kỹ thuật phân tích sinh hóa

kỹ thuật phân tích sinh hóa

KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA

CÂU 1 NHỮNG CHẤT LÀM KẾT TỦA PROTEIN VÀ THU ĐƯỢC KẾT TỦA

Phương pháp tủa được sử dụng tương đối rộng rãi để thu nhận các phân tử sinh học mà nhất là protein Để tủa, người ta có thể dùng nhiều cách khác nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa protein

1 Tủa bằng muối

Đây là cách phổ biến để tủa protein Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối…

Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in) Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out)

Đầu tiên, giả thuyết salting in ở nồng độ muối thấp được giải thích bởi Debye - Huckel Trong dung dịch, protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang điện tích trái dấu Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung môi, làm giảm các phân tử protein không mang điện tích, do đó làm tăng tính tan của protein trong dung môi Giả thuyết của Debye – Huckel cho rằng: tính tan của protein được biểu diễn bằng một hàm logarit, giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion trong dung dịch

Thuật ngữ salting out trong môi trường có nồng độ muối cao được giải thích bởi Kirkwood Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình Solvate hóa, giảm tính hòa tan của protein dẫn đến sự tủa

Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn:

log S = B - KI

Trong đó

S: độ hòa tan của protein

B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ)

K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có trong dung dịch) I: cường độ ion của muối

Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối:

Hình 1 Độ tan theo nồng độ muối (http://sosnick.uchicago.edu/precpsalt.html)

Những đường biểu diễn khác nhau tùy theo từng protein khác nhau Vì thế, khi muốn tách

1 protein từ một hỗn hợp gồm nhiều protein khác nhau, ta có thể lựa chọn nồng độ muối thích hợp sao cho phù hợp nhất với protein mục tiêu

Độ dốc của đường salting out mô tả ở trên phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng

độ muối, không phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tử của protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống

Hiệu quả tủa protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate

2 Tủa protein bằng các dung môi hữu cơ

Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi của môi trường giảm xuống Công thức biểu diễn mối quan hệ giữa độ hòa tan và hằng số điện môi:

ln (S/Sw) = (A/RT) (1/Dw - 1/D)

Trong đó

S: độ hòa tan của protein trong dung môi hữu cơ

Sw: độ hòa tan của protein trong nước

D: hằng số điện môi của môi trường sau khi đã bổ sung dung môi hữu cơ vào

Dw: hằng số điện môi của nước

R: hằng số khí

T: nhiệt độ tuyệt đối

A: hằng số khí

Công thức trên cho thấy: khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa Tuy nhiên, các dung môi hữu

cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp (mặc dù một số dung môi như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl Sulfoxide (DMSO) và Ethanol có thể được sử dụng ở nồng độ cao

3 Tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện

Khi thay đổi pH của môi trường, mức độ tủa của protein cũng thay đổi Ở pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton) Ở giá trị pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H+) Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không tích điện Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác với môi trường, khi đó, các phân

tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường Hiện tượng này được giải thích bằng phương trình Cohn

Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2 protein khác nhau thay đổi theo pH

Hình 2 Tỷ lệ protein tủa theo pH (http://sosnick.uchicago.edu/precpph.html

)

Phương pháp này thường dùng cho các protein đậu nành (có điểm đặng điện khoảng 4.6)

4 Tủa protein bằng các non – ionic polymer

Phương pháp này được thực hiện bằng cách cho thêm non – ionic vào trong dung dịch protein Khi thêm vào, số lượng các phân tử nước có thể tương tác được với protein giảm xuống Người ta thường sử dụng dextrans và polyethylen glycols

µi = µi0 + RT (ln mi + fii mi + fij + mj)

Trong đó

µi0: điện thế hóa học chuẩn của phần tử i

µi: điện thế hóa học của phần tử i

R: hằng số khí

T: nhiệt độ tuyệt đối

mi, mj: nồng độ molar của phần tử i và j

fii: hệ số tương tác của phần tử i

fij: hệ số tương tác giữa phần tử i và j

Khi protein tồn tại ở nồng độ cao, hay pH môi trường vượt ra ngoài điểm đẳng điện mới xảy ra quá trình tương tác giữa các cấu tử trong protein

Muốm thêm loại non – ionic polymer nào vào trong dung dịch protein tùy thuộc vào trọng lượng phân tử của protein đó Cũng tương tự như tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện Tại 1 giá trị pH nào đó (sau khi thêm non – ionic polymer) thì khả năng hòa tan của protein cũng giảm xuống Các ion non – ionic polymer thường sử dụng là các dung môi hữu cơ như Ethanol hay Acetone Các dung môi khác ít sử dụng vì khó thao tác và có thể gây biến tính protein

Chú ý:

- Nhiệt độ thấp làm tăng hiệu quả tủa và giảm sự biến tính protein

- Nồng độ ion: 0.05 – 0.2

- Đối với chất tan có trọng lượng phân tử càng cao thì lượng dung môi cần cho quá trình tủa càng ít Theo Scopes (1982), khi bắt đầu tủa protein bằng Acetone, nên tuân theo công thức sau:

[(v/v)%] = 1.8 - 0.12 ln [MW]

Trong đó

(v/v)% là thể tích dung môi cần cho quá trình tủa – tính theo %

MW: trọng lượng phân tử của chất tan

Nếu trong hỗn hợp có sự hện diện của 2 protein, tính tan của protein này sẽ giảm vì sự hiện diện của protein kia

Thuận lợi của phương pháp tủa bằng cách sử dụng non – ionic polymers là protein sản phẩm bền, và có thể sử dụng ở nhiệt độ phòng

5 Tủa bằng ion kim loại

Trong phương pháp tủa này, ion kim loại sẽ gắn với một phần của phân tử protein Thuận lợi của phương pháp này là có thể tủa được protein trong một dung dịch rất loãng Các ion kim loại có thể chia làm ba nhóm Các ion như Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ và Cd2+ sẽ gắn chặt vào các acid carboxylic và các hợp chất có chứa nitrogen Các ion như Ca2+, Ba2+,

Mg2+ và Pb2+ sẽ gắn với nhóm chức acid carboxylic Các ion như Ag2+, Hg2+, và Pb2+ sẽ gắn chặt với các nhóm có chứa lưu huỳnh

MỘT SỐ PROTOCOL THAM KHẢO

Tủa protein bằng acetone

1 Làm lạnh acetone xuống – 200C

2 Chuyển mẫu protein vào trong các tube eppendorff thích hợp

3 Thêm 4 lần thể tích acetone lạnh vào tube

4 Vortex, ủ ở - 200C trong 60 phút

5 Ly tâm ở 13.000 – 15.000 x g trong vòng 10 phút

6 Cẩn thận loại bỏ dịch nổi Tránh chạm tới phần cặn protein

(Nếu muốn loại bỏ hoàn toàn các chất tạp nhiễm, có thể lặp lại các bước từ 2 – 6) trước khi tiến hành bước 7)

7 Để cho acetone bay hơi tự do ở nhiệt độ phòng trong vòng khoảng 30 phút

Tủa bằng Acetone/TCA (Trichloroacetic acid)

1 Chuẩn bị dung dịch TCA 10% trong aceton Bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng

2 Thêm 10 thể tích TCA 10% trong acetone vào mẫu Vortex Ủ ở - 200C ít nhất 3h (tốt nhất nên ủ qua đêm)

3 Ly tâm ở 15 000 x g trong 10 phút Loại bỏ dịch nổi

4 Thêm 1 thể tích acetone lạnh ( - 200C) Vortex Để ở - 200C ít nhất 10 phút

5 Ly tâm 15000 x g trong 5 phút Loại bỏ dịch nổi

6 Để cặn khô tự nhiên trong không khí

Tủa bằng TCA/DOC (Deoxycholate)

1 Chuẩn bị dung dịch DOC 2%

2 Trộn mẫu với DOC 2% theo tỉ lệ 1/1000 Ủ trên đá 30 phút

3 Thêm TCA 100% vào mẫu sao cho nồng độ cuối cùng của TCA là 15% Vortex ngay (để tránh các khối tủa lớn hình thành có thể manh theo các phần tử tạp nhiễm)

4 Để yên ít nhất 1h Tốt nhất là ủ qua đêm

5 Ly tâm 15 000 x g trong 10 phút Loại bỏ dịch nổi có chứa TCA và các chất tạp nhiễm

6 Thêm Ethanol lạnh hay Acetone lạnh vào cặn để rửa

7 Vortex kỹ cho cặn tan hoàn toàn Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

8 Ly tâm 15 000 x g trong 10 phút Cẩn thận loại bỏ dịch nổi

9 Lặp lại bước rửa, ly tâm, loại dịch nổi

10 Làm khô cặn

Tủa bằng Chloroform/Methanol

1 Thêm 4 thể tích Methanol vào mẫu Vortex kỹ

2 Thêm 1 thể tích Chloroform Vortex

3 Thêm 3 thể tích nước Vortex

4 Ly tâm 15 000 x g trong 2 phút (Lúc này, protein có thể còn trên phần dịch nổi) Loại đi phần nước ở lớp trên

5 Thêm 4 thể tích Methanol Vortex

6 Ly tâm 15 000 x g trong 2 phút Cẩn thận loại bỏ hoàn toàn dịch nổi Tránh chạm đến phần cặn

7 Làm khô mẫu bằng buồng hút chân không hay bằng không khí

CÂU 2 TRANG THÁI VẬT LÝ HÒA TAN CỦA PROTEN

Khi hoà tan protein thành dung dịch keo thì nó không đi qua màng bán thấm

Hai yếu tố đảm bảo độ bền của dung dịch keo:

• Sự tích điện cùng dấu của các protein

• Lớp vỏ hidrat bao quanh phân tử protein

Có 2 dạng kết tủa: kết tủa thuận nghịch va không thuận nghịch:

• Kết tủa thuận nghịch: sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein

vẫn có thể trở lại trạng thái dung dịch keo bền như ban đầu

• Kết tủa không thuận nghịch: là sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì

protein không trở về trạng thái dung dịch keo bền vững như trước nữa

CÂU 3.TRANG THÁI KEO LÀ GÌ??????????

Sol, còn gọi là dung dịch keo, là một hệ phân tán các hạt rắn kỵ dung môi có kích

thước từ 1 đến 1000 nanômét trong một chất lỏng, có thể được tạo thành từ một huyền phù hay bằng cách hóa đặc Các kỹ thuật huyền phù bao gồm cả việc nghiền nát chắt rắn trong một máy nghiền Hóa đặc hay các phương pháp kết tủa dùng chất kết tủa (muối) hay thay đổi nhiệt độ để các hạt keo chuyển từ trạng thái dung dịch sang trạng thái hệ keo Người ta dùng các chất tạo huyền phù để tăng độ bền cho sol

a) Khái niệm và phân loại hệ keo Các chất tồn tại dưới dạng các hạt có kích thước khác

nhau Một số hạt như hạt cát có thể nhìn thấy bằng mắt thường; một số khác như các tế bào

vi khuẩn không thể nhìn thấy bằng mắt thường nhưng có thể quan sát thấy nhờ kính hiển vi quang học; với các kính hiển vi chuyên dụng hiện đại có thể phát hiện được cả nguyên tử

Người ta định nghĩa Các hạt có kích thước hơn phân tử và ion nhưng không đủ lớn để có

thể quan sát được bằng kính hiển vi quang học được gọi là các hạt keo

Hạt keo là một hệ phức tạp tạo nên bởi một số lượng lớn khoảng từ nguyên tử,

Hạt keo có thể là chất vô cơ hay hữu cơ Hầu như tất cả các chất đều có thể tồn tại ở dạng keo

Một hệ keo luôn luôn bao gồm các hạt keo gọi là chất phân tán và một chất làm môi trường phân tán Môi trường phân tán quan trọng thường gặp là nước và không khí

b) Tính chất của hệ keo

Các hệ keo có tính chất tương tự như dung dịch Các hạt keo không tách ra khỏi hệ như các hạt có kích thước lớn khác, và có thể xuyên qua được giấy lọc Tuy nhiên tốc độ khuếch tán của các hạt keo trong hệ chậm hơn tốc độ khuếch tán của các hạt trong dung dịch như phân tử và ion

Sự tán xạ ánh sáng cũng là một thuộc tính quan trọng của hệ keo Khi chiếu ánh sáng đi qua một hệ keo ta có thể quan sát đường đi của chùm sáng từ mặt bên thẳng góc với phương truyền của chùm sáng Ðây là hiệu ứng Tyndall được dùng để phân biệt hệ keo với dung dịch

Ðộ tăng nhiệt độ sôi, độ hạ nhiệt độ đông đặc, độ giảm áp suất hơi và áp suất thẩm thấu cũng phụ thuộc vào các hạt keo có trong hệ

Do kích thước nhỏ nên các hạt keo có tỷ lệ bề mặt lớn so với thể tích của hạt keo nên các hạt keo có khả năng hoạt động bề mặt lớn, chúng có khả năng hấp thụ các phân tử và ion

có mặt trong hệ

CÂU 4.TAO KO BIẾT??????

CÂU 5.HIỆN TƯỢNG PHÂN LỚP????//

+ Chất này không phải là dung môi để hòa tan chất kia +Khối lựong riêng hai chất lỏng không tương đương với nhau

CÂU 6.TAO KO BIẾT??????

CÂU 7.TÁCH CHIẾT KEO DNA VÀ PROTEIN BẰNG CHẤT GÌ LÀ TỐT????/ DNA

Một số hoá chất thông dụng dùng trong tách chiết axít nucleic

Ni tơ lỏng: Thông thường để phá màng/vỏ tế bào chúng ta phải dùng nitơ lỏng, vì

+ Làm cho màng bị cứng giòn, dễ bị vỡ khi nghiền + Và ni tơ lỏng giữ cho mẫu ở trạng thái lạnh, trạng thái mà các enzym phá huỷ axít nucleic không hoạt động cho tới khi chúng bị ức chế bằng hoá chất Một số qui trình sử dụng vật liệu đông khô, bởi vật liệu đông khô dễ phá vỡ màng hơn, mặt khác sử dụng vật liệu đông khô không cần giữ mẫu ở trạng thái lạnh, vì trong môi trường khô tuyệt đối các ezim phá huỷ axít nucleic cũng vô tác dụng

EDTA: Khi màng bị phá vỡ, một loạt các chất đựơc giải phóng ra dung dịch,

trong số chúng có các loại emzim thuỷ phân axít nucleic thành những mảnh vụn, bởi vậy cần phải ức chế sự hoạt động của enzym này bằng EDTA Các ion hoá trị hai như:

Mg2+ và Ca2+.v.v rất cần thiết cho sự hoạt động của enzym thuỷ phân axít nucleic Nếu trong dung dịch có EDTA, chất này sẽ liên kết với các ion hoá trị hai nói trên, liên kết này dẫn tới sự ức chế hoạt động của enzym thuỷ phân axít nucleic, do vậy mà axít

Tris: Axít nucleic còn bị ảnh hưởng rất lớn bởi độ axít và kiềm của dung dịch sử

dụng trong tách chiết, axít có thể làm cho axít nucleic bị gãy, chẳng hạn axít clohydric (HCl) làm cho ADN bị đứt ở những vị trí purin, trong khi đó nếu ở nồng độ kiềm cao thì ADN sẽ bị tách thành sợi đơn Để loại trừ ảnh hưởng của axít và kiềm người ta đã

sử dụng Tris để điều chỉnh pH của dung dịch

CTAB (Cetryl Ammonium Bromide): Là hoá chất dùng trong chiết suất axít

nucleic có hiệu quả cao và đang được sử dụng phổ biến hiện nay CTAB dung dịch là một dung môi có khả năng hoà tan cao axít nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết axít nucleic Để tăng hiệu quả hoạt động của CTAB, mẫu đựơc xử lý với nhiệt khoảng từ 55OC đến 65OC Ở nhiệt độ như vậy, nó còn có tác dụng làm rách thêm màng tế bào và màng nhân để giải phóng tối đa lượng axít nucleic ra dung dịch và làm biến tính một số protein, đặc biệt là enzym thuỷ phân

axít nucleic.

Chloroform: Trong dung dịch tách chiết, ADN tạo thành liên kết với CTAB, để

loại bỏ CTAB và đồng thời làm biến tính protein trong dung dịch cần sử dụng chloroform Sau đó dung dịch tách chiết được ly tâm, loại bỏ các tạp chất (bị kéo xuống phần phía dưới ống nghiệm) còn lại axít nucleic hoà tan trong lớp dung dịch nằm phía trên và được chuyển sang một ống nghiệm mới

Ethanol thường được dùng trong môi trường dung dịch có lực ion, hay nồng độ muối cao, trong điều kiện như vậy axít nucleic dễ dàng bị kết tủa, sự kết tủa của axít nucleic sẽ đạt hiệu quả cao hơn nếu như được xử lý trong môi trường lạnh Isopropanol được dùng để kết tủa axít nucleic trong môi trường không cần có muối, tỷ lệ lượng isopropanol/mẫu theo thể tich là: 1/1 Sử dụng isopropanol có ưu việt

là các axít nucleic có trọng lượng phân tử thấp như: những mảnh gãy ADN hoặc ARN.v.v sẽ không bị kết tủa và chúng dễ dàng bị loại bỏ cùng dung dịch

Enzym RNnase và enzym Dnase: Khi kết tủa sẽ thu được axít nucleic gồm: ADN

Nếu mục tiêu là thu ADN, chúng cần phải loại bỏ ARN Để loại bỏ ARN, ta dùng enzym RNase Enzym RNase sẽ cắt ARN thành những mảnh vụn, do vậy sau khi

ly tâm ADN lắng tủa và được giữ ở đáy ống nghiệm, còn những mảnh vụn ARN vẫn nằm trong dung dịch, bởi vậy khi loại bỏ dung dịch thì ARN cũng bị loại bỏ theo Ngược lại nếu cần loại bỏ ADN, chúng ta dùng enzym DNase, cũng tương tự như việc loại bỏ ARN, ADN sẽ bị cắt vụn bởi DNase và chúng cũng bị loại bỏ cùng

Nước cất và TE: Axít nucleic có thể đựơc hoà tan trong nước cất khử trùng hoặc

dung dịch TE Axít nucleic sẽ được bảo quản tốt hơn, nếu nó được hoà tan trong dung dịch TE, vì dung dịch này chứa Tris và EDTA

PROTEIN

80%, Aceton)

Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch Nhìn chung, những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường Do đó,

độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng

số điện môi hiện hữu của môi trường Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nước như aceton vào dung dịch chứa protein Sự tủa bằng aceton hoặc ethanol 80% có nhiều thuận lợi hơn vì nó tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh

khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzym, do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió

II Phương pháp tủa bằng muối

này vừa làm trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng

CÂU 8.TÍNH CHẤT CỦA PHÂN TỬ

Háo nước,ưa nước Kị nước.tao ko biết

CÂU 9.TAO KO BIẾT??????

CÂU 10.TRÍCH LY CÁM LẤY VITAMIN A?????????/

CÁM GẠO

(Bran rice)

I Giới thiệu

Trong qui trình xay xát và chế biến gạo, sau khi thu được sản phẩm chính là gạo thì còn một sản phẩm phụ có giá trị khá cao đó là cám gạo Từ lâu cám gạo được các nhà máy xay xát thu hồi và bán như là một sản phẩm chính chỉ sau gạo Cám được thu hồi dưới hai dạng

là cám khô và cám ướt Cám khô sẽ được sấy thêm lần nữa để bảo quản được lâu hơn, còn cám ướt thường được bán cho các cơ sở nuôi cá da trơn sữ dụng ngay

+ Cấu tạo và thành phần cám gạo:

Hình: Sơ đồ lớp cám trong hạt lúa

Cám gạo thường có dạng bột, mềm và mịn Cám gạo chiếm khoảng 10-12% khối lượng lúa chưa xay xát Cám là hỗn hợp của lớp vỏ ngoài của hạt gạo và lớp aloron Những thành phần được thu hồi khi khi xay xát và chế biến gạo và được gọi chung là cám

+ Thành phần dinh dưỡng của cám gạo:

Thành phần Khối lượng/100g

- Calori

- Tổng số lipit

316 KJ 21g