100741 í sợi t ệm 113 3.3.4 Sự ểt ển NBRC 100741 í ù IÊ 341 th o Cordyceps militaris ỨU XÂY Ự Ơ Ộ I Ì ễ UI TRÌ I TRỒ 121 Ấ C militaris Ở UI 125 ế 342 y gi ệm 117 3.3.5 3.4 ện hệ ế 10/2015 - 9/2016 ng n m Cordyceps militaris ị ể R 100741 ứ 125 ể y NBRC 100741 bột nhộng tằm 128 3.4.3 Sự ển củ ù th o NBRC 100741 t ộ ể qu t i PTN 128 ởng củ 3.4.4 Sự thiện hệ sợi th o NBRC 100741 t ộ ệm 134 ởng 3.4.5 Sự ển củ ù th o NBRC 100741 t i hộ ể PTN 137 c y gi 346 T í ù ể ù ợ ù 143 iii 347 3.5 IÊ I ƯỠ TRÙ ù ỨU XÁ Ị ộ th o Cordyceps militaris T À VÀ ỢP CHẤT Ó Ầ , ẠT TÍ À SI 143 ƯỢNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU ỌC CỦA SẢN PHẨ Ô Ạ THẢO C militaris NBRC 100741 147 351 ợ C militaris NBRC 100741 147 352 ợ C militaris NBRC 100741 149 353 ợ 354 ợ ộ , é C militaris NBRC 100741 151 , β C militaris NBRC 100741 152 355 ợ ộ 356 ợ C militaris NBRC 100741 154 357 ợ C militaris NBRC 100741 155 C militaris NBRC 100741 153 3.6 HIỆU QUẢ KINH TẾ, KHẢ Ă TRỒNG NẤM C militaris TRÊ IÊ , I TRIỂN KHAI ỨNG DỤ IÁ T Ể TỪ NHỘNG TẰ UI TRÌ ÂU TẠI SƠ UÔI , IỆN ÂU 155 361 ầ 155 362 ề kh ụn 363 ề thị 364 ệu qu kinh tế 159 157 ng 158 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 163 Kết lu n 163 Kiến nghị 164 TÀI LIỆU THAM KHẢO 165 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Ả ởng củ ế ởng, ển n m C militaris 52 Bảng 3.2 Ả ởng củ Bảng 3.3 Ản ởng nhiệ ộ ế ởng n m C militaris 56 Bảng 3.4 ợ ể bột nhộng tằm 69 Bảng 3.5 T Bảng 3.6 ặ ến t bổ ầ ể y n m C militaris 70 ểm hệ sợi n ể Bảng 3.7 ển n m C militaris 54 ể y 70 ủ ể 45 72 Bảng 3.8 Ả ởng củ ộ ẩm tới kh ể qu n m C militaris ể bột nhộng tằm 74 Bảng 3.9 Ả ởng nhiệ ộ tớ , ển của n m C militaris ể bột nhộng tằm 76 Bảng 3.10 Ả ởng củ è è ển thể qu n m C militaris Bảng 3.11 Ả ởng củ ể bột nhộng tằm 78 ộ ự , Bảng 3.12 Ả ởng củ triển nhộng/tằ Bảng 3.13 Ả ứ ễm n m C militaris ế ởng nhiệ ến việ ể qu n m C militaris 88 ộ tới kh , ợng adenosin, cordycepin n m C militaris Bảngng 3.16 Ả ởng củ ộng tằ 100741 Bảng 3.19 Ả ộng tằ 90 ể qu n m NBRC 92 ởng củ è ởng củ ộng tằ ển thể qu ộ ẩm tới kh ể qu n m NBRC 100741 Bảng 3.18 Ả , 83 ởng tuổi nhộng tằ Bảng 3.14 Ả Bảng 3.17 Ả ển thể qu n m ể bột nhộng tằm 81 C militaris 100741 ởng, è ộng tằ ộ ng93 ự 93 ự ể qu n m NBRC 95 ởng gi ng tằ ến kh ể qu n m NBRC 100741 96 v ợ Bảng 3.20 é in thể qu NBRC 100741 ộng tằ é 97 ng thể qu C militaris Bảng 3.21 Chiề Bảng 3.22 nhộng tằm ợ ể ể ởng 98 ể 99 ổi kh Bảng 3.23 Sự ợ , í ớ, ( s y tủ s c thể qu NBRC 100741 sau ) 100 ợ Bảng 3.24 ể qu n m C militaris theo y tủ s Bảng 3.25 102 ợ ể R 100741 103 Bảng 3.26 Sự ề ệ ổ ợ ể ế Bảng 3.27 ù 103 ặ ể , ển n m C militaris NBRC 100741 pilot sau xu t thể qu t í Bảng 3.28 ặ ển n m NBRC 100741 ể , ện hệ sợi t Bảng 3.29 ặ í ể , ển n m NBRC 100741 í ệm 117 10/2015-9/2016 t Bảng 3.30 Diễn biến th i tiết từ Bảng 3.31 ặ ể ặ ị ởng thể qu 100741131 t i hộ Bảng 3.32 lot sau ệm 113 ểt c y gi ệm 109 ù ể í ệm 126 th o C militaris NBRC t thể qu t i PTN 131 ể ởng củ ù R 100741 th thiện hệ sợi PTN 135 Bảng 3.33 ặ ể , hộ y gi Bảng 3.34 T ầ , , Bảng 3.35 ệ ù th o NBRC 100741 t ể PTN 140 ợ t ch ó ể qu ể ộ tự Nhiệ o 142 ợ ệ ợ ề NBRC 100741 Bảng 3.36 ển củ ợ ệ í ệ ể C militaris 147 ệ ợ ể C militaris ề ệ í 150 vi ợ Bảng 3.37 ệ é ể C militaris ề ệ í 151 Bảng 3.38 ợ R 100741 Bảng 3.39 , ề ợ ệ í ệ ệ í ủ ể C militaris 153 ể ệ ợ C militaris NBRC 100741 ể C militaris NBRC 100741 155 í ầ ự T T t i tỉnh S , 156 ề kh Bảng 3.43 Tổng hợ S ể c 154 ệ , ệ ệ ợ ệ ệ ợ 152 í ợ Bảng 3.42 ệ ệ ợ Bảng 3.41 ề í β ệ ợ ề Bảng 3.40 ề ệ , ộ R 100741 tỉ ệ ợ , ệ , ụ 157 Bảng 3.44 Hiệu qu kinh tế củ T T Bảng 3.45 Hiệu qu kinh tế củ T T ự Bảng 3.46 Tổng hợ T T i3 ệu qu kinh tế trồng n m Cordyceps militaris t i tỉ S , vii ( VT: V ( VT: V ứng dụ ệ , ồng) 160 ồng) 161 161 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 ặ m Cordyceps militaris Hình 1.2 ủ Hình 2.1 S ồb Hình 2.2 S í í ọ ể ứ Cordyceps militaris ệm 43 ớc tiế í í ệ ồng C militaris ộ gia 44 Hình 3.1 ( ) nh cu Hình 3.2 Kết qu n m C militaris (B) 49 ện di s n phẩm PCR rDNA C militaris NBRC 100741 50 Hình 3.3 ế ự 5,8S ủ R 100741 51 Hình 3.4 Vị í chủng n m C militaris Hình 3.5 Biể í c t hệ sợi n m C militaris (B) ng (Tỉ lệ: 60mm) 53 í ẩn l c n m C militaris d i pH 4-9 54 Hình 3.8 S c t hệ sợi n m C militaris ế í ộ ẩn l c n m C militaris Hình 3.10 í nhiệ ộ ng 52 ẩn l c n m C militaris (A) ế Hình 3.9 i 51 ớc khuẩn l c n m C militaris Hình 3.6 Hình 3.7 Biể R 100741 ớc khuẩn l ( ) 55 ệ ộ 56 c t hệ sợi n m C militaris tiết (B) (Tỉ lệ: 50mm) 57 Hình 3.11 ĩ C militaris ( ) ệ Hình 3.13 í ớc khuẩn l c n m C militaris Hình 3.14 Kí ớc khuẩn l c n m C militaris ( ) 58 ợ 60 ợng cao n 62 Hình 3.15 Ả ởng củ ợng cao n ến ởng hệ sợi n m C militaris (tỉ lệ: 50mm) 62 Hình 3.16 Kí ớc khuẩn l c n m C militaris Hình 3.17 Ả ủ ợ ế ự ợ 63 ủ ệ ợ C militaris (tỉ lệ: 50mm) 64 Hình 3.18 Ả ởng củ ợng MgSO4.7H2 ến ởng hệ sợi n m C militaris 65 Hình 3.19 Ả ợng KH2PO4 ến viii ởng hệ sợi n m C militaris 66 Hình 3.20 Ả ợ Hình 3.21 Ả ợng nhộng tằ Hình 3.22 ẩ ủ ến ởng hệ sợi n m 67 ến C militaris ởng hệ sợi n m 68 ợ ộ 68 Hình 3.23 Hệ sợi n tở ể bổ sung thể í Hình 3.24 Hệ sợi n tở ể bổ sung 60-80 ng 72 Hình 3.25 Hệ sợi n tở ể bổ sung 90-100 ng 72 Hình 3.26 ể qu Hình 3.27 ể Hình 3.28 S 30-50 45 ể qu ng 71 ồng 73 45 ồng 73 ởng thể qu n m C militaris ộ ẩm ể bột nhộng tằm 74 Hình 3.29 ớc t Hình 3.30 S ộẩ ồng t o thể qu C militaris 75 ởng thể qu n m C militaris nhiệ ộ ể bột nhộng tằm 77 Hình 3.31 S ợ í ể ới ởng củ ộ ó 79 Hình 3.32 S ởng thể qu n m C militaris ng ộ ể bột nhộng tằm 80 Hình 3.33 Tằ ù Hình 3.34 ĩ ị nhiễm vi khuẩn, n m m ộng tằ y n m C militaris Hình 3.35 S ởng n m C militaris Hình 3.36 S 85 ằ ợng thể qu C militaris ( ) 84 ù ộng tằ ợ 86 ễ ức ( ) 87 Hình 3.37 Thể qu n m C militaris ộng tằ Hình 3.38 Thể qu n m C militaris ộng tằ Hình 3.39 Thể qu n m NBRC 100741 Hình 3.40 S ổ d i nhiệ ộ - 30oC 90 ộng tằ ởng thể qu n m NBRC 100741 ều kiệ è Hình 3.41 Thể qu n c 89 ( ) ộẩ 92 ộng tằ ồng è compact (B) 93 R 100741 ộng tằ ồng ộ 94 Hình 3.42 ộ ằ é ( ) ộ ằ é ( ) 96 Hình 3.43 Thể qu NBRC 100741 thu ho ch 99 Hình 3.44 ù th o NBRC 100741 xế ix y 100 Hình 3.45 ù th y truyền th ng (A) ( ) 101 Hình 3.46 S ẩ ù Hình 3.47 ù ế Hình 3.48 Hệ sợi C militaris Hình 3.49 Sự xu t hiệ ợng củ Hình 3.51 Kh ợng thể qu Hình 3.53 S ổ ó 30 R 100741 ề ệ ế 103 ể bột nhộng tằm pilot 120 ể qu NBRC 100741 (lớn nh t – nh nh t) pilot 120 R 100741/ pilot 120 ợ í ớc thể qu R 100741/ pilot 121 ể qu NBRC 100741 pilot 121 Hình 3.56 Sự xu t thể qu từ hệ sợ ( ộ tự 102 ớc thể qu NBRC 100741 pilot thu ho ch 121 Hình 3.54 nhiệ ó ể qu NBRC 100741 từ hệ sợi pilot 120 Hình 3.50 Kh Hình 3.52 í ợ , o/tự Hình 3.57 Sự xu t hệ sợ Hình 3.58 c thể qu Hình 3.59 ng thể qu ỉnh t th ể ều kiệ ều kiệ ều kiệ x X í í ệ ệ í T ) ều kiện 134 138 139 ệ 139 Bảng 3.18 Ảnh hƣởng ƣờng độ ánh sáng n hình thành thể nấm NBRC 100741 tr n nhộng tằm dâu Cƣờng độ ánh sáng (lx) 100 Cá hỉ ti u theo dõi Khối ƣ ng Kí h thƣớc thể (mm) thể quả/con (g) 0,75±0,64 14,26±0,17 2±0,03 Thời gian hình thành mầm thể (ngày) 6–8 Số ƣ ng thể quả/con 2,07±0,05 200 6–8 2,85±0,74 0,95±0,29 16,44±0,05 2±0,02 ụ 300 6–8 3,56±0,83 1,34±0,20 22,18±0,48 2±0,02 ụ V m 400 6–8 4,35±0,48 1,57±0,50 24,42±0,38 2±0,02 ụ V m 500 6–8 4,68±0,39 1,71±0,04 27,03±0,02 2±0,02 ụ V m 600 6–8 4,68±0,01 1,70±0,28 27,02±0,16 2±0,02 ụ V m 700 6–8 4,70±0,27 1,73±0,25 27,74±0,18 2±0,02 ụ V m 800 6–8 4,69±0,04 1,71±0,49 27,29±0,04 2±0,02 ụ V m 900 6–8 4,69±0,09 1,70±0,01 27,30±0,06 2±0,02 ụ V m 1000 6–8 4,70±0,38 1,71±0,04 27,13±0,29 2±0,02 ụ V m 95 Hình dạng thể ụ Màu sắc thể V t V t 3.2.2.4 Ng ê cứu x c ịnh gi ng tằ ù ợ c o g ê cứu uô rồng n m C militaris NBRC 100741 ể ọ ợ ằ ụ í ằ ( T , ó ự ằ ợ é ( ,S ) Tằ é ộ ế ứ ằ C.militaris, ộ é , ,S ợ ự ợ ộ ) ự ọ ằ é ế ễ é ằ ị C.militaris ộ ằ é 3.42 ự ệ ộ ộ ộ , é T ằ é ằ ộ 1,78 ầ ộ é ó í ằ é ó ộ ộ ằ é ỉ S ằ , ợ é ợ ó ứ ớ ợ / : ộ ằ 1,30±0,78 , 0,73±0,52 A B Hình 3.42 Nhộng tằm dâu kén vàng (A) nhộng tằm dâu kén trắng (B) ệ sợi, chuyển s c t m kh thể qu , í ợng thể qu ứ y Kết qu , ự lo i nhộng tằm sau 45 – 55 ợc thể b ng 3.19 Bảng 3.19 Ảnh hƣởng giống tằm đến khả hình thành thể nấm NBRC 100741 Giống Nhộ Vị trí mọc thể é Vị í /ỗ í é Vị í /ỗ í tr ng Nhộ Kí h thƣớc Khối ƣ ng Số ƣ ng thể (mm) thể (g) thể quả/con 22,34 ±0,28 x 2±0,02 0,33±0,09 4,02±0,15 23,77 ±0,15 x 2±0,02 0,18 ±0,29 2,74±0,18 96 é Kết qu b ng 3.19 cho th y: Giữa nhộng tằ ển n m NBRC 100741 , triển n T ộng tằ S é ết qu , n th y: é hộng tằ ủ ợng thể qu / ng, t ể qu 22,34 4,02 í ợng thể qu ớc / t 0,33g N m NBRC 100741 ợng thể qu S / ợ mm, kh i ể 2,74 ể qu / ộng tằ í ợng adenosin thể qu ể nhộng tằ ( ng chế phẩ ), é t 23,77 t 0,18g Thu thể qu n m NBRC 100741 (Viện thực phẩm é ) é , T í ểm nghiệm ợc kết qu thể b ng 3.20 Bảng 3.20 Hàm ƣ ng adenosin ordy epin thể NBRC 100741 tr n nhộng tằm kén trắng nhộng tằm kén vàng Hàm ƣ ng Nhộng tằm dâu kén trắng Nhộng tằm dâu kén vàng Adenosin (mg/g) 0,41 ± 0,03 0,30 ± 0,01 Cordycepin (mg/g) 13,72 ± 0,16 16,05 ± 0,21 S hất ết qu é nhộng tằ í ợng adenosin ộng tằ é , é ng cho thể qu n th : ó T í tằm tự ầu s dụng é ặc ể bột nhộng tằ ộng ù ợp y C militaris u uô c C ar rê g ê C militaris ột nhộng tằm (mục 3.2.1), kết qu t ợng nhộng 200 g/L (200 nhộ nhộng nghiền nh , bổ 145 thể qu , ó ợng thể qu , ù dụng nhộng tằ ể * So ồng é , ết hợp vớ é 0,11 mg/g, 2,33 mg/g so với thể qu n ợ cầ ồng n m C.militaris ợ ợng cordycepin l i th ộng tằ ộng tằ ), ẽ s dụng 15 m men, pepton, g o lứ ợ 35 / ộng, xu t hiệ 97 T ó , ó, ợ ết qu 3.2.2, - thể qu , ó ợng 7,5 / , é Xé ề ột nhộng tằm cao t, hiệu qu ộ ề ợng ho t ch , 10,56 / × 35 ể bột nhộng tằ = 369,6; ể qu ộng tằ ợng Cordycepin 13,72 mg/g × 7,5 = 102,9; ó ợ 16,05 ợng ho t ch t sinh họ é ể qu ó ộng tằ / × 7,5 = 120,375 ợc từ C militaris ợng é y, hiệu qu ột nhộng tằm v n cao ể nhộ C militaris Khi tiế nhộng tằ ớn, việ , dụng nhiều th ó phẩ ó y C militaris ức, ó, ệu qu kinh tế l ặ ù ể Do v y, bột nhộng tằm v ế n ột nhộng tằm ồng C militaris 3.2.3 Kết xá định thời điểm thu hoạ h ông trùng hạ thảo C militaris ảo quản 3.2.3.1 Thu hoạch thể n m C.militaris Bảng 3.21 Chiều ao hình dạng thể C militaris thời điểm sinh trƣởng Sau xuất Chiều cao thể Hình dạng đầu Màu sắc thể (cm) thể thể tuần 1-2 Nhọ ầu V m tuần 4-6 Nhọ ầu V m tuần 7-8 Nhọ ầu V m tuần 7-8 Nhọ ầu V m tuần 7-8 Nhọ ầu V m tuần 7-8 T ầu V t Kết qu ng 3.21 cho th , ó ự , ầ ầ ể ổ ể ọ ầ ữ ế ủ ầ ọ ế í R 1000741, ủ ể í ệ ể Từ 7-8 S ó, ầ Kết qu m i quan hệ hợp chiều cao thể qu ũ ỉ ỷ lệ thu n với th 98 í ó ởng ề ng Bảng 3.22 Hàm ƣ ng adenosin ordy epin thể thời điểm sinh trƣởng Hàm ƣ ng hoạt chất sau thời điểm sinh trƣởng tính từ xuất thể Hoạt chất tuần tuần tuần tuần tuần tuần 0,16 ± 0,07 0,36 ± 0,06c 0,40 ± 0,03c 0,46 ± 0,02c 0,46 ± 0,02c 0,36 ± 0,01c 4,73 ± 0,15 7,74 ± 0,23d 9,12 ± 0,42d 10,56 ± 0,14d 10,56 ± 0,36d 7,58 ± 0,14d Adenosin (mg/g ch t ) Cordycepin (mg/g ch t ) (c óý ầ ;d m2 ĩa óý m T m2 ế ể a í í ệ ể , ụ ể ổ ợ , ợ 45-60 ng / ; ( 0,16 ế 0,46 ầ ( ể , ầ ể 7,58 / , ể 7-8 cm, sau 45-60 ó ự ở , ợ 7-8 m a ể ể 4,73 ế 10,56 ợ ĩa ợ í ầ (p