PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ NẤM MỐC MYCOTOXIN TRONG THỨC ĂN GIA SÚC

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ NẤM MỐC MYCOTOXIN TRONG THỨC ĂN GIA SÚC tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đ...

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG Ngành công nghệ sinh học



NẤM MỐC MYCOTOXIN TRONG THỨC ĂN GIA SÚC

GVHD: Phùng Võ Cẩm Hồng

MSSV Họ và tên 072379

S 072375 S 072408 S 072492 S

Trần Hòang Đạt

Võ Hùynh Hồng Ân Chu Ngọc Thùy Dung Nguyễn Mai Thảo Ly

Tháng 12/2010

MỤC LỤC

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực thực phẩm (Ban hành kèm theo quyết định số 867/1999/QĐ-BYT của Bộ trưởng Bộ Y tế ngày 4/4/1998)

2 Official Methods of Analysis of AOAC International 1997, Volume 2, chapter 49, P

2 – 34

3 Tiêu chuẩn Việt Nam: Ngũ cốc – Phương pháp xác định aflatoxin – TCVN 5617 – 1991

4 Tài liệu tập huấn kiểm nghiệm vệ sinh thực phẩm Khoa Hóa – Vệ sinh thực phẩm – Viện Dinh Dưỡng – Hà Nội 3/1995

ĐỀ TÀI:

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ

NẤM MỐC MYCOTOXIN TRONG THỨC ĂN GIA

SÚC

I TỔNG QUAN VỀ MYCOTOXIN:

1 Giới thiệu

− Mycotoxin là sản phẩm chuyển hóa từ nấm mốc và nó gây ngộ độc cho

người và động vật.Ước lượng trong thực tế có khoảng 300 loại độc tố nấm mốc có hại cho người và động vật Với sự cải thiện về các phương pháp phân tích, trong tương lai danh sách các loại độc tố nấm mốc sẽ ngày càng tăng

− Là nguyên nhân gây ra bệnh nhiễm độc tố nấm Độc tính của độc tố nấm mốc phụ thuộc vào lượng ăn vào của thú, khoảng thời gian tiếp xúc, loài, giống, tuổi, giới tính, tình trạng sức khỏe và ngoài ra còn có 1 vài thông số khác như mật độ nuôi, dịch bệnh, nhiệt độ, v.v

− Có hơn 10.000 lòai nấm được biết đến,hầu hết chúng đều có lợi cho con người như trong việc sản xuất bánh mì, pho mát,kháng sinh ,men…nhưng có khỏang 50 lòai nấm mốc gây hại cho vật nuôi và con người vì chúng sản sinh ra độc

tố, các lọai này có thể chia thành hai nhóm: Nhóm gây bệnh dịch và nhóm gây ngộ độc

-Nhóm đầu tiên thuộc lĩnh vực của khoa y tế

-Nhóm thứ hai gây ra vấn đề lớn cho các nhà sản xuất TĂCN bởi vì chúng sinh ra ngộ độc với gia súc và gia cầm

2 Nguồn gốc

− Nấm mốc là nguyên nhân chính trong việc xuất hiện mycotoxin trên cây trồng và nguyên liệu thức ăn Mycotoxin có thể xuất hiện trước khi thu hoạch (hay còn được gọi là nấm trên đồng) hoặc trong thời gian lưu trữ (nấm trong thời gian lưu trữ) Mycotoxin cũng xuất hiện trong thức ăn hoàn chỉnh khi không được bảo quản trong điều kiện thích hợp Nấm mốc không chỉ sản xuất mycotoxin mà chúng còn phá hoại mùa màng Tổ chức lương thực và nông nghiệp thế giới (FAO) ước lượng rằng

có khoảng 25% cây trồng trên toàn thế giới có chứa mycotoxin

− Độc tố nấm mốc được sản sinh trong quá trình chuyển hóa chất dinh dưỡng trong thức ăn gia súc-mycotoxin được sản sinh ra từ Aspergilus,Furasium ,Penicilla và Elaviceps Mycotoxin do nấm sinh ra như sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất trong quá trình tiêu hóa và đồng hóa dinh dưỡng từ ngũ cốc và các nguyên liệu TĂCN khác Trong số này, lọai nguy hiểm nhất là aflatoxin (được tiết ra

từ nấm Aspergillus và A.parasiyicus).Aflatoxin bao gồm 6 lọai khác

nhau(B1,B2,G1,G2,M1 VÀ M3) Aflatoxin B1 là lọai cực độc Một lượng 0,03 ppm aflatoxin B1 từ khô lạc gây ra u gan

− Aflatoxin được sản xuất trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và môi trường thuận lợi cho sự phát triển (khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới,điều kiên lưu trữ ẩm ướt) Aflatoxin thường hiện diện trong các lạoi hạt ngũ cốc (lúa mạch, bắp, kê,yến mạch, gạo, lúa miến,lúa mì),hạt bông vải ,đậu phộng,cây đậu và đậu nành Aflatoxin xuất hiện trước khi thu họach, nhưng cũng xuất hiện trong thời gian lưu trữ nếu các hạt ngũ cốc không được lưu trữ đúng cách (Tangendjaja, 2002)

− Nói chung,khi aflatoxin sinh ra,khó có thể làm gì để lọai bỏ chúng khỏi ngũ cốc hay TĂCN Các lọai độc tố này có cấu tạo hóa học rất ổn định và không dễ bị phá hủy bởi nhiệt, ánh sáng, a-xit, kiềm,hay kéo dài thời gian lưu trữ

− Những lọai nấm mốc này có thể phát triển trong lúc canh tác, lúc thu họach, lúc dự trữ, lúc sản xuất chế biến thức ăn và trong qúa trình cho ăn khi điều kiện thuận lợi.Trên tòan thế giới không có khu vực nào tránh khỏi vận nạn do

mycotoxn gây ra, ảnh hướng của chúng lên mức sản xuất của vật nuôi và sức khỏe của con người Theo số liệu của Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) thì khỏang 25% tổng số lượng ngũ cốc nhiễm mycotoxin

− Nhiều năm trước, người ta cho rằng, độc tố nấm mọc ở mỗi nơi thì khác nhau do điều kiện địa lý của từng khu vực Chẳng hạn như: Aflatoxin thì thường được tìm thấy ở khu vực nhiệt đới , trong khi đó thì Zearalenon thường tìm thấy ở xứ

ôn đới Tuy vậy,ngày nay nguyên liệu thức ăn (khô dầu đậu tương, ngô, dầu

cọ…)được mua bán, chuyên chở từ khu vực này đến khu vực khác Vì thế, cộng hưởng của các lọai mycotoxin là điều dễ hiểu, tác hại của chúng lên năng suất vật nuôi và sức khỏe của con người, ngay cả ở nồng độ rất thấp, dưới mức phát hiện phản ứng dương tính khi phân tích mẫu

3 Mức độ ảnh hưởng của Mycotoxin

 Sự chuyển hóa aflatoxin trong cơ thể

− Điều đầu tiên chúng ta cần biết aflatoxin là tinh thể trắng, bền với nhiệt, không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường (ở 1200C,phải đun 30 phút mới mất tác dụng độc) do vậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có mặt của nấm mốc tương ứng, đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa Tuy nhiên

nó lại không bền dưới ánh sáng mặt trời và tia tử ngọai nên việc khử độc thực phẩm

sẽ có nhiều biện pháp hơn Có 17 lọai aflatoxin khác nhau, nhưng thường gặp và độc nhất là aflatoxin B1

− Aflatoxin B1 là phân tử ái mỡ, có trọng lượng phân tử thấp, dễ dàng được hấp thu sau khi ăn, sự hấp thu là hòan tòan Khi đến ruột non, aflatoxin B1 sẽ được nhanh chóng hấp thu vào máu tĩnh mạch mạc treo, sự hấp thu ở ruột non và tá tràng

là nhiều nhất Niêm mạc ống tiêu hóa có khả năng chuyên dạng sinh học aflatoxin B1 nhờ sự gắn kết với protein-đây là con đường chính để giải độc aflatoxin B1 cho gan Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạc cửa, aflatoxin được tập trung vào gan nhiều nhất (chiếm khỏang 17% lượng aflatoxin của cơ thể) tiếp theo là ở thận ,cơ , mô mỡ, tụy lách…Trong vòng 24 giờ có khỏang 80% bị đào thải qua theo đường tiêu hóa qua mật, đường tiết niêu qua thận và đáng chú ý nó còn bài tiết qua cả sữa

 Đối với gia súc: Độc tố này có trong hạt có dầu nói riêng, nhất là lạc và trong

các bột dinh dưỡng và thức ăn có nguồn gốc ngũ cốc nói chung,rất độc cho

cơ thể vì nó là các tác nhân ảnh hưởng tới sức khỏe của con người và súc vật

− Nấm mốc và độc tố nấm gây bệnh nấm (viêm giác mạc, viêm màng trong tim…)còn gây bệnh dị ứng do tiếp xúc bào tử nấm, gây bệnh độc tố nấm do ăn, uống (dẫn đến ngộ độc,nhiễm độc, tổn thương gan, ung thư gan).Những lọai độc tố trong nấm như trên không bị diệt ở nhiệt độ cao (160-170 0c),do đó, trong trườn hợp nấu chin thì độc tố aflatoxin vẫn tồn tại mà không bị phân hủy

− Aflatoxin đặc biệt ảnh hưởng đến gan Khi ăn vào 1 lượng lớn có thể gây ung thư gan, viêm gan mãn tính,vàng da và xơ gan Tiếp xúc với liều thấp trong 1 thời gian dài thì cũng có thể mang lại 1 số rủi ro

− Ở heo nhiễm độc tố aflatoxin được quan sát trên các giai đoạn: heo theo

mẹ, heo choai, heo vỗ béo và đàn heo giống Một vài triệu chứng điển hình như là giảm lượng ăn vào, tăng FCR, giảm tăng trọng, viêm gan do độc tố, hoại tử và cơ thể bị xuất huyết Aflatoxin có thể truyền từ tử cung của heo nái qua heo con và làm ảnh hưởng đến heo con mới sinh

− Aflatoxin cũng làm tăng sự nhạy cảm của heo đối với bệnh lỵ (Joens và cộng sự, 1981) Trong thí nghiệm này, những heo không bị bệnh được thí nghiệm cho tiếp xúc với heo bị mắc lị sau đó cho ăn thức ăn có mức aflatoxin B1 (0.07 đến

0.14 mg/kg) Thời kì ủ bệnh thì ở heo vừa nhiễm aflatoxin và Serpulina

hyodysenteriae thì ngắn hơn heo chỉ nhiễm Serpulina hyodysenteriae Thêm vào đó,

số ngày mà heo bị nhiễm bệnh và độc tố có dấu hiệu tiêu chảy và bệnh lị dài hơn ở

nhóm heo chỉ bị Serpulina hyodysenteriae Tỷ lệ chết ở nhóm thứ nhất nhiều hơn

nhóm thứ hai

− Trong những điều kiện nhất định, nấm mốc sẽ sinh ra aflatoxin Tuy nhiên, số lượng aflatoxin tạo ra không đủ để gây ngộ độc nặng Các triệu chứng kéo dài như tốc độ tăng trưởng chậm, tiêu tốn thức ăn, khả năng chống bệnh , dịch giảm Nhìn chung, aflatoxin làm giảm khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng và

do đó ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng và các quá trình sử dụng dinh dưỡng của gia súc Aflatoxin ảnh hưởng quá trình trao đổi chất béo và sinh ra mỡ trong gan và giảm mỡ quầy thịt

 Đối với động vật thí nghiệm

− Cysewski và cộng sự (1978) làm thí nghiệm về ảnh hưởng nồng độ độc

tố thú ăn vào trên sự đáp ứng miễn dịch của heo bị bệnh đóng dấu son Thí nghiệm có 24 heo được chia thành 4 nhóm Hai nhóm cho ăn khẩu phần bình thường và hai nhóm cho ăn khẩu phần có nồng độ độc tố như nhau Ở hai nhóm trên, trong mỗi nhóm có 1 lô được tiêm vaccin ngừa bệnh đóng dấu son, và 3 tuần

sau tất cả các heo cho tiếp xúc với chủng virus Erysipelothrix rhusiopathiae Dựa

trên sự đáp ứng miễn dịch của thú, heo sẽ xuất hiện đáp ứng miễn dịch, một phần miễn dịch, hoặc không đáp ứng miễn dịch Kết quả như sau:

1 10 100 1,000 10,000 100,000 1,000,000 10,000,000

Hồi tràng Manh tràng Kết tràng

ĐốI chứng + FB1

Tiêm phòng

vaccin

Kết quả 3 heo có miễn dịch

2 heo miễn dịch 1 phần

1 heo không đáp ứng miễn dịch

2 heo miễn dịch 1 phần

4 heo không đáp ứng miễn dịch

5 heo không đáp ứng miễn dịch

1 heo miễn dịch 1 phần

6 heo không đáp ứng miễn dịch

− Ảnh hưởng của Aflatoxin B1 (khi thí nghiệm trên thú) đến đáp ứng miễn dịch của heo heo con đã được chủng ngừa với erysipelas bacterin và cho nhiễm sau

21 ngày với dòng virus Erysipelothrix rhusiopathiae (theo Cysewski và cộng sự,

1978)

 Độc tính trên động vật thí nghiệm:

Nhiễm độc các aflatoxin gây ra một lọat các triệu chứng cấp và mãn tính

Nhiễm độc cấp thường biểu hiện bằng cái chết của các động vật thí nghiệm với các

triệu chứng thường gặp là họai tử nhu mô gan, chảy máu ở gan và viêm cầu thận

cấp Nhiễm độc mãn tính thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, gan tụ

máu, chảy máu và họai tử nhu mô Lọai mãn tính tác động tới yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, gây quái thai và gây đột biến

Cho đến nay, người ta tạm thời công nhận lên khả năng tác động lên tế bào gan của aflatoxin qua 5 giai đọan:

− Tác động qua lại với ADN và ức chế các polymeraza chịu trách nhiệm

tổng hợp ADN và ARN

− Ngừng tổng hợp ADN

− Giảm tổng hợp ADN và ức chế tổng hợp ARN truyền tin

− Biến đổi hình thái nhân tế bào

− Giảm tổng hợp protein

Hậu quả của quá trình tác động sinh hóa lên tế bào gan này là gây ung thư

biếu mô tế bào gan

Như vậy, aflatoxin có khả năng gây độc tính cấp và mãn ở các loài động vật

và con người Độc tính có nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thư gan

nguyên phát Các nhà khoa học đã gây được ung thư gan nguyên phát trên thực

nghiệm bằng cách cho các con vật ăn thức ăn có aflatoxin Một lọat các nghiên cứu cũng cho thấy sự phơi nhiễm aflatoxin tăng liên quan đến sự gia tăng mắc bệnh ung thư gan nguyên phát trên người Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm, an tòan lương thực thực phẩm, không sử dụng các thực phẩm đã bị hỏng, bị nấm mốc

là một vấn đề hết sức quan trong có ý nghĩa trong việc hạn chế tần suất xuất hiện bệnh ung thư gan

 Cụ thể aflatoxin gây ra các tác hại sau :

1 Phá hủy tế bào gan ,thận và các bộ phận sống còn khác

2 Ảnh hưởng lên hệ miễn dịch

3 Ăn mòn thành ruột và dạ dày

4 Suy dinh dưỡng ,chậm lớn, chết

5 Gây ra ung thư cho gia súc, gia cầm Và nếu con người ăn thịt chứa

aflatoxin thì có thể bị ung thư gan Chính vì vậy, Cục quản lý Thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ đã cấm tất cả các lọai thực phẩm và TĂCN có chứa aflatoxin Trên thực tế, tỷ lệ mắc bệnh cao tại các nước châu Á là do thực phẩm bị nhiễm aflatoxin

− Ngoài aflatoxin, nhiều lọai mycotoxin khác cũng hết sức nguy hiểm như ocharatoxin, T2 (trichothecenes)

Mycotoxin bằng đơn chất hay kết hợp gây ra hiện tượng sau( đôi khi thể hiện nhiều hiện tượng trên 1 cá thể)

• Giảm lượng thức ăn vào, giảm năng suất

• Suy yếu hệ thống miễn nhiễm (giảm lượng kháng thể trong cơ thể)

• Gia tăng mức độ nhạy cảm đối với bệnh tật

• Hư hại các cơ quan nội tạng (gan, thận, bộ phận sinh dục)

• Năng suất sản xuất kém (giảm tỷ lệ thụ thai, sẩy thai, âm hộ sưng to,động dục giả)

• Mối nguy hại cho sức khỏe người tiêu dùng khi thực phẩm có nhiễm mycotoxin

 Một số lọai mycotoxin và tác hại cụ thể:

T2 and Diacetoxycripenol Lở loét miêng, mất tính ngon miệng, da

và ruột bị bong tróc,sưng tấy

Vomitoxin and Fusarie acid Bỏ ăn ,da hay bị nhiễm nấm

Fumoni and Momlifosumin Gây rối lọan thần kinh, gan bị hư nát Aflatoxin and Cyclopiazonic acid Gan bị nhiễm độc tố, suy yếu hệ thống

miễn nhiễm Dehratoxin and Citrinin Thận nhiễm độc , bệnh Gout

4 Cách quản lý mycotoxin:

Cách quản lý mycotoxin hữu hiệu là trung hòa (bằng cách hấp phụ) khi chúng được hấp thu qua đường ruột Các nhà sản xuất thức ăn gia súc đặt ra câu hỏi là:”Chất hấp phụ nào có hiệu quả cao nhất cho mycotoxin?”.Đặc điểm “lý tưởng” mà chất hấp phụ cần có là :

− Có kết quả hấp phụ nhiều lọai mycotoxin

− Liều dùng thấp

− Phân tán nhanh ra đồng đều khi trộn

− Bền với nhiệt trong suốt quá trình viên ép, ép đùn và dự trữ

− Không hấp phụ các lọai vitamin, khóang và các dưỡng chất khác.

− Độ pH không thay đổi

− Có khả năng phân hủy sinh học khi lọai thải ( theo phân vật nuôi)

5 Chế phẩm có tác dụng hấp phụ độc tố nấm mốc trong thức ăn

chăn nuôi - Condition ADE 200 HPC 5.1 Tác dụng lọai bỏ độc tố nấm mốc (Mycotoxin) của chế phẩm Condition Ade

200 HPC.

− Chế phẩm Condition Ade 200 HPC do công ty OIL.DRI- Mỹ nghiên cứu và sản xuất bằng công nghệ hấp thụ hiện đại Nó là chất hấp thụ độc tố Mycotoxin do các lọai nấm mốc khác nhau tạo ra trong thức ăn chăn nuôi tốt nhất cũng như giá thành rẻ so với các chất hấp thụ khác (Silicát tổng hợp, chất kết dính sét và những sản phẩm lên men)

− Tác dụng lọai bỏ nấm mốc Mycotoxin của chế phẩm Condition Ade 200 HPC đem lại hiệu quả như sau:

• Hiệu lực đặc hiệu đối với nhiều lọai độc tố nấm mốc

• Không gây ảnh hưởng (phá hủy) từ các lọai vitamin, acid amin hoặc là dược phẩm

• Có thể pha trộn dễ dàng vào các lọai thức ăn khác nhau

• Chi phí thấp Tỷ lệ pha trộn thấp: 2,5 kg chế phẩm này /1 tấn thức ăn

• Chế phẩm Condition Ade 200 HPC được sản xuất dựa trên quy trình kiểm tra chất lượng nghiêm ngặt

• Nguyên liệu là từ khóang chất nhất quán có chất lượng cao của thiên nhiên

5.2 Tính chất hấp phụ và sự liên kết của Condition Ade 200 HPC

− Những đặc tính hấp phụ

Những hạt nhỏ Condition Ade 200 HPC rất xốp, trọng lượng tăng lên 1,3 lần khi tiếp xúc với chất lỏng tạo cho chúng sức hấp thụ cực độ Mỗi kg chế phẩm có trên

700 triệu hạt và mỗi hạt có diện tích bề mặt trong rất lớn, nhờ đó cung cấp một

lượng lớn các vòng liên kết giúp lọai bỏ nhiều lọai độc tố

− Sự hút bám trên diện tích bề mặt

Mỗi gam Condition Ade 200 HPC có 115 mét vuông diện tích bề mặt Diện tích bề mặt này làm tăng cường mức độ tiếp xúc bề mặt và độc tố nấm mốc Mycotoxin và giúp hấp thụ nhiều độc tố nấm mốc hiệu quả hơn

− Sự hấp thụ của thể tích thẩm thấu

Diện tích bề mặt bên trong của những hạt nhỏ Condition Ade 200 HPC chiếm 98

% tổng diện tích bề mặt Thể tích thẩm thấu này cho phép hạt nhỏ Condition Ade

200 HPC hút nước như là một miếng xốp

− Tốc độ hút bám của độc tố Aflatoxin của Condition Ade 200 HPC

Condition Ade sẽ kết dính nhanh độc tố Aflatoxin trong bộ máy tiêu hóa của vật nuôi khi thức ăn nhiễm nấm mốc Khi trộn Condition Ade 200 HPC vào thức ăn nhiễm nấm mốc nó làm vô họat tác hại của độc tố nấm mốc có trong đó

II THỪƠNG QUY KỸ THUẬT ĐỊNH TÍNH VÀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ VI NẤM AFLATOXIN

1 Nguyên lý của phương pháp:

Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng clorofoc Dịch chiết này được lọc

và một phần dịch lọc được làm sạch qua cột silicagen Làm bay hơi dung dịch rửa giải và hòa cặn với clorofoc hoặc hỗn hợp benzene-axetonitril Sau đó chấm một phần xác định mẫu thử lên bản mỏng, chạy sắc ký và so sánh Rf, màu sắc vết sắc

ký của mẫu phân tích với vết aflatoxin chuẩn dưới đèn tử ngọai có bước sóng

365nm Lượng aflatoxin có thể xác định bằng mắt hay bằng máy đo mật độ hùynh quang

2 Đối tượng áp dụng của phương pháp:

Xác định hàm lượng Aflatoxin B1, B2, G1 , G2 trong các sản phẩm ngũ cốc đậu đỗ, hạt có dầu

3 Dụng cụ , hóa chất, thuốc thử:

 Dụng cụ:

− Máy xay nghiền mẫu

− Máy lắc hoặc máy khuấy từ

− Cân phân tích

− Máy cất quay chân không

− Bếp cách thủy

− Đèn tử ngọai có bước sóng 365nm

− Quang phổ kế UV-VIS

− Máy đo mật độ hùynh quang

− Các trang bị của sắc kí lớp mỏng

− Cột sắc ký thủy tinh, đường kính trong 22mm, dài 300mm, có khóa nút mài thủy tinh hoặc Teflon và bình đựng dung môi phía trên, dung lượng 250ml

− Bình nón nút mài 250ml, 500ml

− Ống đong 50ml,100ml

− Phễu lọc, đường kính 8-10 cm

− Micropipet Hamilton: 20 ml,50 ml

− Bản mỏng kích thước 20x20 cm tráng sẵn lớp mỏng Sillicagen 60-G

 Hóa chất, thuốc thử:

Tất cả các hóa chất đều là lọai tinh khiết phân tích (TKPT) nếu không có các chỉ dẫn riêng nào khác

1 Axêtôn

2 Clorofoc

3 n- Hexan

4 Ete êtylic khan

5 Metanol

6 Axetonnitril

7 Toluen

8 Natri sunfat khan

9 Celite 545, đất điatomit

10 Axit sunfuric 50% (v/v)

11 Axit trifluoraxectic

12 Khí nitơ

13 Bông hút nước (được lọai béo bằng clorofoc ) hoặc bong thủy tinh

14 Các hê dung môi khải triển sắc ký

− Clorofoc /axeton:9/1 (v/v) (theo tỷ lệ thể tích)

− Ete êtylic/ methanol/ nước :94/4,5/1, 5/1 (v/v/v/v)

− Clorofoc/ axeton/ isopropanol/ nước :88/12/1, 5/1 (v/v/v/v)

− Toluen/ êtyl axetat/ axit fomic: 6/3/1 (v/v/v)

15 Silicagen G-60 dùng cho sắc ký cột cỡ hạt 0,063 , 0,2 mm Họat hóa bằng cách sấy khô ở 1050C trong 1 giờ, sau đó trút vào bình tam giác nút nhám, thêm nước với tỷ lệ 1ml nước cho 1gam silicagen, đậy nút, lắc đến khi trộn hòan tòan đều, bảo quản 15 giờ trong bình kín

16 Chuẩn bị dung dịch aflatoxin chuẩn (điều kiện tiến hành: trong phòng mát, tránh ánh sáng):

16a Dung dịch aflatoxin chuẩn gốc (dung dịch A):

− Dùng ống chuẩn 1 mg, mỗi lọai aflatoxin chuẩn B1, B2, G1, G2 lần lượt cho vào 4 bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng hỗn hơp

toluene-axetonitril 98:2 (v/v) ( nồng độ dung cịch aflatoxin chuẩn là 10mg/ml)

16.b Dung dịch aflatoxin chuẩn làm việc (dung dịch B):

− Cho vào một bình định mức 10ml lần lượt 0,5 ml aflatoxin B1; 0,5 ml aflatoxin G1; 0,1ml aflatoxin B2; 0,1 ml aflatoxin G2 (từ dung dịch A ở trên ), định mức đến 10 ml bằng hỗn hợp toluene-axetonitril 98:2 (v/v), nồng độ dung dịch là 0,5 mg/ml đối với B1, G1, và 0,1 mg/ml đối với B2,G2

16.c.Cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn ( dung dịch A mg/ml) bằng quang phổ hấp phụ phân tử UV-VIS, bước sóng 350 nm, tính kết quả theo công thức:

C (mg/ml)=1000.m.A/e

Trong đó:

− m- Khối lượng phân tử Aflatoxin

− A- Mật độ quang ở bước sóng hấp thụ.

− E-Độ hấp thụ phân tử của aflatoxin

Aflatoxin m Dung môi

Benzene-axetonitril (v/v)

l max (nm)

e

Bảo quản:

Bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn 00C, dung dịch A để được 6 tháng và dung dịch

B để được 2 tuần trước khi dung họat hóa ở 1100C trong 1 giờ

4 Phương pháp tiến hành:

(Điều kiện tiến hành : ở phòng mát, tránh ánh nắng)

 Chuẩn bị mẫu:

Nghiền mẫu sao cho có thể qua được rây có lỗ cỡ 1mm

Chú thích: Với các mẫu thử có hàm lượng chất béo lớn hơn 5%,cần loại chất béo bằng cách chiết với dung môi ete dầu hỏa(độ sôi 40-60 0C) sau khi đã hoàn thành công đoạn nghiền mẫu

 Tiến hành xét nghiệm:

a Chiết suất:

Cân 50g mẫu đã nghiền nhỏ cho vào bình nút mài 500ml Cho tiếp 25ml nước, 25g celite 545 250ml clorofoc, đậy nút chặt Lắc trong 30 phút bằng máy lắc quay tròn hay máy khuấy từ (hoặc lắc kĩ bằng tay) rồi lọc qua giấy lọc gấp cạnh, bỏ 10ml dịch lọc đầu, sau đó lấy 50ml dịch lọc tiếp theo (tương đương 10g mẫu thử)