NGHIÊN CỨU VỀ CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG LĨNH VỰC NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Ngày nay, cuộc sống của con người đang được cải thiện và nâng cao rất nhiều. Do đó, các ý tưởng sử dụng các chế phẩm sinh học ngày càng trở nên phổ biến và đóng một vai trò rất quan trọng trong đời sống của con người. Các sản phẩm được ra đời dựa trên những thành tựu của công nghệ sinh học ngày càng được ưa chuộng và được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: y tế, môi trường, thực phẩm, nông nghiệp...Các chế phẩm sinh học ngày càng có chỗ đứng trên thị trường vì những lợi ích thiết thực của nó đối với con người: dễ sử dụng, chi phí thấp, không gây độc hại với con người và môi trường xung quanh. Trong số đó, các chế phẩm sinh học được tạo ra từ chủng vi khuẩn có lợi Bacillus subtilis đang được con người sử dụng rất rộng rãi trong đời sống dùng làm men vi sinh, xử lý môi trường...Bacillus subtilis là chủng vi khuẩn an toàn và hiệu quả nhất được sử dụng trong công nghệ sinh học. Đặc biệt đối với ngành nuôi trồng thủy sản, chủng vi khuẩn có lợi này giúp tăng sức đề kháng cho tôm cá và tiêu diệt một số vi khuẩn gây bệnh trong đường ruột. Giúp giảm thiểu số lượng vi khuẩn gây bệnh của tôm cá. Việc thêm lợi khuẩn Bacillus subtilis vào men vi sinh sẽ giúp tạo vi khuẩn có lợi cho hệ tiêu hóa và cung cấp nhiều chất dinh dưỡng đồng thời giữ cho hệ thống miễn dịch khỏe mạnh, hấp thụ một số vitamin B2 (riboflavin) giúp cho quá trình chuyển hóa chất dinh dưỡng từ protein, chất béo, carbohydrate thành năng lượng cho tế bào dưới dạng ATP[?]. Hiện nay việc sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis được áp dụng rất phổ biến trong ngành nuôi trồng thủy sản ở nước ta. Bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis cho động vật thủy sản và ao nuôi có thể giúp cải thiện sức khỏe cá, cải thiện môi trường và ức chế mầm bệnh trong ao do đó giúp giảm nguy cơ dịch bệnh. Từ những lợi ích mà chủng vi khuẩn mang lại đối với con người, nhóm đã quyết định lựa chọn đề tài “Nghiên cứu về ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đối với ngành nuôi trồng thủy sản”.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU VỀ CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG LĨNH VỰC NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG MÃ MÔN HỌC: 211301 GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: NGUYỄN VŨ PHONG STT Họ tên MSSV Lớp Võ Thị Bình 17125020 DH17VT Đặng Thị Kim Dung 20125363 DH20VT Phạm Thị Kim Châu 20125340 DH20VT Cù Quốc Bảo 20125327 DH20VT Nguyễn Thị Thu Thủy 17125299 DH17VT DANH SÁCH CÁC BẢNG DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Bộ Test Sera Amomonium Hình 2.2 Kết thí nghiệm (bên trái nước nhiễm NH 3, bên phải nước sau dùng chế phẩm) Hình 2.3 Biểu đồ thể tỷ lệ sống tôm vào cuối chu kỳ Hình 2.4 Tổng số lượng tơm thu hoạch vào cuối chu kỳ ương giai đoạn Hình 2.5 Trọng lượng tơm thu hoạch vào cuối chu kỳ ương giai đoạn .6 Y MỤC LỤC YDANH SÁCH CÁC BẢN ii DANH SÁCH CÁC HÌNH ii PHẦN MỞ ĐẦU PHẦN NỘI DUNG .2 Sơ lược vi khuẩn Bacillus subtilis .2 1.1 Lịch sử phát .2 1.2 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis 2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus subtilis: 2.1 Bacillus subtilis số lợi ích sức khỏe động vật: 2.2 Bacillus subtilis nuôi trồng thủy sản PHẦN KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO .10 iii PHẦN MỞ ĐẦU Ngày nay, sống người cải thiện nâng cao nhiều Do đó, ý tưởng sử dụng chế phẩm sinh học ngày trở nên phổ biến đóng vai trị quan trọng đời sống người Các sản phẩm đời dựa thành tựu công nghệ sinh học ngày ưa chuộng sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực như: y tế, môi trường, thực phẩm, nông nghiệp Các chế phẩm sinh học ngày có chỗ đứng thị trường lợi ích thiết thực người: dễ sử dụng, chi phí thấp, khơng gây độc hại với người môi trường xung quanh Trong số đó, chế phẩm sinh học tạo từ chủng vi khuẩn có lợi Bacillus subtilis người sử dụng rộng rãi đời sống dùng làm men vi sinh, xử lý môi trường Bacillus subtilis chủng vi khuẩn an toàn hiệu sử dụng công nghệ sinh học Đặc biệt ngành nuôi trồng thủy sản, chủng vi khuẩn có lợi giúp tăng sức đề kháng cho tôm cá tiêu diệt số vi khuẩn gây bệnh đường ruột Giúp giảm thiểu số lượng vi khuẩn gây bệnh tôm cá Việc thêm lợi khuẩn Bacillus subtilis vào men vi sinh giúp tạo vi khuẩn có lợi cho hệ tiêu hóa cung cấp nhiều chất dinh dưỡng đồng thời giữ cho hệ thống miễn dịch khỏe mạnh, hấp thụ số vitamin B2 (riboflavin) giúp cho q trình chuyển hóa chất dinh dưỡng từ protein, chất béo, carbohydrate thành lượng cho tế bào dạng ATP[?] Hiện việc sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis áp dụng phổ biến ngành nuôi trồng thủy sản nước ta Bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis cho động vật thủy sản ao ni giúp cải thiện sức khỏe cá, cải thiện môi trường ức chế mầm bệnh ao giúp giảm nguy dịch bệnh Từ lợi ích mà chủng vi khuẩn mang lại người, nhóm định lựa chọn đề tài “Nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ngành nuôi trồng thủy sản” PHẦN NỘI DUNG Sơ lược vi khuẩn Bacillus subtilis 1.1 Lịch sử phát Bacillus subtilis Christian Erenberg phát lần vào năm 1835 sau gọi "Vibrio subtilis" Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho vi khuẩn "Bacterium" Năm 1872 Ferdinand Cohn xác định loại trực khuẩn có đầu vng đặt tên Bacillus subtilis [1] Năm 1957 Henry đồng nghiệp ông phân lập chủng vi khuẩn Bacillus subtilis [2] Từ đó, “Subtilis Therapy” nghĩa “Thuốc Subtilis” đời để điều trị bệnh viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy bệnh đường tiêu hóa Ngày vi khuẩn trở nên phổ biến sử dụng rộng rãi y học, chăn nuôi thực phẩm 1.2 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis 1.2.1 Phân loại Theo sổ tay Bergey (Bergey’s of Systematic Bacteriology) Bacillus subtilis thuộc: giới (Domain): Bacteria, ngành (Phylum): Firmicutes, lớp (Class): Bacilli, (Order): Bacillales, họ (Family): Bacillaceae, chi (Genus): Bacillus, loài (Species): Bacillus subtilis 1.2.2 Đặc điểm sinh thái học phân bố tự nhiên Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí kỵ khí dễ ni Chúng tìm thấy mơi trường tự nhiên sống chủ yếu đất, rơm rạ Đó lý mà người ta gọi “trực khuẩn cỏ khơ” Chúng cịn tìm thấy ngun liệu sản xuất bột mì (chiếm 75-79% vi khuẩn tạo bào tử) [1], Bacillus subtilis đóng vai trị quan trọng mặt lợi mặt hại q trình biến đổi sinh học Bacillus subtilis có khả dùng hợp chất vô để làm nguồn Cacbon, loài khác Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần phải bổ sung hợp chất hữu vitamin axit amin để phát triển Các loài Bacillus popilliae đặc biệt Bacillus lentimorbus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng khơng có khả phát triển mơi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường [1] 1.2.3 Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis loại trực khuẩn gram dương nhỏ, đầu tròn, đứng riêng lẻ thành chuỗi ngắn Vi khuẩn di động, có 8-12 lơng, tạo bào tử hình bầu dục nhỏ tế bào vi khuẩn xuất tế bào, ẩm, tia tử ngoại xạ Có kích thước từ 0,8 – 1,8µm khả chịu nhiệt 100oC 180 phút [2] 1.2.4 Đặc điểm nuôi cấy Điều kiện sinh trưởng: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 370°C, vi khuẩn hiếu khí kỵ khí mơi trường kỵ khí vi khuẩn phát triển chậm, pH từ 7,0 đến 7,4 [1] Đặc điểm sinh hoá: lên men loại đường (glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose), indol (-), VP (+), Nitrat (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+) [1] Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus subtilis: 2.1 Bacillus subtilis số lợi ích sức khỏe người: Ngoài loại vi khuẩn gây bệnh cho người Bacillus anthracis Bacillus 60 cịn có nhiều loại Bacillus, đặc biệt Bacillus subtilis, nghiên cứu tất cấp độ tế bào, chẳng hạn giải mã trình tự gen, nghiên cứu chế điều hòa biểu enzym protein sàng lọc hoạt chất sinh học, kỹ thuật sinh học đại phân loại vi sinh vật cấp độ lồi lồi [4-8] Với hệ tiêu hóa, Bacillus subtilis có khả phát triển nhanh chóng hệ vi khuẩn đường ruột đặc biệt vùng bị viêm loét, tạo thành lớp màng sinh học, bảo vệ niêm mạc ruột khỏi độc tố, chống lại xâm nhập vi sinh vật có hại Việc sử dụng Bacillus subtilis cho thấy hiệu tích cực việc giảm áp lực gây bệnh đường ruột, trì cân hệ vi khuẩn đường ruột giảm thiểu phát triển vi khuẩn gây bệnh [3] 2.2 Bacillus subtilis nuôi trồng thủy sản Có thể thấy Bacillus subtilis khơng gây hại cho động vật có vú (bao gồm người) [15] Các enzyme làm giảm mảnh vụn hữu tích tụ ao ni tơm, ao ni cá, tạo q trình xử lý sinh học ao nhờ phịng chống loại bệnh từ vi khuẩn virus gây bệnh [9-11] Hoạt động kháng khuẩn Bacillus subtilis xác định khả sản xuất kháng sinh chúng, chủ yếu từ nguồn gốc peptit Chúng ta khám phá 795 loại kháng sinh từ loài Bacillus, tất Bacillus subtilis lồi có suất cao nhất, chúng dành từ 4-5% gen để tổng hợp tạo 66 loại kháng sinh [12] Do phát triển điều kiện hiếu khí kỵ khí chủng vi khuẩn Cục Quản Lý Thực phẩm Dược phẩm (FDA) Hoa Kỳ cơng nhận an tồn theo tiêu chuẩn GRAS (chứng nhận an toàn tuyệt đối) [13], thấy theo lý thuyết lợi khuẩn đa chức với người động vật Để cải thiện suất ao nuôi tôm thẻ chân trắng, người ta áp dụng chế phẩm sinh học Bacillus subtilis nhiều nơi mà đặc biệt đồng Sông Cửu Long Hiện ngành ni trồng thủy sản phát triển nhanh chóng, để phát triển lâu dài mở rộng thị trường phải khắc phục vấn đề lớn việc lạm dụng hóa chất xử lý nước thuốc kháng sinh nuôi trồng thủy sản cảnh báo từ nhiều năm tình trạng chưa hạ nhiệt Hệ lụy khơng tốn chi phí mà cịn dẫn đến tình trạng kháng thuốc, dịch bệnh triền miên loại vật nuôi thủy sản, làm giảm hiệu kinh tế Bên cạnh việc sử dụng q nhiều hóa chất cịn khiến cho vi sinh vật có lợi mơi trường nước ni bị tiêu diệt gây cân hệ sinh thái vùng ao nuôi, làm giảm sức đề kháng sức tăng trưởng động vật thủy sản Để giải vấn đề trên, nhà khoa học nghiên cứu tính ứng dụng vi sinh Bacillus tạo chế phẩm sinh học phù hợp Lợi ích lớn chủng Bacillus xử lý môi trường nuôi lành sẽ, nghĩa khả chuyển hóa chất dư thừa thức ăn, xác tảo để tạo thành CO H2O Chuyển hóa khí độc NH3, NO2 đáy ao để đất đáy nuôi tơm khơng bị suy thối [14] Đồng thời cịn sản sinh enzyme làm kìm hãm tiêu diệt mầm bệnh gây động vật thủy sản Để chứng minh điều người ta thực thí nghiệm đơn giản dùng nước ao nuôi không sử dụng lợi khuẩn Bacillus sau dùng test Sera để nhận biết nồng độ NH3 Hình 2.1 Bộ Test Sera Amomonium Sau cho Bacillus vào nước đợi từ 2-3 ngày Người ta thu kết khả quan chứng minh hiệu chủng vi khuẩn Bacillus: qua hình 2.2 ta thấy, ban đầu nước ao có nồng độ khí NH vượt ngưỡng cho phép (xấp xỉ 5mg/L), sau 2-3 ngày nồng độ khí độc ao thay đổi (xấp xỉ 0mg/L) Nguyên nhân có lượng chế phẩm vi sinh sử dụng để xử lý nước ao trước Hình 2.2 Kết thí nghiệm (bên trái nước nhiễm NH3, bên phải nước sau dùng chế phẩm) [14] Ngày xưa, để cải tạo ao người ta thường sử dụng vôi tốn thời gian cơng sức xử lý hóa chất nhanh nguồn nước bị nhiễm Do đó, việc sử dụng chế phẩm vi sinh chứa Bacillus biện pháp an toàn chuyên gia khuyên áp dụng thời điểm Bởi lẽ với khả tăng nhanh số lượng tính thích nghi mạnh mẽ với môi trường nên Bacillus tham gia mạnh mẽ vào q trình tiêu hóa thức ăn, kháng bệnh cá tơm, góp phần xử lý mơi trường ao ni Mở rộng thêm gần nhà khoa học Mexico thử nghiệm khả chống lại vi khuẩn gây bệnh EMS tơm Vibrio parahaemolyticus dịng vi khuẩn Bacillus subtilis [15]: Hình 2.3 Biểu đồ thể tỷ lệ sống tôm vào cuối chu kỳ Hình 2.4 Tổng số lượng tơm thu hoạch vào cuối chu kỳ ương giai đoạn Hình 2.5 Trọng lượng tôm thu hoạch vào cuối chu kỳ ương giai đoạn Kết cho thấy việc ứng dụng chế phẩm có chứa vi khuẩn Bacillus subtilis giúp tăng tỉ lệ sống sót tơm Trong giai đoạn cho ăn đầu tiên, tỷ lệ sống tôm tăng (từ 32% lên 36%) (Hình 2.3) Vào cuối giai đoạn thứ hai giai đoạn nuôi, gia tăng tỷ lệ sống tôm dẫn đến tăng tổng số tơm thu hoạch (từ khoảng 3.400 lên 4.700) so với đối chứng (Hình 2.4) Và trọng lượng tơm tăng từ (0.0062-0.0068) (Hình 2.5) Tuy nhiên, song song với phát triển ngành thủy sản hạn chế sẵn có phụ phẩm đánh bắt để sử dụng làm bột cá (là loại bột có hàm lượng calo cao làm từ cá q trình đánh bắt bị sai lồi, sai giới tính, khơng đủ kích thước non [16]) Các phụ phẩm đánh bắt có nguồn gốc từ biển mà nhu cầu bột cá tăng cao cơng ty thủy sản khai thác nhiều phụ phẩm đánh bắt, từ dẫn đến việc hủy hoại hệ sinh thái Để khắc phục tình trạng cần loại thức ăn khác bột cá phải tăng khả hấp thụ tiêu hóa vật ni (mục đích giảm số lượng bột cá phải sử dụng mà không ảnh hưởng tới chất lượng vật ni) Ngồi việc xử lý ao ni chủng Bacillus có khả hỗ trợ tăng sức đề kháng, tăng khả hấp thụ qua nâng cao suất vật ni Ta cải thiện khả hấp thụ vật nuôi cách cải thiện cân đường ruột, thông qua cải thiện thức ăn, bổ sung enzyme cho q trình tiêu hóa, ức chế vi sinh vật gây bệnh Ta biết, protein vào thể enzyme phân hủy (protease) thành acid amin, nên dựa vào hoạt tính protease để lựa chọn lợi khuẩn phù hợp Các nhà khoa học phân lập khoảng 48 chủng vi khuẩn Bacillus từ đậu nành lên men sau thử nghiệm hoạt tính protease chọn chủng Bacillus có hoạt tính cao vùng lớn Theo kết thể bảng 2.1, ta thấy Bacillus subtilis E20 có hoạt tính cao so với chủng lại [17]: Bảng 2.1 Số liệu chủng vi khuẩn sau chọn lọc Chủng vi khuẩn Vùng (cm) Hoạt tính Protease (U) E17 1-7 14-4 E18 1-0 5-8 E20 1-2 16-6 E22 4-8 5-7 G09 2-5 6-6 G12 2-5 12-0 G15 3-0 13-8 G16 2-0 14-7 Nhưng chưa thể kết luận Bacillus subtilis E20 có phải loại lợi khuẩn tốt hay không nên ta phải xét thêm khả chống chịu với điều kiện sống: Bảng 2.2 Sự dung nạp cúa Bacillus subtilis E20 điều kiện khác nhiệt độ, pH, phần trăm NaCl Nhìn vào số liệu thấy Bacillus subtilis E20 tồn nhiều nhiệt độ, độ pH NaCl, sống phạm vi 10 -30oC, độ pH từ 5-10 phần trăm NaCl lên tới 9% Enzyme protease có sản lượng cao 40 oC sau 50oC, 30oC, 20oC, sản xuất protease 40°C cao gấp 3-5 lần so với 20°C Ta thấy tiềm lớn Bacillus subtilis E20 Đây xem loại lợi khuẩn tuyệt vời cải thiện suất sinh trưởng tôm thơng qua khả tiêu hóa Bacillus subtilis E20 chế phẩm sinh học có tiềm sử dụng trực tiếp để cải thiện xuất, tăng trưởng, gián tiếp làm giảm chi phí thức ăn bảo vệ hệ sinh thái biển PHẦN KẾT LUẬN Tuy có nhiều ứng dụng hấp dẫn khác chủng Bacillus có số gây độc cho sinh vật hiệu chế phẩm sinh học từ Bacillus có tác dụng khơng sử dụng đồng thời với hóa chất xử lý mơi trường thuốc kháng sinh Mặc dù đặc tính có hai mặt khơng thể phủ nhận thành tựu to lớn mà Bacillus mang lại cho người Qua trình bày ta thấy vai trò tuyệt vời chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, mang lại nhiều lợi ích khác cho người sinh vật Đặc biệt ngành nuôi trồng thủy sản, giúp người tiết kiệm chi phí, thời gian, hiệu suất cải thiện tích cực Hơn Bacillus subtilis cịn có nhiều vai trị khác tạo hóa chất, enzyme sinh học cơng nghiệp khác, sử dụng làm tảng cho vắc xin làm phụ gia thực phẩm nông nghiệp Là mơ hình lý tưởng để nhà khoa học nghiên cứu mặt di truyền, biểu gen chuyên gia khuyến khích việc dùng người TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguồn gốc & đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis xử lý nước thải (xulybenuocthai.vn) [2] Nguồn gốc vi khuẩn Bacillus subtilis (thiennguyen.net.vn) [3] Vai trò Bacillus subtilis ngành ni trồng thủy sản - CƠNG TY CP DINH DƯỠNG SÀI GÒN (dinhduongsaigon.com) [4] X.H Chen, A Koumoutsi, R Scholz, Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42 Nat Biotechnol 25 (2007) 1007-1014 [Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth–promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42 | Nature Biotechnology] [5] A Koumoutsi, X.H Chen, J Vater & Borriss, DegU and YczE positively regulate the synthesis of bacillomycin D by Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42 Appl Environ Microbiol 73(2007) 6953-6964 [(PDF) DegU and YczE Positively Regulate the Synthesis of Bacillomycin D by Bacillus amyloliquefaciens Strain FZB42 (researchgate.net)] [6] A.M Herzner, J Dischinger, C Szekat, Expression of the lantibiotic mersacidin in Bacillus amyloliquefaciens FZB42 PLoS One (2011) e22389 [pone.0022389 (core.ac.uk)] [7] E Sansinenea & A Ortiz, Secondary metabolites of soil Bacillus spp Biotechnol Lett 33(2011) 1523-1538 [(PDF) Secondary metabolites of soil Bacillus spp (researchgate.net)] [8] B Fan, L.C Carvalhais, A Becker, D Fedoseyenko, N Vonwiren & R Borriss, Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates BMC Microbiol 12(2012) 116 [(PDF) Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates (researchgate.net)] [9] Olmos J, Ochoa L, Paniagua-Michel J, Contreras R (2011) Functional feed assessment on Litopenaeus vannamei using 100% fish meal replacement by soybean meal, high levels of complex carbohydrates and Bacillus probiotic strains Mar Drugs 9: 1119-1132 [Marine Drugs | Free Full-Text | Functional Feed Assessment on Litopenaeus vannamei Using 100% Fish Meal Replacement by Soybean Meal, High Levels of Complex Carbohydrates and Bacillus Probiotic Strains | HTML (mdpi.com)] 10 [10] Rengpipat S, Phianphak W, Piyatiratitivorakul S, Menasvetac P (1998) Effects of a probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth Aquaculture 167: 301-313 [(PDF) Effects of a probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth | Sirirat Rengpipat - Academia.edu] [11] Guo JJ, Liu KF, Cheng SH, Chang CI, Lay JJ, et al (2009) Selection of probiotic bacteria for use in shrimp larviculture Aquac Res 40: 609-618.[(PDF) Isolation, screening and characterization of potential probiotics from farmed tiger grouper (Epinephelus fuscoguttatus) (researchgate.net)] [12] Stein T (2005) Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions Mol Microbiol 56: 845-857.[https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.13652958.2005.04587.x] [13] Olmos and Paniagua-Michel, J Microb Biochem Technol 2014, 6:7 [http://dx.doi.org/10.4172/1948-5948.1000169] [14] Phóng VTC16 [15] J Jaime Munoz M et al September/October 2014, Global Aquaculture Advocate [Vi khuẩn Bacillus có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh EMS giúp nâng cao suất tôm | Tôm Vàng (tomvang.com)] [16] Fish meal [https://en.m.wikipedia.org/wiki/Fish_meal] [17] C.-H Liu, C.-S Chiu, P.-L Ho, S.-W Wang, Improvement in the growth performance of white shrimp, Litopenaeus vannamei, by a protease-producing probiotic, Bacillus subtilis E20, from natto Journal of Applied MicrobiologyVolume 107, Issue p 1031-1041 [Improvement in the growth performance of white shrimp, Litopenaeus vannamei, by a protease‐producing probiotic, Bacillus subtilis E20, from natto - Liu - 2009 - Journal of Applied Microbiology Wiley Online Library] 11