Phân lập vi khuẩn bacillus sp và khảo sát khả năng sinh polymer

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP - TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus sp VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH POLYMER NGUYỄN KIM NGÂN AN GIANG, THÁNG 05 NĂM 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus sp VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH POLYMER NGUYỄN KIM NGÂN MSSV: DSH173259 GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN Ths VƢƠNG BẢO NGỌC AN GIANG, THÁNG 05 NĂM 2021 CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG Đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus sp khảo sát khả sinh polymer”, sinh viên Nguyễn Kim Ngân thực hướng dẫn Ths Vương Bảo Ngọc Phản biện Phản biện Ths Bằng Hồng Lam Ths Lý Thị Thanh Thảo Giáo viên hƣớng dẫn Ths Vương Bảo Ngọc I LỜI CẢM TẠ Trong suốt trình học tập năm vừa qua để đạt thành tích tốt học tập, em ln nhận quan tâm, giúp đỡ tận tình q thầy hỗ trợ lẫn anh chị tập thể lớp DH18SH Tạo cho em môi trường học tập thoải mái, sáng tạo Vì xin cho phép em trân trọng gửi lời biết ơn tình cảm cao q Trước tiên em xin gởi lời tri ân sâu sắc cảm ơn ba mẹ chăm sóc, quan tâm em, ln động viên, hỗ trợ kinh phí giúp đỡ em nhiều suốt trình học tập Chân thành cảm ơn Đồn Thị Minh Nguyệt Vương Bảo Ngọc người ln dẫn dắt, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt thời gian thực đề tài Em xin cảm ơn quý thầy cô môn Công Nghệ Sinh Học, khoa Nông Nghiệp - Tài Nguyên Thiên Nhiên, Trường Đại Học An Giang tạo điều kiện giúp đỡ cho em việc trang bị đầy đủ kiến thức cho chuyên ngành, kỹ sống làm việc khác Nhờ hành trang quý báo q thầy mà em vận dụng vào thực hành để hồn thành tốt đề khóa luận Chân thành cám ơn thầy cơ, cán phụ trách phịng thí nghiệm thuộc Khoa Nơng Nghiệp - Tài Nguyên Thiên Nhiên giúp đỡ, hỗ trợ suốt thời gian tiến hành thí nghiệm Cuối xin cảm ơn tất bạn sinh viên lớp DH18SH, người đồng hành, động viên, góp ý kiến chân thành, bổ cho em; em học tập, làm việc, sáng tạo; đồng hành kể hoạt động vui chơi, giải trí trường An Giang, ngày 25 tháng 05 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Kim Ngân II TÓM TẮT Với mục tiêu tìm dịng vi khuẩn Bacillus sp có khả tổng hợp polymer tốt nhất, tạo tiền đề sản xuất nhựa sinh học, giảm thiểu tác hại mơi trường Vì vậy, đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus sp khảo sát khả sinh polymer” thực Kết phân lập dòng vi khuẩn Bacillus sp từ đất thu huyện Vĩnh Thạnh - TP Cần Thơ Tất dòng có khả tổng hợp polymer dạng exopolysaccharide Khảo sát khả tổng hợp exopolysaccharide, nồng độ muối 0,5% ủ nhiệt độ 35 0C thời gian 48 h điều kiện tối ưu để vi khuẩn Bacillus sp sinh tổng hợp nên exopolysaccharide Dòng BC3 cho kết cao với khối lượng exopolysaccharide 2,25 g/L, dòng BC1 tổng hợp 1,87 g/L exopolysaccharide cuối dòng BC2 tổng hợp exopolysaccharide thấp có 1,00 g/ L Từ khóa: Vi khuẩn Bacillus sp.; Polymer; Exopolysaccharide III LỜI CAM KẾT Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu công trình nghiên cứu có xuất xứ rõ ràng Những kết luận khoa học cơng trình nghiên cứu chưa công bố công trình khác An Giang, ngày 25 tháng 05 năm 2021 Người thực Nguyễn Kim Ngân IV MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i LỜI CAM KẾT iii MỤC LỤC iii CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .2 2.1.1 Những nghiên cứu nước 2.1.2 Những nghiên cứu nước 2.2 LƯỢC KHẢO VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.2.1 Khái niệm polymer sinh học 2.2.2 Lịch sử phát triển polymer sinh học 2.2.3 Sự khác polymer truyền thống polymer sinh học 2.2.4 Các loại polymer sinh học 2.2.5 Tác nhân gây phân hủy sinh học 2.2.6 Ưu nhược điểm polymer sinh học 2.2.7 Ứng dụng polymer sinh học đời sống 2.3.8 Vi khuẩn Bacillus sp 10 2.3.8.1 Sơ lược vi khuẩn Bacillus sp 11 2.3.8.2 Đặc điểm sinh học Bacillus sp 12 2.3.8.2.1 Phân loại 12 2.3.8.2.2 Đặc điểm hình thái phân bố tự nhiên 13 2.3.8.2.3 Đặc điểm di truyền 14 2.3.8.2.4 Đặc điểm sinh hóa 15 2.3.8.2.5 Đặc điểm sinh trưởng sinh sản 15 2.3.9 Ứng dụng Bacillus sp 17 CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 MẪU NGHIÊN CỨU 20 V 3.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 20 3.3 CÔNG CỤ NGHIÊN CỨU 20 3.3.1 Môi trường 20 3.3.2 Hóa chất 20 3.3.3 Dụng cụ 20 3.3.3.1 Hóa chất 20 3.3.3.2 Môi trường 20 3.4 TIẾN TRÌNH NGHIÊN CỨU 20 3.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập định danh sơ chủng vi khuẩn Bacillus sp 20 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối thời gian ủ đến phát triển vi khuẩn Bacillus sp 21 3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ ủ thời gian ủ đến phát triển vi khuẩn Bacillus sp 24 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 VI DANH SÁCH HÌNH Hình : Vi khuẩn Bacillus sp 25 Hình : Khuẩn lạc mơi trường TSA 27 Hình : Khuẩn lạc mơi trường TSB 26 Hình : Kuẩn lạc môi trường giá đậu- peptone 28 Hình : Quá trình sinh sản Bacillus sp 29 Hình : Dịng vi khuẩn BC1 44 Hình : Dịng vi khuẩn BC2 44 Hình : Dòng vi khuẩn BC3 44 Hình : Nhuộm Gram vi khuẩn BC1 46 Hình 10 : Nhuộm Gram vi khuẩn BC2 46 Hình 11 : Nhuộm Gram vi khuẩn BC3 46 Hình 12 : Nhuộm bào tử vi khuẩn BC1 47 Hình 13 : Nhuộm bào tử vi khuẩn BC2 47 Hình 14 : Nhuộm bào tử vi khuẩn BC3 47 Hình 15 : Catalase vi khuẩn BC1 48 Hình 16 : Catalase vi khuẩn BC2 48 Hình 17 : Catalase vi khuẩn BC3 48 Hình 18 : Kết test sinh hóa 49 Hình 19 : Kết đếm mật số dòng vi khuẩn BC1 nồng độ muối 0,25 %, 0,5 %, 1% 52 Hình 20 : Kết đếm mật số dịng vi khuẩn BC2 nồng độ muối 0,25 %, 0,5 %, 1% 53 Hình 21 : Kết đếm mật số dòng vi khuẩn BC3 nồng độ muối 0,25 %, 0,5 %, 1% 54 Hình 22 : Khối lượng Exopolysaccharide thu dòng vi khuẩn BC1 24 h, 48 h, 72 h nồng độ muối 0,25 %, 0,5 % % 53 Hình 23 : Khối lượng Exopolysaccharide thu dòng vi khuẩn BC2 24 h, 48 h, 72 h nồng độ muối 0,25 %, 0,5 % % 55 Hình 24 : Khối lượng Exopolysaccharide thu dòng vi khuẩn BC3 24 h, 48 h, 72 h nồng độ muối 0,25 %, 0,5 % % 56 Hình 25 : Kết đếm mật số dịng vi khuẩn BC1 32 Hình 26 : Kết đếm mật số dòng vi khuẩn BC2 33 Hình 27 : Kết đếm mật số dòng vi khuẩn BC3 34 VII Hình 28 : Khối lượng Exopolysaccharide thu dòng vi khuẩn BC1 24 h, 48 h, 72 h nhiệt độ ủ 60 0C, 45 0C, 35 0C 60 Hình 29 : Khối lượng Exopolysaccharide thu dòng vi khuẩn BC2 24 h, 48 h, 72 h nhiệt độ ủ 60 0C, 45 0C, 35 0C 62 Hình 30 : Khối lượng Exopolysaccharide thu dòng vi khuẩn BC3 24 h, 48 h, 72 h nhiệt độ ủ 60 0C, 45 0C, 35 0C 37 Hình 31 : Gia nhiệt mẫu 80 0C, 10 phút 51 Hình 32 : Bố trí thí nghiệm nồng độ muối 0.25 %, 0,5 % % 80 Hình 33 : Bố trí thí nghiệm ủ nhiệt độ 35 0C, 45 0C 60 0C 80 Hình 34: Dịch nuôi cấy tủa protein acid trichloroacetic 30% (TCA)80 Hình 35 : Dịch thu sau ly tâm 81 Hình 36 : Tủa exopolysaccharide ethanol lạnh lần 81 Hình 37 : Hịa tan tủa nước cất 50 oC lần 81 Hình 38 : Tủa exopolysaccharide ethanol lạnh lần 82 Hình 39 : Hòa tan tủa nước cất 50 oC lần 82 Hình 40 : Ly tâm thu Exopolysaccharide 82 Hình 41 : Tiến hành sấy 40 0C thu 83 Hình 42 : Acid trichloroacetic 83 Hình 43 : Cồn lạnh 96 83 VIII Reaff (2005) Identification, Enumeration and confirmation of Bacillus cereus IS 5887(Pt-6):1999 Suresh Mody (2009) "Exopolysaccharides vi sinh vật: Ứng dụng đa dạng tiềm năng" Sản xuất vi sinh vật tạo màng sinh học tiền chất polyme Nhà xuất Caister Staudt C, Horn H, Hempel DC, Neu TR., (2004)."Phép đo thể tích tế bào vi khuẩnvà chất cao phân tử ngoại bào glycoconjugates màng sinh học" Công nghệ sinh học Bioeng , 585–92 Travers RS, Martin PAW and Reichelderfer CF., (1987) Selective process for efficient isolation of soil Bacillus spp Appl Env Microbiol , 53 (6): 1263 – 1266 Trần Linh Thước (2010) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, Nhà xuất Giáo dục, Thành phố Hồ Chí Minh 233 trang TS Hồng Thị Hịa (2018) Tổng hợp polyme phân hủy sinh học ứng dụng hóa học thực phẩm, Đại học Sao Đỏ Trần Bích Lam, Trần Hồng Thảo, Phạm Quang Hiển, Nguyễn Ngọc Sơn, (2003) Nghiên cứu chế tạo màng polyme sinh học, Báo cáo Khoa học - Hội nghị công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB KHKT, Hà Nội, 459 - 462 Trần Cừ (1979) Sinh lý hóa sinh tiêu hóa động vật nhai lại Nhà xuất Khoa học Hà Nội TajAl-Deen W., Al-Kaaby T., Al-Hussaniy A., Jadooh M., (2010) Evaluation of poly hydroxybutyrate (PHB) production by Bacillus cereus, Thesis for Bachelor degree, College of Science Babylon University 1-6 Vaseeharan, B and Ramasamy, P (2003), Control of pathogenic Vibrio spp by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus monodon, Letters in applied microbiology, 36(2), 83–87 Võ Thị Thứ (1996) Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả ứng dụng số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học Walshaw D L., Wilkinson A., Mundy M., Smith M and Poole P S., (1997) Regulation of the TCA cycle and the general amino acid permease by overflow metabolism in Rhizobium eguminosarum, Microbiology, 2209-2221 Yuksekdag Aslim Designated (2006) Production of exopolysaccharide (EPS) and lactic acid with sugarbeet molasses by some lactic acid bacteria,December Yu AC, Loo JF, Yu S, Kong SK, Chan TF., (2014) “Monitoring bacterial growth using tunable resistive pulse sensing with a pore-based technique” Applied Microbiology and Biotechnology 855–62 69 Yoshiharu; Steinbuchel, Alexander, Doi., (2002) Chất tạo học Weinheim, Đức: Wiley-VCH ISBN 978-3-527-30225-3 màng sinh Zaki (2018) Biodegradable Plastic Production by Bacillus spp Isolated from Agricultural Wastes and Genetic Determination of PHA Synthesis Website Internet , 2008: http://www.tailieumoitruong.org/2018/01/ac-tinh-sinh-hoc-cua-vikhuan-bacillus.html Internet , 2008: http://www.tailieumoitruong.org/2018/01/ac-tinh-sinh-hoc-cua-vi- khuan-bacillus.html Internet , 2008: http://www.tailieumoitruong.org/2018/01/ac-tinh-sinh-hoc-cua-vikhuan-bacillus.html Internet , 2008: http://www.tailieumoitruong.org/2018/01/ac-tinh-sinh-hoc-cua-vikhuan-bacillus.html Internet , 2008: https://vi.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis 70 PHỤ LỤC A: CÁC QUY TRÌNH THỰC HIỆN A.1 Phƣơng pháp trữ mẫu giống ống thạch nghiêng Vi khuẩn sau trữ môi trường thạch nghiêng Cách tiến hành: - Chuẩn bị môi trường: Môi trường cho vào ống nghiệm hấp trùng 121 0C 15 phút Sau để nghiêng ống nghiệm - Hơ nóng que cấy vịng cho đỏ que, để que cấy nguội lấy khuẩn lạc (sinh khối vi khuẩn) đĩa petri - Mở nắp ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng cấy truyền vào ống nghiệm - Hơ đầu ống nghiệm, đậy nắp lại, gói lại ủ nhiệt độ phòng 24 - Sau thấy khuẩn lạc phát triển, đem ống thạch nghiêng bảo quản tủ lạnh nhiệt độ – 0C A.2 Phƣơng pháp bảo quản chủng vi khuẩn gốc phƣơng pháp lạnh sâu - Vi khuẩn nuôi cấy môi trường LB lỏng nhiệt độ 30 0C đến 48 - Pha dịch vi khuẩn với glycerol trùng trước để đạt nồng độ cuối 10% mật độ tế bào 106 - Dịch huyền phù vi khuẩn đưa vào eppendoft đóng nắp Tồn mẫu để nhiệt độ phịng 30 phút cân áp suất thẩm thấu tế bào - Đưa mẫu vào tủ đơng để bảo quản - Hoạt hố mẫu: mẫu sau lấy từ tủ đông hoạt hố cách làm tan nhanh tới mức (thông thường đưa vào tủ ấm 37 OC 40-60 giây) 71 B:PHÂN TÍCH THỐNG KÊ B.1 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ muối thời gian ủ đến phát triển vi khuẩn Bacillus sp sản sinh exopolysaccharide Bảng 89: Phân tích ANOVA ảnh hƣởng nồng độ muối thời gian ủ đến Source Sum of Squares Df Mean Square FRatio P-Value Between groups 8,54 26 0,33 90,58 0,00 Within groups 0,20 54 0,00 Total (Corr.) 8,73 80 CV 25,40 mật độ quang dòng vi khuẩn BC1, BC2, BC3 Bảng 20: Phân tích khác biệt mật số theo thời gian ủ nồng độ muối dòng vi khuẩn BC1 Strain_Time Count Mean bc1-24h-1 74,33.106 XXXXXX bc1-72h-0.25 77.106 XXXXX bc1-48h-1 77,33.106 XXXXX bc1-24h-0.25 82,33.106 .XXXXX bc1-72h-1 83.106 .XXXXX bc1-24h-0.5 94,33 106 XXXX bc1-72h-0.5 97,67 106 XXXX bc1-48h-0.25 99,67 106 XXX bc1-48h-0.5 103 106 XXX 72 Homogeneous Groups Bảng 21: Phân tích khác biệt mật số theo thời gian ủ nồng độ muối dòng vi khuẩn BC2 Strain_Time Count Mean Homogeneous Groups bc2-24h-1 62.106 XXXXX bc2-24h-0.25 68,33.106 XXXXX bc2-72h-0.25 74,33.106 XXXXXX bc2-72h-1 74,67.106 XXXXXX bc2-24h-0.5 84,67.106 XXXX bc2-72h-0.5 92.106 XXXX bc2-48h-1 112,67.106 XXX bc2-48h-0.5 125.106 X bc2-48h-0.25 161,67.106 .X Bảng 22: Phân tích khác biệt mật số theo thời gian ủ nồng độ muối dòng vi khuẩn BC3 Strain_Time Count Mean bc3-24h-1 36.106 X bc3-72h-1 45,67.106 XX bc3-72h-0.25 53,67.106 XXX bc3-48h-1 55.106 XXXX bc3-24h-0.25 57.106 XXXX bc3-48h-0.25 72,33.106 73 Homogeneous Groups XXXXXX bc3-72h-0.5 76,33.106 bc3-24h-0.5 83.106 XXXXX bc3-48h-0.5 116,67.106 .XX XXXXXX Bảng 23: Phân tích ANOVA ảnh hƣởng nồng độ muối thời gian ủ đến mật số dòng vi khuẩn BC1, BC2, BC3 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 54290,50 26 2088,09 Within groups 6845,33 54 126,77 Total (Corr.) 61135,80 80 CV 33,32 16,47 P-Value 0,00 Bảng 24: Phân tích anova ảnh hƣởng nồng độ muối thời gian ủ đến phát triển vi khuẩn Bacillus sp 24h Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương F P Main effects A:Strain 0,01 0,00 3,05 0,07 B:Nđm 0,69 0,34 116,73 0,00 AB 0,10 0,02 8,56 0,00 Residual 0,05 18 0,00 Tổng cộng 0,86 26 CV % 9,79 Interactions 74 Bảng 25: Phân tích anova ảnh hƣởng nồng độ muối thời gian ủ đến phát triển vi khuẩn Bacillus sp 48 h Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương F P Main effects A:Strain 1,63 0,81 144,74 0,00 B:Nđm 4,24 2,12 374,50 0,00 AB 1,85 0,46 81,72 0,00 Residual 0,10 18 0,00 Tổng cộng 7,83 26 CV % 4,93 Interactions Bảng 26: Phân tích anova ảnh hƣởng nồng độ muối thời gian ủ đến phát triển vi khuẩn Bacillus sp 72 h Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương F P Main effects A:Strain 0,99 0,49 51,79 0,00 2,86 1,43 149,52 0,00 AB 1,50 0,37 39,18 0,00 Residual 0,17 18 0,00 Tổng cộng 5,53 26 CV % 6,02 B:Nđm Interactions 75 B.2.Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ ủ thời gian ủ đến phát triển vi khuẩn Bacillus sp sản sinh exopolysaccharide Bảng 27: Phân tích ANOVA ảnh hƣởng nhiệt độ ủ thời gian ủ đến mật độ quang dòng vi khuẩn BC1, BC2, BC3 Mean F-Ratio Square Source Sum of Squares Df Between groups 14,80 26 0,57 Within groups 0,18 54 0,00 Total (Corr.) 14,98 80 CV 67,48 174,36 P-Value 0,00 Bảng 28: Phân tích khác biệt mật số theo thời gian ủ nhiệt độ ủ dòng vi khuẩn BC1 Strain_Time Count Mean bc1-24h-60 25.106 X bc1-72h-60 27,33.106 XX bc1-72h-45 29,33.106 XX bc1-24h-45 30,67.106 XX bc1-48h-60 31.106 XX bc1-48h-45 41.106 XXX bc1-72h-35 86,33.106 .XX bc1-48h-35 105.106 X bc1-24h-35 123,33.106 X 76 Homogeneous Groups Bảng 29: Phân tích khác biệt mật số theo thời gian ủ nhiệt độ ủ dòng vi khuẩn BC2 Strain_Time Count Mean Homogeneous Groups bc2-72h-60 23,33.106 X bc2-24h-60 24.106 X bc2-48h-60 34,33.106 XX bc2-24h-45 41,33.106 XXX bc2-72h-45 46,33.106 XXX bc2-48h-45 61,33.106 .XX bc2-24h-35 73,33.106 XX bc2-72h-35 76,33.106 XX bc2-48h-35 96,67.106 XX Bảng 30: Phân tích khác biệt mật số theo thời gian ủ nhiệt độ ủ dòng vi khuẩn BC3 Strain_Time Count Mean Homogeneous Groups bc3-72h-60 22,33.106 X bc3-24h-60 25.106 X bc3-48h-60 31,67.106 XX bc3-72h-45 35,67.106 XX bc3-24h-45 36,67.106 XXX bc3-48h-45 40,67.106 XXX 77 bc3-72h-35 55.106 XX bc3-48h-35 64.106 .XX bc3-24h-35 82,33.106 .XX Bảng 31: Phân tích anova ảnh hƣởng nhiệt độ ủ thời gian ủ đến phát triển vi khuẩn Bacillus sp 24 h Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương F P Main effects A:Strain 0,68 0,34 53,11 0,00 B:Temp 3,04 1,52 235,91 0,00 AB 0,28 0,07 10,88 0,00 Residual 0,11 18 0,00 Tổng cộng 4,13 26 CV % 5,14 Interactions Bảng 32: Phân tích anova ảnh hƣởng nhiệt độ ủ thời gian ủ đến phát triển vi khuẩn Bacillus sp 48 h Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương F P Main effects A:Strain 2,53 1,26 252,88 0,00 B:Temp 3,50 1,75 350,31 0,00 AB 0,48 0,12 24,20 0,00 Residual 0,09 18 0,00 Tổng cộng 6,60 26 Interactions 78 CV % 5,44 Bảng 33: Phân tích anova ảnh hƣởng nhiệt độ ủ thời gian ủ đến phát triển vi khuẩn Bacillus sp 72 h Nguồn biến động Tổng bình phương Độ tự Trung bình bình phương F P Main effects A:Strain 1,43 0,71 139,37 0,00 B:Temp 2,07 1,03 202,02 0,00 AB 0,28 0,07 13,67 0,00 Residual 0,09 18 0,00 Tổng cộng 3,88 26 CV % 7,06 Interactions PHỤ LỤC C: MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM Hình 23: Gia nhiệt mẫu 80 0C, 10 phút 79 Hình 24: Bố trí thí nghiệm nồng độ muối 0.25 %, 0,5 % % Hình 25: Bố trí thí nghiệm ủ nhiệt độ 35 0C, 45 0C 60 0C * Quy t ình chiết exopolysaccharide Hình 26: Dịch ni cấy đƣợc tủa protein acid trichloroacetic 30% (TCA) 80 Hình 27: Dịch thu đƣợc sau ly tâm Hình 28: Tủa exopolysaccharide ethanol lạnh lần Hình 29: Hịa tan tủa nƣớc cất 50 oC lần 81 Hình 17: Tủa exopolysaccharide ethanol lạnh lần Hình 18: Hịa tan tủa nƣớc cất 50 oC lần Hình 19: Ly tâm thu Exopolysaccharide 82 Hình 20: Tiến hành sấy 40 0C thu Exopolysaccharide thơ Hình 22: Cồn lạnh 96 Hình 21: Acid trichloroacetic 83