TRUNG TAM DICH VU PHAN TICH THI NGHIEM THANH PHO HO CHi MINH
(CASE)
TAP HUAN
TAP HUAN LY THUYET VA THUC HANH PHAN
TICH NHANH CHLORAMPHENICOL BANG PHUONG PHAP ELISA DOI VOI NEN MAU
THUY HAI SAN
Trang 33 d oe = " Dox Va tâm Ain „ ia ⁄)
( Vụ” LV
Văn phịng Cơng nhận Chất lượng 0 +
4 J ; F | lá eV rei
i hi aly Pee
Dl T ‘ Laat viễn — bu lang biturip
ae An, Đen Fn) | TRUNG TAM DICH VU PHAN TÍCH ti Cc ASE 7
NGHIEM THANH PHO HO CHi MINH ˆ of, Ding k er
(oO v ~ | pia mee 2 ?-2/
PHÂN TÍCH NHANH : ` gan
CHLORAMPHENICOLBANG {| - ƠNG PHÁP ELISA TRÊN THUY |
|) HAISAN
4 i ? 2 , i ` |
ẼN VĂN HÙNG - PHÒNG NGHIÊN CỨU TRIÊN KHAI
THANG 5/2019
a js CASE
GIOI THIEU VE BLISA
TONG QUAN PHUONG PHAP
l ĐỊNH NGHĨA VẺ KHÁNG NGUYÊN, KHÁNG THẺ
PHAN LOAI PHƯƠNG PHÁP ELISA J :
} CÁC YEU TO ANH HUONG TRONG PHAN TICH |
QUY TRINH PHAN TÍCH MẪU THUỶ HAI SAN
Trang 6Văn phịng Cơng nhận Chất lượng
lỚI THIỆU VẺ PHƯƠNG PHÁP ELISA - ẩŸ$ CASE
Những 1 ưu điểm và khuyết điểm của PHẾ HP pee:
> Dễ thực hiện
> Tốc độ nhanh
>» Chi phi thap : : > Độ nhạy và độ đặc hiện § cao
> Ảnh hưởng nền mẫu và môi trường rất lớn dẫn đến -
sự dương tính giả, âm tính giả
viv KYTHUATRHAN TICHELISA $3 CASE
ELISA (nam Linked Immunosorbent assay): dua trén| | - sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, | — trong đó kháng thể được gắn với mot enzyme Khi thém
cơ chất thích hợp vào phản ứng, ezyme sẽ thuỷ phân cơ
chất thành một chất có màu Tính đặc hiệu giữa phản ứng kháng nguyên và kháng thể do sự hình thành màu Dựa
vào cường độ biết được nồng độ của kháng nguyên hoặc
Trang 7thể và chất tao mau
Quá trình này được f hiện qua hai bước: $% Phản ứng miễn d h hoe “có
đu te :
“ Phan tmg hoá học: h
oxy nguyên tử từ : làm thay đổi màu
FEerum/SnmplE cantshiinr
primary antibodies is added
rete Wha iter plete
| mete ntl ih aneee win le
nia they :
~ wey TL AN aval YM Mee : Steps for
oe | PAE t:ól@ 8/840) 6.Substrate (or the entyme: performing
(Chromogen) is added producing colar color Intensity of the 7, Emyme reacts with the substrate,
color correlates with the level of antigen: ELISA
Trang 8Văn phịng Cơng nhận Chất lượng
_ 1, Load student samples - (unknowns) In triplicate into
- wells of the microplate strips
“all wells Incubate for 8 minutes
E Rinse
3 Add enzyme-linked |
secondary antibody to all wells Incubate for 5 minutes Rinse
4 Add enzyme substrate to all wells Incubate for 5 minutes -
Trang 10Văn phòng Công nhận Chất lượng ANTIBODY CLASSIFICATION Disulfide _ bond Joining chain Joining Secretory chain protein ifs CASE
Kháng nguyên là phân tử kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể, đặc biệt là sản xuất kháng thê
Kháng nguyên là một protein hay một
0olysaccharide, nhưng cũng có thé các loại phân tử
khác, mang các phân tử hapten nhỏ và gắn với một
protein chuyên chở ( chất mang)
Trang 11— ened 1 ANTIGEN ANTIGEN ce [ Da | aie DISULFIDE BINDING SITE
H1 ạ H2 VH ) HEAVY CHAIN (Hc) CHÍ
DIRECT ELISA / INDIRECT ELISA
Keng la Nấu
aco HOW:
Trang 12Văn phịng Cơng nhận Chất lượng
tùsa ức 3t
an icy Q tha" (biotin) ys gânJ\uije‹ -
Well coated with antlyen
Trang 13
: ‘ al À | “
'Đem ủ các đĩa chứa kháng nguyên | : ———— i _| echo f4 ep -
Rita “Thêm kháng dh có gắn enzyme Ốc 1 thcAs
ƒu điểm: đơn giản nhất
- Nhược điểm:
-H Độ đặc hiệu bị giới hạn vì kháng ngun có ít nhất là
hai epitope (quyết định kháng nguyên) mà phương
pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thê gắn vào một epitope L] Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng
Trang 14
Văn phịng Cơng nhận Chất lượng
Og
Phuong oe nà 7 khác Elisa trực tiếp 0 chỗ kháng thê bắt kháng nguyên không được gắn
enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của
thê được gắn v VỚI enzyme)
iii CASE
khang thé khác (kháng thể này mới os ne
Trang 15khẳng n Đem ủ, rửa Thêm kháng thể Ù, rửa Ñ Bỏ sung kháng kháng thể có gắn enzyme Ủ, ,
Thiêm cơ chất tạo màu
U.dockétqua
hon, de dang Tưng mại hoá
Nhược điểm: độ đặc be cua nme tức: Hi thánh _
Trang 16
Văn phịng Cơng nhận Chất lượng
OS 2
Dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất
trong thực tiễn do cho phản ứng mạnh và nhạy Gọi là “Sandwich” là do sự kết hợp
của hai kháng thê là khang thé bat va khang thể phát hiện Kỹ thuật này được chia làm
hai dang: Direct sandwich ELISA va Indirect sandwich ELISA
3j8 CASE Qo is CASE mem detection antibody z Add sobstrate res =n = Lĩng
Well coated with affinity-purttied eres om Z Add streptavidin- HRP eh (3 2 Add substrate
3 Incubate 3, Incubate Aiotln-conjugated detection
antibody
Trang 17
Bã il kháng th số gên du hế
Op
Thêm cơ chất tạo mau
Ủ; đọc kết quả
Trang 18Văn phịng Cơng nhận Chất lượng
Cho khang thé thirl vao gieng ELISA —“"\
PB na |
=e : Đặc trưng hơn ˆ
egal je oe _ Direct sandwich U, rita ae ELISA do khang
“Thêm kháng thé thứ II thể anti-species
oi Ì _ được gắn enzyme
U, i 2 - không phản HỆ
Bỗ sung kháng kháng thé thứ II 06 gin enzyme vio) YO! Khang thé bat
: ae khang nguyén U, rita : ae :
Phan wng canh tranh gồm hai chất tham gia phản
ứng cùng ái lực bắt cặp với chất thứ ba Phản ứng cạnh tranh: đúng đắn thì hai chất cạnh tranh nhau
được đưa vào đồng thời
Trang 19
ên độ nhạy của phản ứng
- nguyên
% Ai luc cua khang
17
Trang 20Văn phòng Công nhận Chất lượng
Og | 33 CASE
Các yếu tô ảnh hưởng đến kết qua ELISA:
+ Nếu các đối chứng âm cho kết quả dương tính thì có
thể do sự nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ kháng thể
được đáng dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm s* Nếu màu không xuất hiện đối với đổi chứng nã
._ hoặc đối với mẫu thì phải kiểm tra lại tật cả hoá chất
_ bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản
Oe 3j8 CASE
# Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dương và cả
mẫu kiểm tra thì phải kiểm tra lại kháng the duoc gan
enzyme và nồng độ của chất tạo màu
_ #® Nếu có tạo màu đối với mẫu nhưng không tạo màu với đối chứng dương thì có thê kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng,
hạn sử dụng và điều kiện bảo quản :
—# Khi đo một phép thử trong điều kiện đang gap sự cố chì nân thay đổi một yếu tơ thí nghiệm
Trang 22
Văn phòng Công nhận Chất lượng a a [ /
k Awuet Wak bí gs an tam Ain ping oủ¿O ì
38 CASE Độ phản ứng - chéo(%) Cac chat ‘AP Glucuronide Florfenicol
s* Đồng nhất một lượng mẫu phù hợp bằng thiết bị trộn
mẫu thích hợp ee ae dun g ner fan co'e
s* Cân 3g mâu đông nhât trộn với 6ml Etyl Acetate, đánh
xoáy mạnh trong 3 phút ở tốc độ cao nhất
og Ly ta tâm 4000 g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng 20 — 25 °C
`
Chu cs 4ml etyl acetat ở phía trên vào ống mới và làm
khô mẫu 6 60-70°C bang khi nitrogen trong nước ấm
Trang 23
“Thém 1 ml 1x @ém chiét mau\va trộn mẫu bằng cách
đánh trong 1 phút
Ly tam 4000 g trong 5 phut
@ case
> Hòa tan 2g mẫu mật ong vào 4ml nước cất trong
ống ly tâm i
> Thêm 4ml Ethyl Acetate, đánh xoáy ở vận tốc cao
nhất trong 3 phút
> Ly tâm mẫu 4000g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng
Trang 24Văn phịng Cơng nhận Chất lượng
Qe oo iÏš CASE
> Chuyển Im Ethyl Acetate phia trên vào ống
nghiệm mới và 2 khô mẫu ở 60- 70°C bằng khí
nén trong m nước am
- ee tan phan khơ cịn lai voi 0,5 ml đệm chiết
mẫu 1x va trộn 'Xoáy mạnh trong 2 phút
> St dung 100 a lớp nước bên dưới để phân tích
ring (CA iŸš CASE
* Cân 2p mẫu mật ong voi i 10 thị Etyl Acetate, danh
xoáy mạnh trong 3 phút với tốc độ tối đa
v Ly tam 5 phút ở nhiệt độ phòng, tốc độ: 4,000 (20-
25°C),
¥ Chuyén 5 ml Etyl Acetate phia trên (tương ứng ol
1g mẫu ban đâu) vào ống nghiệm mới và làm khô ở
60°C bằng cách thơi khí nén trong nước ấm
Trang 26
Van phịng Cơng nhận Chất lượng
|
aS 2 FE CASE
> Chuyén 2 ml Bthyl A Acetat ¢ ở lớp trên vào ống ly tam
mới và làm khô mẫu 60-70°C bang khi nén trong
nước âm | :
> Thém 0,8 mL dém chiét mau lx vào trộn trong với tốc độ tôi đa trong 2 phút
> Su dung100 HE lớp nước bên dưới để phân † tích
53 CASE
s* Thêm 100 pl chuan Chloramphenicol Vào các giếng
khác nhau (Thêm các chất theo thứ tự từ Aone độ
thấp đến nồng độ cao)
s* Thêm 100 ul mẫu vào các giếng còn lại
hale
** Thêm 50 hÌ cộng hop ¢ “AP _ HRP và tron ie cach gõ nhẹ vào cạnh của khuôn khoảng 10 giây
+ Ủ khuôn 60 phút ở nhiệt độ phòng ( 20-25%C
Trang 27
ñÏš CASE
+uÐ0 can tute ‘
cs a tui na
s* Rửa khuôn 3 lần với 250 Hl với 1 x dung dịch Ị
âu mẫu 4È kể
rửa Sau lần rửa cuối, lật ngược khuôn đập nhẹ “oho pe n4 wor! khuôn lên trên khăn giấy đến khi khô ( chú ý : |
thực hiệt bước kế tiếp ngay sau khi rửa khuôn |
Không để các khuôn bị khô giữa các bước )
đc CASE
.s Thêm 100 0ụi cơ chất TMB, phan ung ngay lap tức xây ra khi thêm cơ chất Tron bằng cách đảo vi lee nhẹ khuôn khoảng I phút trong quá
trình ủ( chú ý: bất kỳ cơ chất nào lấy ra khỏi lọ đựng ch ng nên đổ trở lai dé tránh nguy cơ bị
nhiễm bẩn) | |
Trang 28
Văn phịng Cơng nhận Chất lượng
Qe c Sẽ CASE
s* Phản ứng xảy ra ngay lập tức sau khi thêm cơ chất,
trộn đều bằng cách gõ nhẹ vào cạnh của khuôn
‹% Sau khi ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng, thém 100 ul
dung dịch ngừng phản ứng enzym trước đọc khuôn
'ở 450 nn Oe ae af CASE
Đường cong logarit của chuẩn có thể xây dựng trên độ
hấp thu tương đối thu được và nông độ ng/ml tương ứng
2 ` me x
cua từng chất chuẩn
Độ hấp thu của chuẩn (mẫu) x 100
D6 hap thu tương ứng (%) =
Độ hấp thu chuẩn 0
Trang 30
Văn phòng Công nhận Chất lượng
Trang 32
Văn phòng Cơng nhận Chất lượng
UOt thì
Các nguyện ñ
Trang 34Văn phịng Cơng nhận Chất lượng
Kiem tra hiệu chuẩn pipet
da e[ có chặt trước khi sử dụng và Kênh cua pipet hut va phan
hoi the tich bang nhau
h nhi
CASE
Hoá chất sử dụng trộn lấn Cẩn thận dán nhãn mơi hố chất
giữa cdc kit khác số loi, hay để dam bảo không trộn lần các hoá
x y hét han chất với nhau Kít có ngày hết hạn x
sử dụng khác nhau tạo ra khoáng giá trị đọc mật độ quang khác
nhau Tuy nhiên giá trị độ hấp thu
tưởng đối có thể rất tốt để so sánh
kit én ng
Trang 38
a ae tet ene ast a oe núi
Joma ss