Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.

Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gamma Aminobutyric Acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH NGUYỄN VIỆT TẤN NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHÈ ĐEN GIÀU GAMA AMINOBUTYRIC ACID BẰNG KỸ THUẬT LÊN MEN TỪ MỘT SỐ GIỐNG CHÈ VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÀ NỘI - 1/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH NGUYỄN VIỆT TẤN NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHÈ ĐEN GIÀU GAMA AMINOBUTYRIC ACID BẰNG KỸ THUẬT LÊN MEN TỪ MỘT SỐ GIỐNG CHÈ VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 9540104 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN DUY THỊNH PGS.TS NGUYỄN DUY LÂM HÀ NỘI - 1/2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học riêng hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Duy Thịnh PGS.TS Nguyễn Duy Lâm Các số liệu, kết nghiên cứu nêu luận án trung thực chưa cơng bố trước nơi Người hướng dẫn khoa học Tác giả PGS.TS Nguyễn Duy Thịnh Nguyễn Việt Tấn PGS.TS Nguyễn Duy Lâm i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành nghiên cứu viết luận án này, trước hết xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Duy Thịnh PGS.TS Nguyễn Duy Lâm, người thầy tâm huyết có định hướng hướng dẫn có giá trị khoa học cho nghiên cứu sinh Tôi chân thành cảm ơn Viện Cơ điện nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch, Phịng Nghiên cứu Cơng nghệ bảo quản nơng sản thực phẩm, Phịng Khoa học Hợp tác quốc tế trực thuộc Viện Cơ điện nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch, Trường Cao đẳng Công nghiệp thực phẩm, Bộ Công Thương tạo điều kiện cho tơi tiến hành nghiên cứu, học tập hồn thành luận án Cuối cùng, xin cảm ơn tất người thân, đồng nghiệp người bạn động viên, hỗ trợ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng 10 năm 2022 Tác giả Nguyễn Việt Tấn ii MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG ix DANH MỤC CÁC HÌNH xi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chè, thành phần, hoạt tính sinh học sản phẩm 1.1.1 Giới thiệu chung chè 1.1.2 Thành phần hóa học chè tươi 1.1.3 Hoạt tính sinh học tác dụng chè sức khỏe 11 1.1.4 Các sản phẩm khác biệt cơng nghệ chế biến tính chất 13 1.2 Tổng quan gama-aminobutyric acid (GABA) 15 1.2.1 Giới thiệu chung GABA 15 1.2.2 Hóa học, phân bố tự nhiên GABA 16 1.2.3 Vai trò ứng dụng GABA 17 1.2.4 Sản xuất sản phẩm GABA thương mại 20 1.2.5 Tình trạng pháp lý GABA liều lượng sử dụng 22 1.3 Chế biến chè giàu GABA lên men vi sinh vật 23 1.3.1 Thực phẩm giàu GABA lên men vi sinh vật 23 1.3.2 Chè lên men vi sinh vật 27 1.3.3 Cơ chế hóa sinh q trình tạo GABA lên men vi sinh vật 31 1.3.4 Công nghệ chế biến chè giàu GABA lên men vi sinh vật 32 1.4 Chế biến chè giàu GABA lên men yếm khí 33 1.4.1 Cơ chế hóa sinh hình thành GABA thực vật chè 33 1.4.2 Cơng nghệ lên men yếm khí chè đặc điểm chè giàu GABA 39 1.4.3 Lợi ích chè giàu GABA 43 1.5 Một số nghiên cứu thực phẩm chè giàu GABA Việt Nam 44 1.5.1 Thực phẩm giàu GABA lên men vi sinh vật 44 1.5.2 Thực phẩm giàu GABA từ hạt nảy mầm 45 iii 1.5.3 Chế biến chè lên men chè giàu GABA Việt Nam 46 1.6 Kết luận từ tổng quan giả thuyết nghiên cứu 47 1.6.1 Những kết luận rút từ tổng quan tài liệu 47 1.6.2 Những định hướng giả thiết nghiên cứu luận án 48 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu 51 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 51 2.1.2 Hóa chất môi trường nuôi cấy vi sinh vật 51 2.1.3 Thiết bị phân tích thiết bị cơng nghệ 52 2.2 Kỹ thuật công nghệ để nghiên cứu chế biến chè đen 53 2.2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu lên men chè 53 2.2.2 Kỹ thuật làm héo, vò sấy chè 54 2.2.3 Kỹ thuật tạo môi trường yếm khí 54 2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 49 2.3.1 Các thí nghiệm lựa chọn chủng giống vi sinh vật chè thích hợp 55 2.3.2 Các thí nghiệm xác định tác dụng lên men yếm khí 55 2.3.3 Các thí nghiệm tác dụng lên men yếm khí kết hợp lên men lactic 57 2.3.4 Các thí nghiệm hồn thiện cơng nghệ sản xuất quy mơ pilot 59 2.3.5 Thí nghiệm bảo quản chè đen giàu GABA 59 2.4 Phương pháp phân tích 60 2.4.1 Phương pháp định tính GABA sắc kí mỏng TLC 60 2.4.2 Phương pháp định lượng GABA quang phổ 61 2.4.3 Phương pháp định lượng GABA HPLC 61 2.4.4 Phân tích tiêu chất lượng chè 62 2.4.5 Phân tích chất lượng cảm quan 62 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 62 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 63 3.1 Nghiên cứu lựa chọn vi khuẩn nguyên liệu chè thích hợp cho sản xuất chè đen giàu GABA phương pháp lên men 63 iv 3.1.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp enzym glutamate decarboxylase cao 63 3.1.2 Thẩm định đặc điểm hình thái phân loại chủng vi khuẩn lactic 64 3.1.3 Thử nghiệm khả lên men tạo GABA chè 69 3.1.4 Xác định chế độ công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic để lên men chè đen giàu GABA 70 3.1.5 Tối ưu hóa q trình ni cấy vi khuẩn lactic 78 3.1.6 Phân tích số chất lượng số giống chè Việt Nam 84 3.1.7 Tiêu chuẩn chất lượng chè nguyên liệu để sản xuất chè đen giàu GABA 89 3.1.8 Tóm tắt kết kết luận nội dung mục 3.1 90 3.2 Tác dụng lên men yếm khí tới hiệu tích lũy GABA chất lượng chè đen giàu GABA 91 3.2.1 Thăm dị khả tích lũy GABA q trình lên men yếm khí 91 3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng q trình lên men yếm khí 92 3.2.3 Tối ưu hóa q trình lên men yếm khí 94 3.2.4 So sánh chất lượng chè đen lên men yếm khí với chè đen sản xuất theo quy trình truyền thống 98 3.2.5 Tóm tắt kết kết luận nội dung mục 3.2 99 3.3 Tác dụng lên men yếm khí kết hợp lên men vi khuẩn lactic tới hiệu tích lũy GABA chất lượng chè đen giàu GABA 100 3.3.1 Xác định khoảng thay đổi có ý nghĩa cơng nghệ yếu tố ảnh hưởng đến lên men yếm khí có sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic 100 3.3.2 Tối ưu hóa q trình lên men yếm khí sử dụng chế phẩm vi khuẩn 105 3.3.3 So sánh chất lượng chè đen bán thành phẩm từ phương án lên men yếm khí khơng có sử dụng chế phẩm vi khuẩn 107 3.3.4 Tối ưu hóa trình lên men yếm khí chè đen phương pháp thang điểm có sử dụng hệ số quan trọng tiêu chất lượng 109 3.3.5 Tóm tắt kết kết luận nội dung mục 3.3 113 3.4 Thực nghiệm sản xuất chè giàu GABA quy mô pilot 113 3.4.1 Sản xuất chè đen quy mô pilot 10 kg ngun liệu/mẻ 113 3.4.2 Hồn thiện quy trình công nghệ sản xuất chè đen giàu GABA 119 v 3.4.3 Áp dụng quy trình hồn thiện để sản xuất chè đen giàu GABA quy mô pilot với số giống chè Việt Nam 128 3.4.4 Sự biến đổi chất lượng cảm quan chè đen giàu GABA giống Phúc Vân Tiên Kim Tuyên trình bảo quản 130 3.4.5 Tóm tắt kết kết luận nội dung mục 3.4 133 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 135 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO CỦA LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ 137 TÀI LIỆU THAM KHẢO 138 PHẦN PHỤ LỤC 151 Phụ lục Định danh phân loại chủng vi khuẩn lactic 151 Phụ lục Thu hồi, làm khô bảo quản sinh khối chủng giống 155 Phụ lục Quy trình sản xuất sinh khối chủng giống vi khuẩn lactic 158 Phụ lục 4: Một số hình ảnh thí nghiệm sản phẩm nghiên cứu 162 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BABA CACA CAS beta-aminobutyric acid cis-aminocrotonic acid chemical abstract services beta-aminobutyric axit cis-aminocrotonic axit dịch vụ tóm tắt hóa chất CFU colony forming unit đơn vị hình thành khuẩn lạc CTC crushing tearing and curling black tea chè đen công nghệ CTC OTD DAO orthodox - black tea diamineoxidase chè đen công nghệ OTD enzym diamineoxidase DPPH DS DNA 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl dietary supplements deoxynucleic acid 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl chất bổ sung dinh dưỡng deoxynucleic axit EC epicatechin epicatechin ECG EGC EGCG epicatechin gallate epigallocatechin epigallocatechin gallate epicatechin gallat epigallocatechin epigallocatechin gallat EFSA European Food Safety Authority Cục An toàn TP Châu âu EMA EPA European Medicines Agency U.S Environmental Protection Agency U.S Food and Drug Administration Cục quản lý Thuốc Châu Âu Cục Bảo vệ Môi trường Mỹ GABA gallocatechin immunofunctional growth hormone gamma-aminobutyric acid gallocatechin hocmon tăng trưởng có chức miễn dịch gamma-aminobutyric axit GAD glutamate decarboxylase enzym glutamat decacboxylaza GBR germinated brown rice gạo lứt nảy mầm GHB gamma-hydroxybutyrate gamma-hydroxybutyrat GHBDH GHB dehydrogenase enzym GHB dehydrogenaza GC gas chromatography sắc kí khí GTE green tea extract dịch chiết chè xanh FDA GC GH vii Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ SSF solid state fermentation lên men môi trường rắn HDL high-density lipoprotein lipoprotein tỷ trọng cao HGH human growth hormone hocmon tăng trưởng người HPLC high performance liquid chromatography sắc kí lỏng hiệu cao JECFA Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives Hội đồng Chuyên gia Hỗn hợp FAO/WHO Phụ gia TP LAB lactic acid bacteria vi khuẩn lên men axit lactic LDH lactate dehydrogenase enzym lactat dehydrogenaza PCR polymerase chaine reaction phản ứng chuỗi polymeraza ppm part per million đơn vị phần triệu SSA succinic semialdehyde succinic semialdehid TCA tricarboxylic acid cycle chu trình axit tricacboxylic hay chu trình Krebs TCVN tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam - TLC thin layer chromatography sắc kí mỏng TSTBNM-M tổng số tế bào nấm mốc - men TSVKHK tổng số vi khuẩn hiếu khí TSVKYK tổng số vi khuẩn yếm khí VTCC-B-439 Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarium VTCC-B-439 VTCC-B-411 Chủng vi khuẩn Lactobacillus casei VTCC-B-411 66 Chủng vi khuẩn Lactobacillus brevis 66 67 Chủng vi khuẩn Lactobacillus brevis 67 viii PHẦN PHỤ LỤC Phụ lục ĐỊNH DANH VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN LACTIC Đặc điểm hình thái vi khuẩn axit lactic 1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc Các chủng vi khuẩn lactic khiết cấy ria ba pha môi trường thạch MRS 72 h 37oC Tiến hành quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc theo tiêu chí như: màu sắc, độ bóng, mức độ trơn nhẵn, trạng thái bề mặt 1.2 Hình thái tế bào Các chủng tinh cấy ria ba pha môi trường đĩa thạch MRS 48 h 37oC Tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào Phân loại vi khuẩn dựa phân tích trình tự rDNA 2.1 Tách chiết ADN từ vi khuẩn Thực theo phương pháp: - Ly tâm 1,5 ml dịch nuôi vi khuẩn lấy sinh khối tế bào - Hoà sinh khối tế bào 100 l TE Thêm 0,4 mg lysozyme, trộn đều, ủ 37oC h Trộn ph - Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn 2-3 ph trộn thật kỹ, ủ 37oC/30 ph Thêm thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn Ly tâm 15.000v/p, 15 ph Chuyển lớp dịch phía sang ống Eppendoft khác - Thêm l RNAse mg/ml, trộn đều, ủ 37oC 30 ph - - Thêm 12 l proteinase K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 ph 56oC Thêm thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn Ly tâm 15.000 v/p, 15 ph Chuyển lớp dịch phía sang ống Eppendoft khác Thêm thể tích tương chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15.000 v/p, 15 ph Chuyển lớp dịch phía sang ống Eppendoft khác Thêm 1/10 V Natri acetat M 1ml ethanol 100%, đảo trộn Đặt đá 30 ph Ly tâm 15.000v/p 15 ph Bỏ lớp dịch Rửa tủa ethanol 70% Làm khô DNA máy cô quay chân khơng - Hồ tan DNA 50-100 l nước TE Kiểm tra sản phẩm PCR điện di - 151 Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội đặt gel vào máy điện di, ngập 300ml dung dịch X TAE Trộn l dung dịch 6X loading buffer với l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng Chạy điện di dòng điện chiều với điện 100 V, cưòng độ dòng điện 80 mA 30 ph, bỏ ngâm dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 ph vớt Quan sát máy soi gel 2.2 Phản ứng khuếch đại ADN Thành phần phản ứng sau: Thành phần 10X buffer dNTP 2.0 Mm Mồi xuôi (10 pmol/l) Mồi ngược (10 pmol/l) Taq polymerase (5u/l) ADN khuôn (50-100 g/l) H2O Chu trình nhiệt: 95oC - ph 95oC - 30 s 56oC - 15 s 72oC - ph 72oC - ph 40oC -  Thể tích (l) 10 10 2 1-2 đủ 100 30 chu kì 2.3 Mồi: Mồi xuôi 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' Mồi ngược 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3' Kiểm tra sản phẩm PCR điện di: Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội đặt gel vào máy điện di, ngập 300ml dung dịch 1X TAE Trộn l dung dịch 6X loading buffer với l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng Chạy điện di dòng điện chiều với điện 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA 30 ph, bỏ ngâm dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 ph vớt Quan sát máy soi gel 2.4 Tinh sản phẩm PCR Sử dụng kit QIAgen theo dẫn nhà sản xuất Các bước sau đây: - Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1 Trộn - Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 v/p ph 152 - Đổ bỏ dịch phía cột Bổ sung 750 l PE buffer lên cột Ly tâm 10.000 v/p ph Đổ bỏ dịch cột Ly tâm tiếp 10.000 v/p ph Chuyển cột sang ống Eppendoft Thêm 30l nước Để nhiệt độ phòng ph Ly tâm 10.000 v/p ph Lấy dịch phía Kiểm tra độ tinh mẫu: Mẫu kiểm tra máy quang phổ bước sóng 260 280 Tính tỷ lệ tinh sạch: OD 260/OD 280 > 1,7 2.5 Phản ứng khuếch đại DNA cho đọc trình tự Terminator Ready Reaction Mix (Termix): l - Buffer 5X - Bigdye Ready Reaction premix 18 l - H2O l Thành phần phản ứng PCR cho đọc trình tự: - Termix l - Mồi (*) l - ADN khuôn l (nồng độ ADN 40-60 g/ml) - H2O 10 l (*) Các loại mồi sử dụng: 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3' 780F: 5'-GAATTGATACCCTGGTAG-3.' 350R: 5'-CTGCTGCCTCCCGTAG-3' 1100F: 5'-GCAACGAGCGCAACCC-3' 920R: 5'-GTCAATTCCTTTGAGTTT-3' Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen: 96oC - ph 96oC – 10 s 50oC - s 25 chu kỳ o 60 C - ph 2.6 Tinh sản phẩm PCR cho đọc trình tự - Chuyển 20 l sản phẩm sang ống Eppendoft - Thêm l EDTA 125 mM 60 l ethanol 100% Để khoảng 15 ph nhiệt độ phòng - Ly tâm 15.000 v/p, 15 ph - Bỏ dịch, thêm 60 l ethanol 70% để rửa, ly tâm 15.000v/p, 10 ph 153 - Làm khô Thêm 10 l HiDi Formamide, để 96oC ph Cho mẫu vào nước đá lạnh Chuyển toàn mẫu vào giếng khay dùng cho đọc trình tự Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100 Avant 2.7 Phân tích trình tự xây dựng phát sinh chủng loại Trình tự ADNr 16S phân tích sử dụng phần mềm CLUSTAL W ver 1.83 Thompson cộng (1997) Các trình tự tham khảo dùng nghiên cứu phát sinh chủng loại lấy từ liệu DDBJ, EMBL, GenBank Cây phát sinh xây dựng theo Kimura (1980), sử dụng phương pháp Saitou Nei (1987) ****** 154 Phụ lục THU HỒI, LÀM KHÔ VÀ BẢO QUẢN SINH KHỐI CHỦNG GIỐNG Lựa chọn tốc độ ly tâm tách sinh khối Canh trường vi khuẩn ly tâm 10 ph với tốc độ khác nhau, kết thể bảng 3.8 Bảng PL-1 Lựa chọn tốc độ ly tâm theo mẻ STT Tốc độ ly tâm (vịng/ph) Số lượng tế bào sót dịch sau ly tâm (CFU/ml) VTCC-B-439 VTCC-B-411 2000 6x108 6x108 3000 5x105 5x105 5000 2x104 2x104 8000 2x104 2x104 Kết Bảng PL-1 cho thấy tốc độ ly tâm từ 5000 trở lên thu hoàn toàn sinh khối Dịch sau ly tâm có màu mơi trường số lượng tế bào vi khuẩn khơng cịn nhiều 104 CFU/ml mật độ tế bào ban đầu 1010CFU/ml Chúng tiến hành kiểm tra vi sinh vật tạp nhiễm trình thao tác (bằng kỹ thuật nhuộm soi cấy kiểm tra môi trường thạch đĩa MRS LB) không phát vi sinh vật tạp nhiễm ngồi chủng ni cấy Như nói, với kỹ thuật ly tâm tốc độ 5000 v/ph 10 ph thu hầu hết sinh khối tế bào vi khuẩn dịch sau lên men Việc tăng tốc độ ly tâm (8000 v/ph) hay kéo dài thời gian ly tâm 15-20 ph không tăng hiệu thu sinh khối tế bào ngược lại phần kết tủa tế bào trở nên bám vào đáy ống ly tâm không tiện cho thu sinh khối cho bước Khi sử dụng thiết bị ly tâm liên tục, sử dụng kết ly tâm theo mẻ với tốc độ ly tâm liên tục 5000 v/ph Kết phân tích lượng tế bào sót dịch sau ly tâm độ nhiễm trình bày Bảng PL-2 Bảng PL.2 Kết ly tâm liên tục STT Chủng vi khuẩn VTCC-B-439 VTCC-B-411 Lượng tế bào sót dịch sau ly tâm (CFU/ml) 5x108 6x108 Độ nhiễm (CFU/ml) 5x103 6x103 Sử dụng thiết bị ly tâm alphalaval tốc độ 5000 v/ph tốc độ dòng chảy 200 lit/h, thu sinh khối đánh giá lượng tế bào sót tạp nhiễm dịch sau ly tâm Kết trình bày bảng cho thấy hầu hết sinh khối vi khuẩn (90%) tách sau 155 ly tâm, với mật độ tế bào ban đầu 109CFU/ml dịch sau ly tâm 108CFU/ml Tuy nhiên phát nhiễm tạp trình ly tâm (trong sinh khối dịch sau ly tâm) với lượng nhỏ (103 CFU/ml) Sự có mặt vi sinh vật nhiễm (Bacillus) với tỷ lệ thấp cao tiêu chuẩn Việt Nam (≤1x103) cho thấy phương pháp ly tâm liên tục không đảm bảo mặt an toàn sản phẩm Nghiên cứu ảnh hưởng chất mang tỷ lệ phối trộn chất mang đến khả sống vi khuẩn Các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu: Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 Lactobacillus casei VTCC-B-411 khơng có bào tử nên việc làm khơ hình thức phun sấy hay đông khô dẫn đến chết bất hoạt tế bào dinh dưỡng tỷ lệ khác Trong nghiên cứu này, chọn kỹ thuật đơng khơ q trình làm khơ lạnh sinh khối vi khuẩn thu sau lên men Dịch sinh khối thu sau bước lọc tiếp tuyến dạng past, việc bổ sung chất mang đạt độ khơ 55-60% có tác dụng bảo vệ tế bào, giảm tỷ lệ chết trình đơng khơ Trong nghiên cứu với tỷ lệ chất mang dịch vi khuẩn 1:1 theo lượng chất khơ 60% Kết q trình đơng khơ mẫu vi khuẩn trình bày bảng 3.10 sau: Kết Bảng PL-3 cho thấy thời gian đông khô không phụ thuộc vào chất mang mà phụ thuộc vào chủng vi khuẩn dao động từ 12-14 h Việc so sánh công thức chất mang tiến hành đồng thời cho chủng với công thức từ 1-6 cho thấy công thức công thức tốt cho chủng vi khuẩn nghiên cứu Với mật độ vi khuẩn dịch ban đầu dao động 109 CFU/ml lượng tế bào chết sau đông khô dao động từ 10 -50 lần Chọn chất mang xem khâu quan trọng cho trình phát triển sản phẩm sinh khối đơng khơ dạng bột Vai trò chất mang bảo vệ hoạt động sống tế bào q trình đơng khơ nhiệt độ âm 30 đến âm 50oC.Thông thường số đường lactose, maltose sữa gầy dùng cho mục đích Trong nghiên cứu này, chúng tơi chọn loại chất mang dextrin, sữa gầy lactose với công thức khác nhau: riêng rẽ (công thức 4, 6) phối trộn (1, 3) Bảng PL-3 Số lượng vi khuẩn sản phẩm sau đông khô với công thức chất mang khác Chủng VTCC-B-439 Công thức Chủng VTCC-B-411 Thời gian (h) Mật độ CFU/g Thời gian (h) Mật độ CFU/g Đánh giá 13 13 13 13 13 13 8x108 5x1010 2x109 3x108 7x108 1x108 12 12 12 12 12 12 1x109 6x1010 1x109 6x108 1x109 6x108 Khá Tốt Khá Kém Khá Kém 156 Kết cho thấy việc phối trộn chất mang nguồn cacbon nitơ (công thức 1, 2, 5) cho kết tốt hẳn dùng nguồn cacbon làm chất mang (4 6) Công thức công thức cho kết tốt với mật độ tế bào vi khuẩn sống đạt từ 10 10 CFU/g (chủng Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 Lactobacillus casei VTCC-B-411) dùng cho nghiên cứu phát triển sản phẩm Nghiên cứu điều kiện bảo quản sinh khối vi khuẩn lactic (dạng bột) Mẫu sau đông khô chia thành phần nhỏ (khoảng 50 g), dán kín giữ điều kiện nhiệt độ khác nhau: -20oC, 4oC nhiệt độ phòng (25-30oC) Kết thể Bảng PL-4 Bảng PL-4 Mật độ vi khuẩn sau thời gian bảo quản điều kiện khác Chủng VTCCB-439 VTCCB-411 ĐK bảo quản (oC) -20 25-30 -20 25-30 Số lượng vi khuẩn (CFU/g) sau thời gian bảo quản (tháng) 7x1010 7x1010 7x1010 6x1010 6x1010 6x1010 7x1010 6x1010 4x1010 6x1010 6x1010 5x1010 7x1010 5x1010 7x109 6x1010 5x1010 2x1010 6x1010 3x1010 2x109 5x1010 4x1010 8x109 6x1010 2x1010 8x108 5x1010 3x1010 3x1010 5x1010 9x109 3x108 5x1010 1x1010 7x108 4x1010 6x1010 8x107 5x1010 8x109 1x108 Kết bảng PL-4 cho thấy điều kiện bảo quản ảnh hưởng lớn đến khả sống sót chủng vi khuẩn chế phẩm Trong tất chủng, điều kiện bảo quản -20oC tốt sau 4oC Trong điều kiện này, số lượng tế bào sống giảm (so với ban đầu) không 10-30 lần Lượng vi sinh vật sống giảm mạnh bảo quản điều kiện nhiệt độ thường, số lượng vi khuẩn sống sót giảm 50-100 lần có trường hợp (Lactobacillus plantarum VTCCB439) giảm 1000 lần Vì vậy, chủng Lactobacillus casei VTCC-B-411 lựa chọn cho nghiên cứu Tóm lại: Thu hồi sinh khối sử dụng phương pháp ly tâm theo mẻ tốc độ 5000 v/ph 10 ph thu hầu hết sinh khối tế bào vi khuẩn dịch sau lên men, thích hợp cho nghiên cứu nhỏ ban đầu phịng thí nghiệm Sử dụng kỹ thuật lọc tiếp tuyến cho hiệu suất thu hồi sinh khối cao từ thể tích lớn dịch sau lên men hạn chế vi sinh vật tạp nhiễm so với phương pháp ly tâm liên tục Sử dụng chất mang lactose sữa gầy theo tỷ lệ 1:1 mang lại hiệu cao đông khô sinh khối chủng vi khuẩn nghiên cứu, mật độ tế bào vi khuẩn sống đạt từ 1010 CFU/g Điều kiện bảo quản sinh khối vi khuẩn tại-20oC cho kết tốt nhất, số lượng tế bào sống đạt 1010CFU/g sau tháng bảo quản./ ******* 157 Phụ lục QUY TRÌNH SẢN XUẤT SINH KHỐI CHỦNG GIỐNG VI KHUẨN Tóm tắt quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn (Hình PL-1) 1.1 Thuyết minh quy trình (a) Chủng vi khuẩn: - Chủng Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 Lactobacillus casei VTCC-B-411 có khả sinh enzym glutamate decarboxylasetạo GABA chè - Các chủng vi khuẩn nghiên cứu, phân loại lưu giữ Bảo tàng giống Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội - Ngoài ra, chủng cịn chủng vi sinh vật an tồn (GRAS) sản phẩm chúng liệt kê vào danh mục chất an toàn dùng thực phẩm Cơ quan quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) cho phép sử dụng (b) Hoạt hóa chủng sản xuất: Các chủng vi khuẩn (Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 vàLactobacillus casei VTCCB-411) giữ glycerol 20% lạnh -80oC hoạt hóa kiểm tra lại độ chủng cách cấy ria đĩa thạch môi trường MRS, thời gian 48 h 35oC Chọn khuẩn lạc riêng rẽ, kiểm tra tế bào kính hiển vi (tế bào chủng Lactobacillusplantarum VTCC-B439 có hình que tế bào Lactobacillus casei VTCC-B-411 có hình que ngắn xếp cặp) đồng thời cấy vào ống nghiệm chứa môi trường MRS, thời gian 48 h 35oC (c) Nhân giống cấp 1: Chủng vi khuẩn (Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 Lactobacillus casei VTCC-B411) từ ống nghiệm cấy vào bình tam giác 250 ml chứa 150 ml mơi trường MT2 dịch thể (pH6) với glutamate 1%, nuôi tĩnh 35oC Sau 8-12 h, kiểm tra độ tinh cách cấy ria vào môi trường thạch MT2 Sau 20- 24 h, lấy ml dịch nuôi kiểm tra mật độ tế bào máy đo quang phổ bước sóng 600 nm Mật độ tế bào đạt OD600 ≥ 2.5(≥1010 cfu/ml) Đồng thời quan sát khuẩn lạc đĩa thạch cấy (d) Nhân giống cấp II thiết bị lên men lít Cấy 5% giống cấp (nuôi 20-24 h) chủng vi khuẩn (Lactobacillus plantarum VTCC-B439 Lactobacillus casei VTCC-B-411) vào thiết bị lên men lít chứa lít mơi trường MT2(pH6), ni khuấy 30 vòng/ph 35oC Sau 8-12 h, kiểm tra độ tinh cách cấy ria vào môi trường thạch MT2 Sau 20-24 h, lấy 1ml dịch nuôi kiểm tra mật độ tế bào máy đo quang phổ bước sóng 600 nm Mật độ tế bào đạt OD600 ≥2,5 (≥1010 cfu/ml) Đồng thời quan sát khuẩn lạc đĩa thạch MT2 cấy 158 Hình PL-1 Sơ đồ quy trình sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic sử dụng lên men chè giàu GABA 159 (e) Nhân giống cấp III thiết bị lên men 30 lít: Cấy 5% giống cấp (nuôi 20-24 h) chủng vi khuẩn (Lactobacillus plantarumVTCC-B439 Lactobacillus casei VTCC-B-411) vào thiết bị lên men 30 lít chứa 20 lít mơi trường MT2 (pH6), ni khuấy 30 vịng/ph, 35oC Sau 8-12 h, kiểm tra độ tinh cách cấy ria vào môi trường thạch MT2 Lấy 1ml dịch nuôi kiểm tra mật độ tế bào máy đo quang phổ bước sóng 600 nm sau 20-24 h Mật độ tế bào đạt OD600 ≥2,5 (≥1010 cfu/ml) Đồng thời quan sát khuẩn lạc đĩa thạch MT2 cấy (g) Lên men thiết bị 300 lít: Cấy 5% giống cấp (nuôi 20-24 h) chủng vi khuẩn (Lactobacillus plantarumVTCC-B439 Lactobacillus casei VTCC-B-411) vào thiết bị lên men 300 lít chứa 200 lít mơi trường MT2(pH6), ni khuấy 50 vòng/ph 35oC Sau 8-12 h, kiểm tra độ tinh cách cấy ria vào môi trường thạch MRS Lấy 1ml dịch nuôi kiểm tra mật độ tế bào máy đo quang phổ bước sóng 600 nm sau 24 h Mật độ tế bào đạt OD600 ≥2,5 (≥1010 cfu/ml) Đồng thời quan sát khuẩn lạc đĩa thạch MT2 cấy (h) Cô đặc tế bào: Dịch nuôi chủng vi khuẩn từ thiết bị lên men 300 lít lọc qua thiết bị lọc tiếp tuyến xuống 1/20 để thu tế bào thời gian 125-160 ph, thu khoảng 8-10 lít dịch tế bào (i) Trộn chất mang đông khô: Mẫu sau trộn tủ vô trùng, sử dụng chất mang lactose sữa gầy theo tỷ lệ 1:1, đưa vào thiết bị đông khô từ 12-14 h, đến độ ẩm 6-8% Sản phẩm sau làm khô đem nghiền nhỏ thành dạng bột mịn Lấy mẫu để kiểm tra mật độ vi sinh vật sống (đạt > 1010 CFU/g với hai chủng LactobacillusplantarumVTCC-B-439 Lactobacillus casei VTCC-B-411) mức độ vi sinh vật tạp nhiễm dựa theo TCVN (k) Đóng gói bảo quản: Sản phẩm dạng bột chủng VTCC-B-439 chủng VTCC-B-411 đạt mật độ yêu cầu, đóng gói bao tráng nhơm bao plastic kín, tránh ánh sáng Tùy vào mục đích sử dụng, đóng túi 100 - 500g Chế phẩm bảo quản tủ - 20oC Chế phẩm bảo quản 06 tháng, số lượng vi sinh vật đạt ≥ 3x1010 CFU/g Sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic sử dụng lên men chè giàu GABA Từ quy trình sản xuất sinh khối, chúng tơi tiến hành lên men sản xuất 10 mẻ thu sinh khối vi khuẩn Sau mẻ sản xuất, kiểm tra số lượng tế bào chủng vi khuẩn lactic độ mẻ lên men Kết thể Bảng PL-5 Kết bảng PL-5 cho thấy quy trình sản xuất sinh khối chủng vi khuẩn lactic có tính khả thi có độ ổn định cao mẻ Dựa vào khối lượng sinh khối thu mẻ độ mẻ thu hồi cho thấy quy trình mà chúng tơi xây dựng phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam 160 Bảng PL-5 Kết lên men vi khuẩn lactic Mẻ sản xuất Khối lượng sinh khối (g) Độ (%) Mật độ CFU/ml trước thu sinh khối Mẻ 148.5 98.9 4.1010 Mẻ 149.4 99.2 2,1.1010 Mẻ 152.7 98.7 5.1010 Mẻ 153.3 98.6 7.1010 Mẻ 151.8 98.2 4.1010 Mẻ 144.3 98.7 1,9.1010 Mẻ 151.2 98.8 4.1010 Mẻ 148.2 99.2 5.1010 Mẻ 152.4 98.6 6.1010 Mẻ 10 154.2 98.6 6.1010 ******* 161 Phụ lục MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM VÀ SẢN PHẨM Keo Am Tích Phúc Vân Tiên Kim Tuyên Trung Du Hình PL4.1 Chè nguyên liệu dùng nghiên cứu luận án 162 Hình PL4.2 Phòng chế biến chè (trái) thiết bị chè (phải) Hình PL4.3 Phun trộn chè với dịch thể chủng giống vi khuẩn để lên men 163 Hình PL4.4 Chè sau lên men yếm khí kết hợp lên men vi khuẩn lactic Hình PL4.5 Hoạt động chuẩn bị mẫu nước chè để đánh giá cảm quan chất lượng 164 Hình PL4.6 Chè thành phẩm thí nghiệm bảo quản túi PE Hình PL4.7 Sản phẩm chè giàu GABAthành phẩm Hình PL4.8 Sản phẩm chè giàu GABA tham gia hội chợ 165