TẬP HUẦN
TAP HUAN LY THUYET VA THUC HANH PHAN TICH NHANH CHLORAMPHENICOL BANG
PHUONG PHAP ELISA BOI VOI NEN MAU THUY HAI SAN
NAM 2019
Trang 6
Những ưu điểm và khuyết điểm của To phi
> Dễ thực hiện 5 h Db | ae 2/5: may > Tốc độ nhanh > a6 7 2 gly ae a hy
ELISA (Eneyms 1 Linked Immunosorbent assay) dua trén sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng th thé, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi thêm cơ chất thích hợp vào phan ứng, ezyme sẽ thuỷ phân cơ| chất thành một chất có ‘mau Tinh đặc hiệu giữa phan ứng pee: khang nguyén va khang thé do sự hình thành màu Dựa
vào cường độ biết được nồng độ của kháng nguyên hoặc
Trang 7làm tài đôi màu của hỗn hợp
lở
AnHgens coate, Xe:
wey, Ga
khay muyền
3, Non-antigen binding
antibodies are washed conjugated ‘with bi emg is
off the plate
cbehat The iy ado” hb > 0,
: : = = i
6 Substrate for the enayme 7 Enzyme reacts with the substrate;
{Chromogen) Is added producing color color Intensity of the
color correlates with the level of antigen,
dn, ab Que 0 1 cog J Gen ee ner AM -Serum/Sample containing ¢ Primpry antibodies is added P ‘secondary antibody Is washed off the
Trang 8
1 Load student samples
- (unknowns) In triplicatelnto - _ wells of the microplate strips ˆ Incubate for 5 minutes, Rinse
2 Add primary antibody to
all wells Incubate for 5 minutes
all wells Incubate for 5 minutes
Trang 9TH
(antigenic & Antigen binding ie
(7, determinants) «>
`
Trang 10ANTIBODY CLASSIFICATION Joining chain Joining Secretory chain protein Ce a : tin:
fine nguyên là phan tử kích thích dáp ứng miễn dịch của cơ thể, đặc biệt là sản xuất kháng thé “Kháng nguyên là một poe hay mot
polysaccharide, nhung ciing co thé các loại phân tu khac, mang cac phan tir hapten nho va gan với một
protein chuyên chở ( chất mang)
Trang 11
be Vu BOND
LIGHT mu
GHAIN (Le) Fab
cứ REGION HINGE REGION Fe REGION ’ ANTIGEN — CDRs ;
ee ] 5 T NiED(EIEE BINDING SITE
oo Ê s
DIRECT ELISA “INDIRECT ELISA =o SANDWICH ELISA COMPETITIVE ELISA —
v c⁄c
Trang 12phát hiện sẽ được gắn trực tiếp ` lên mặt giá thể và sẽ được phát hiện đã được gần enzyme)
-_ Đây là dạng đơn giản nhất của phương |
phap ELISA Trong do, khang nguyên
y khang thé duy nhất (chang thé ny
Trang 13Cho kháng nguyên vào đĩa ELISA
Rua
“Thêm kháng dix gắn enzyme
Ùở37C
Th m cơ chất
Dem ủ các đĩa chứa kháng nguyên
Trang 14
thé được gắn với sô)
Trang 15ang nguyen vao dia Đem ủ, rửa Thêm kháng thể Ủ, rửa Bồ sung kháng kháng thể có gắn enzyme * U, re
Thém co chat tao mau
U, doc
Trang 16Od
Dang BLISA được sử dụng phố biển nhất
trong thực tiễn do cho phản ứng mạnh và
nhạy Gọi là “Sandwich” là do sự kết hợp - của hai kháng thể la khang thé bat va kháng
thể phát hiện Kỹ thuật này được chia làm
hai dạng: Direct sandwich ELISA va
Indirect sandwich ELISA |
~ Ney mai Ai ^đ + z0 ” hem 4
= US tố mat về -/ AÁ4/) phe `
Trang 17
“Hỗ sung Ha: Có gắn enzme
Ủ,m
Thêm cơ sát bạo mâu
U, doc két qua
Trang 18
Cho khang thé thir I vảo gi
ig ELISA Ù, rửa : Đặc trưng hơn
Tn Ene nee Direct sandwich Ủ, rửa : ELISA do kháng
Thêm kháng thể thứ II Ỉ = được gắn enzyme TIÊN DỊ TP IS
Ủ, rửa _ không phản ứng
Bồ sung kháng kháng thể thứ II có gắn enzyme vao với kháng thể bắt : a‘
: =e sẽ = kháng nguyên _ Ủ,rửa 38 CASE
Phản ứng cạnh tranh gồm hai chất tham gia phản
ứng cùng ái lực bắt cặp với chất thứ ba Phản ứng
cạnh tranh đúng đắn thì hai chất cạnh tranh nhau
được đưa vào đồng thời
Trang 20
Og : a ii CASE
Các yếu tô ảnh hưởng đến két qua ELISA:
Nếu các đối chứng âm cho kết qua dương tính thì có
thê do sự nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ kháng thé
được dang dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm
+ Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dương
hoặc đối với mẫu thì phải kiểm tra lại tất cả hoá chất
bao gôm: hạn sử dụng, nông độ, điêu kiện bảo quản
Og a 8§3 CASE
` Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dương và ca
mẫu kiểm tra thì phải kiểm tra lại kháng thể được gắn
enzyme va nồng độ của chất tạo màu :
s* Nếu có tạo màu đối với mẫu nhưng không tạo màu với đôi chứng dương thì có thé kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản
s* Khi đo một phép thử trong điều kiện đang gap su cố chì nân thay đơi một yếu tố thí nghiệm _-
Trang 21
ae CASE
sate A la ett cb Ké, parti Welln ae
Chloramphenicol la khang sinh pho rong thường, được thêm vào thức ăn động vật có đặc tính trị liệu và kháng
£ A 2
sinh mạnh Tuy nhiệ, nó dã ì đên ảnh hường liên q
đến huyết học đối với người Vì vậy, chloramphenicol bị
cảm cho vào thức ăn đề điều trị bệnh cho gia súc
a case
Phương pháp dựa trên kh át ELISA so màu cạnh tranh Kháng thể CAP được phủ lên đĩa giếng Mẫu được thêm cùng lúc với liện kết cộng hợp (CAP-HRP) Nếu dư lượng CAP hiện diện trong mẫu phân tích, nó sẽ cạnh tranh với Aen thé CAP va ngan can CAP-HRP liện kết với kháng thể gắn trên giếng
Kết quả tạo ra cường độ mau sau khi thém co chat thi no có
mối quan hệ thuận nghịch với nồng độ thuốc trong mẫu
Trang 22
Lp) = 002 mắc
can chynh vac qímz Các chất _ Độ phân ứng chéo(%) +Ch lorcam pheascol, Elisa? Sel, lục - ácjMs 7 œÍHC ,z6M bi £c/š/⁄c v
4% Đồng nhất một lượng mẫu phù hợp bằng thiết bị trộn
mẫu thích hợp
* Can 3g HN đồng nhất trộn với 6ml Etyl Acetate, đánh
xoáy mạnh trong 3 phút ở tốc độ cao nhất
+ Ly tâm 4000 g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng 20 ~ 25 °C k Chuyên 4 ml etyl acetat ở phía trên vào ống mới và làm
khô mẫu ở 60-70°C bằng khí nitrogen trong nước ấm
Mau | 34 < 30s, —fzã,}* ép đW:6S hệ 3 #0 ba b HD 22 J v 2z fth ;huan AƑ— L7 8g
Chuan Gp nay Á chuẩn ye
Ö cám } ⁄4 off IL
Trang 23{ \>
a ae Case
Hoa tan phần khơ cịn lại này với 2 ml n-Hexan
“eThém | ml 1x đệm chiét mau va tron mau bing cach danh trong | phút oe queen Lo
“Ly tam 4000 g trong 5 phút ae
“Su dung 100 pl lép nước bên dưới đề phân tích
— kia 1 sf rain PP Y be
ded Cromeate
By = =H 22 (20 2 ko nuit cự có » Nem ¢ nga ay ườ of lon tye hdl
ae
> Hòa tan 2ø mẫu mật ong vào 4ml nước no
ống ly tâm i
> Thêm 4ml Ethyl Acetate, đánh XOáy ở vận tốc cao
nhất trong 3 phút
> Ly tam mau ae trong 5 phút ở nhiệt độ phòng
Trang 24ag So 3y3 CASE
>» Chuyển 1ml Ethyl Acetate phía trên vào ống _ nghiệm mới và làm khô mẫu ở 60-70°C bằng khí
nén trong nước âm
> Hòa tan phân khơ cịn lại với 0,5 ml đệm chiết
mau Ix va tron xoáy mạnh trong 2 phút
> Su dụng 100 HI lớp nước bên dưới để phân tích
v Cân 2 ø mẫu mật ong với 10 mi Biyl Acetate, đánh xoáy mạnh trong 3 phút với tốc độ tối đa
v Ly tam 5 phút ở nhiệt độ phòng, tốc độ: 4,000g (20-
25°C) :
v Chuyển 5 ml Etyl Acetate phia trên (tương ứng với lg mau ban đầu) vào ống nghiệm mới và à làm khô ở
60°C bang cách thơi khí nén trong nước ấm
Trang 26
Qe ae af8 CASE
> Chuyén 2 ml Ethyl Acetat ở lớp trên vào ống ly tâm mới và làm khô mau 60-70°C bang khí nén trong
nước ấm
.> Thêm 0,8 ne đệm chiết mẫu 1x vào trộn trong với
tốc độ tối đa trong 2 phút -
> Su dụng 00 BL lớp nước bên dưới để phân tích
% Thém 100 pl chuén Chloramphenicol vao các giếng
khác nhau (Thêm các chất theo thứ tự từ néng d6
thấp đến nồng độ cao) ệ e-› %7 4 s%* Thêm 100 Hl mẫu vào các giếng còn lại
+# Thêm 50 Hl cộng hợp CAP_HRP và trộn bằng cách
gõ nhẹ vào cạnh của khuôn khoảng 10 giây
s* Ủ khuôn 60 phút ở nhiệt độ phòng ( 20-259%C | Re lon phat yen › p98 Ty Gb),
(Lop ) city lo bs 2 ly Bio sel nT
Trang 28
do ee 7 šïcAsE
*+ Phần ứng xắy ra ngay lập tức sau khi thêm cơ chất,
trộn đều bằng cách gõ nhẹ vào cạnh của khuôn
$* Sau khi ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng, thém 100 ul
dung dịch ngừng phần ứng enzym trước đọc khuôn
ở 450 nm oo | Cf is CASE
Đường cong logarit của chuẩn có thể xây dựng trên độ hấp thu tương đối thu được và nồng độ ng/ml tương ứng của từng chất chuẩn
Độ hấp thu của chuẩn (mẫu) x 100
Độ hấp thu tuong ting (%) = - Độ hấp thu chuẩn 0
Trang 32
hắn tất
Trang 34¿ở kênh của pipet hút v i thể tích bằng nhau h Em, area kít én ngày hết hạn
Hoa chat su dung tron lần
giữa các kit khác số lot, hay
peels oy CASE
Can than dan nhãn mơi hố chất
dé dam bảo khơng trộn lần các hố
chất với nhau Ki( có ngày hết hạn sử dụng khác nhau tạo ra khoảng ˆ
pia tr] doe mat do quang khác nhau Tuy nhien gid tri do hap thu tưởng đối có thể rất tốt đề so sánh,