nghiên cứu điều kiện chiết rút carotenoprotein từ đầu vỏ tôm thẻ chân trắng bằng các enzyme protease thương mại

- Astaxanthin: là sắc tố chủ yếu trong vỏ tôm, astaxanthin là dẫn xuất của carotenoid, thường ở dạng liên kết với acid béo ester hóa hay với protein tạo nên một phức hợp chặt chẽ có màu

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian 3 tháng vừa qua với sự nỗ lực của bản thân cùng với sự quan tâm giúp đỡ của thầy cô, cha me và bạn bè, đến nay em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình Em xin trân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã truyền đạt những kiến thức trong những năm học vừa qua Đồng thời em xin chân thành cảm ơn các cán bộ và nhân viên phòng thí nghiệm Viện Công nghệ sin học và môi trường đã tận tình giúp đỡ em tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ths Nguyễn Công Minh đã trực

tiếp hướng dẫn em hết sức tận tình và chu đáo trong suốt thời gian làm khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và bạn bè đã động viên khích lệ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận

Nha Trang, tháng 6 năm 2012

Sinh viên thực hiện

Mai Thị Ngọc Diệp

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về phế liệu tôm 2

1.2 Tổng quan về carotenoprotein 3

1.2.1 Sự tồn tại của carotenoprotein 3

1.2.2 Tính chất của carotenoprotein 4

1.2.3 Ứng dụng của carotenoprotein 6

1.3 Tổng quan về enzyme protease 7

1.3.1 Đặc tính của enzyme protease 7

1.3.2 Ứng dụng của enzyme protease 9

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 12

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 12

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên vật liệu: 20

2.1.1Nguyên liệu đầu tôm: 20

2.1.2 Enzyme Alcalase 20

2.1.3 Enzyme Flavourzyme 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Sơ đồ tổng quát thí nghiệm 21

2.2.2 Xác định chế độ thích hợp để tách chiết protein giàu carotenoid từ đầu tôm bằng Alcalase 22

2.2.2.1 Xác định tỷ lệ enzyme/phế liệu thích hợp cho công đoạn thủy phân bằng Alcalase 22

2.2.2.2 Xác định thời gian xử lý thích hợp cho công đoạn thủy phân bằng Alcalase 24

2.2.3.Xác định chế độ thích hợp để tách chiết carotenoid từ đầu tôm ở giai đoạn

hai bằng enzyme Flavourzyme (sau khi đã xử lý bằng Alcalase) 25

2.2.3.1 Xác định tỷ lệ enzyme/ phế liệu thích hợp cho công đoạn thủy phân bằng Flavourzyme 25

2.2.3.2 Xác định thời gian xử lý thích hợp cho công đoạn thủy phân Flavourzyme 26

2.3 Các phương pháp phân tích sử dụng trong đề tài 27

2.4.Phương pháp xử lý số liệu 27

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm đầu thẻ chân trắng 28

3.2 Nghiên cứu điều kiện thủy phân carotenoprotein từ đầu tôm bằng enzyme Alcalase 29

3.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase/ phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin 29

3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme Alcalase/ phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin 32

3.3 Nghiên cứu điều kiện thủy phân carotenoprotein từ đầu tôm bằng enzyme Flavourzyme 34

3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme/ phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin 34

3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme Flavourzyme/ phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin 36

3.4 Thành phần hóa học của carotenoprotein 38

3.5 Đề xuất quy trình thu hồi carotenoprotein bằng hỗn hợp hai enzyme 38

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

4.1 Kết luận 39

4.2 Đề nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC 45

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm thẻ chân trắng 28 Bảng 3.2 Thành phần hóa học cơ bản của carotenoprotein 38

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Quy trình sản xuất chitin của Pháp 13

Hình 1.2 Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto 15

Hình 1.3 Quy trình sản xuất Chitin của TS Trang Sỹ Trung 17

Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 21

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm cho công đoạn xác định tỷ lệ enzyme Alcalase 23

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm cho công đoạn xác định thời gian enzyme Alcalase 24

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm cho công đoạn xác định tỷ lệ enzyme Flavourzyme 25

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm cho công đoạn xác định thời gian enzyme Flavourzyme 26

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase/phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein từ phế liệu tôm 29

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase/phế liệu đến hiệu suất thu hồi astaxanthin từ phế liệu tôm 31

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian enzyme Alcalase/phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein từ phế liệu tôm 32

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian enzyme Alcalase/phế liệu đến hiệu suất thu hồi astaxanthin từ phế liệu tôm 33

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme/phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein từ phế liệu tôm 34

Hình 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme/phế liệu đến hiệu suất thu hồi astaxanthin từ phế liệu tôm 35

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian enzyme Flavourzyme/phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein từ phế liệu tôm 36

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian enzyme Flavourzyme/phế liệu đến hiệu suất thu hồi astaxanthin từ phế liệu tôm 37

LỜI MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của nền kinh tế trong và ngoài nước, ngành thủy sản trong những năm gần đây đã đạt được những thành tựu đáng kể về nuôi trồng, chế biến cũng như xuất nhập khẩu Trong các mặt hàng xuất khẩu của nước ta thì mặt hàng tôm xuất khẩu luôn chiếm tỷ lệ lớn, chiếm hơn 50% tổng kim ngạch xuất khẩu Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), trong sáu tháng đầu năm 2011, cả nước đã xuất khẩu 101.872 tấn tôm, trị giá 971,109 triệu USD; tăng 16,9% về khối lượng và 35,2% về giá trị so với cùng kì năm 2010 và là nhóm hàng có mức tăng trưởng cao nhất trong các nhóm hàng thủy sản xuất khẩu của Việt Nam Mặc dù gặp nhiều khó khăn, xuất khẩu tôm vẫn đạt mức kỉ lục gần 2,4 tỉ USD Theo VASEP cho biết dự kiến xuất khẩu tôm 2012 sẽ đạt 2,5 tỷ USD

Do đó lượng phế liệu tôm thải ra từ các nhà máy chế biến là khá lớn khoảng 100.000 tấn/ năm Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất protein, astaxanthin, chitin, chitosan…và các sản phẩm có giá trị kinh tế khác Hiện nay đã

có nhiều công trình nghiên cứu tận thu phế liệu tôm nhưng chủ yếu tập trung vào quá trình thu hồi chitin–chitosan Các quá trình sản xuất chitin– chitosan này thường là các quá trình hóa học, sử dụng acid và base mạnh để khử khoáng và protein do vậy vừa gây ô nhiễm môi trường do hóa chất vừa gây lãng phí về kinh tế

vì không thể tận thu được các thành phần có giá trị như protein và carotenid

Nhằm giảm ô nhiễm môi trường và tận thu được các thành phần có giá trị như protein và astaxanthin đề tài “Nghiên cứu điều kiện chiết rút carotenoprotein từ đầu vỏ tôm thẻ chân trắng bằng các enzyme protease thương mại” được thực hiện Nội dung thực hiện:

- Xác định thành phần hóa học của đầu tôm the chân trắng

- Nghiên cứu điều kiện chiết carotenoprotein từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng các enzyme Alcalase, Flavourzyme

- Đánh giá chất lượng carotenoprotein thu được

- Đề xuất quy trình

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về phế liệu tôm

Phế liệu tôm chủ yếu là đầu và các mảnh vỏ, ngoài ra còn kể đến các mảnh thịt vụn do bóc nõn không cẩn thận, một số tôm bị hỏng Tùy theo giống loài, phương pháp gia công chế biến mà lượng phế liệu có thể lên đến 60% sản lượng khai thác được Ví dụ tôm càng xanh, phần đầu tôm chiếm 60% khối lượng tôm, với tôm sú thì phần đầu chiếm khoảng 40% khối lượng tôm Đối với sản phẩm tôm bóc nõn, rút ruột mất mát theo vỏ và đuôi khoảng 25% khối lượng tôm Đối với tôm thẻ, lượng phế liệu đầu tôm chiếm 28% và vỏ chiếm 9%, như vậy tổng khối lượng phế liệu vỏ, đầu tôm thẻ chiếm khoảng 37% [4] Lượng phế liệu này có thể được giảm xuống bằng cách nâng cao hiệu quả lột vỏ nhờ các thiết bị và công nghệ chế biến tốt hơn Giảm lượng phế liệu từ khâu chế biến hoặc tìm giải pháp tái sử dụng chúng đang trở nên phổ biến như một phương cách giúp làm tăng lợi nhuận cho ngành thuỷ sản Nó không chỉ đem lại giá trị kinh tế cao mà còn có ý nghĩa trong việc bảo vệ môi trường

Thành phần hóa học trong đầu tôm

Thành phần chiếm tỷ lệ đáng kể trong đầu tôm là protein, chitin, sắc tố, khoáng và enzyme…tỷ lệ các thành phần này không ổn định, chúng thay đổi theo giống, loài đặc điểm sinh lí,…thành phần chitin và protein trong vỏ tôm tươi tương ứng là 4,50% và 8,05% Trong vỏ tôm khô là 11 – 27,50% và 23,25 – 53%

Hàm lượng chitin, khoáng, protein và carotenoid trong phế liệu vỏ tôm thay đổi rất rộng phụ thuộc vào điều kiện bóc vỏ trong quá trình chế biến cũng như phụ thuộc vào loài, trạng thái dinh dưỡng, chu kì sinh sản Vỏ giáp xác chứa chủ yếu là protein (30-40%), khoáng (30-50%), chitin (13-42%) [34]

- Protein: protein trong phế liệu tôm thường là loại protein không hòa tan, do

đó khó trích ly ra khỏi vỏ, nó tồn tại dưới hai dạng:

- Dạng tự do: Tồn tại trong các cơ quan nội tạng và các cơ gắn ở phần vỏ

- Dạng phức tạp: Liên kết với Chitin, CaCO3 như một phần thống nhất của

vỏ tôm

- Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và những hợp chất hữu cơ khác, chủ yếu là CaCO3 – thành phần chính tạo nên vỏ tôm, chính sự liên kết này gây khó khăn trong việc tách chiết và tinh chế

- Canxi: Trong thành phần vỏ, đầu tôm có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là cacbonat canxi (CaCO3)

- Astaxanthin: là sắc tố chủ yếu trong vỏ tôm, astaxanthin là dẫn xuất của carotenoid, thường ở dạng liên kết với acid béo (ester hóa) hay với protein tạo nên một phức hợp chặt chẽ có màu xanh của tôm Khi liên kết này bị phá vỡ thì astaxanthin dễ dàng bị oxy hóa thành astaxin

- Lipid: Chứa một lượng đáng kể, chủ yếu là các axit béo chưa no bão hòa như eicosapentaenoic acid (EPA), decosahexaenoic (DHA) Đây là những acid béo rất có lợi cho sức khỏe con người và có nhiều ứng dụng trong y học

- Enzyme: Trong phế liệu tôm cũng có chứa một số loại enzyme, theo tạp chí Khoa học và Công nghệ Thủy sản (số 5/1993) thì hoạt độ enzyme protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/gam tươi Trong đầu tôm có chứa enzyme tiêu hóa chymotrypsin, được sử dụng trong điều trị ung thư Một vài loại enzyme khác có mặt trong phế liệu tôm như alkaline phosphatase, β-N-acetyl glucosaminease, chitinase cũng được ứng dụng nhiều trong thực tế

1.2 Tổng quan về carotenoprotein

1.2.1 Sự tồn tại của carotenoprotein

Carotenoprotein là tên gọi chung của phức hợp bao gồm một protein và một carotenoid liên kết với nhau Phức hợp protein và sắc tố này được tìm thấy rất phổ biến trong cơ thể động vật biển không xương sống [24] Sự tương tác giữa carotenoid và protein là một đặc điểm sinh lý quan trọng trong cơ thể một số sinh vật sống Carotenoid ở trong cơ thể sinh vật có tính bền vững hơn so với khi đã được tách chiết Trong những hệ thống quang hợp, các sắc tố như carotenoid, chlorophyll hoặc bacteriochlorophyll đều được định vị trong những phức hợp protein - sắc tố nhằm đảm bảo vị trí và sự định hướng chính xác của các loại sắc tố này, đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền năng lượng ở cơ thể sinh vật

Ngoài ra, sự phân bố của carotenoprotein trong tự nhiên cũng khá đa dạng Ở thực vật, các carotenoid thường định vị trên một số lượng lớn các grana của lục lạp,

và chúng tồn tại ở dạng phức hợp carotenoprotein Động vật không xương sống ở biển như động vật da gai, động vật thân mềm, nhìn chung là các nhóm sinh vật chứa nhiều phức hợp carotenoprotein trong cơ thể Bên cạnh đó, các loại tảo, bao gồm cả tảo đơn bào hai roi (indoflagellate) cũng sử dụng phức hợp carotenoprotein như những thụ quan ánh sáng

Carotenoid ở dạng tự do thường có màu vàng, cam hoặc đỏ Tuy nhiên, trong

cơ thể những loài động vật biển không xương sống, các phức hợp carotenoprotein tạo nên nhiều màu khác nhau như xanh lá cây, xanh dương và tía Một ví dụ điển hình là α-crustacyanin, một phức hợp astaxanthin - protein trong vỏ tôm hùm

(Homarus gammarus) có màu xanh dương Khi còn sống, cơ thể loài tôm hùm này

có màu xanh đen; tuy nhiên, sau khi được nấu chín, cơ thể chúng chuyển thành màu

đỏ cam Màu đỏ này được tạo ra nhờ một loại carotenoid là astaxanthin dihydroxy-β,β’-carotene-4,4’-dione) được phóng thích ra ở dạng tự do thông qua quá trình biến tính phức hợp astaxanthin - protein bởi nhiệt

(3,3’-1.2.2 Tính chất của carotenoprotein

Carotenoprotein là phức hợp của carotenoid và protein Tuy nhiên, đối với đối tượng lớp giáp xác thì thành phần carotenoid này chủ yếu là astaxanthin Do vậy trong phạm vi nghiên cứu một khóa luận tốt nghiệp, tôi chủ yếu tập trung đề cập những thông tin về dạng phức hợp astaxanthin - protein

Astaxanthin là một trong các sắc tố carotenoid, có màu đỏ cam, được tìm thấy trong một số loài thủy sản như cá hồi, cá hồng, tôm, cua trong vi tảo nước

ngọt Haematococcus pluvialis, trong nấm men Phaffia rhodozyma là chất tan

trong lipid có khối lượng phân tử 596,8 Da Trong tự nhiên astaxanthin thường tồn tại ở dạng astaxanthin liên kết với protein tạo phức chất có màu xanh đen Khi gia nhiệt hay bị oxy hóa, liên kết giữa astaxanthin và protein bị cắt đứt, giải phóng astatin có màu đỏ cam

Phức hợp carotenoid – protein

Bản chất của sự liên kết

Theo P.F.Zagalsky (1976) [39], carotenoprotein được chia làm 2 loại chính: loại 1, kém bền vững hơn loại 2, là dạng phức hợp carotenoprotein mà trong đó, thành phần carotenoid liên kết với một lipo(glyco)protein Trong khi đó, loại 2 là dạng phức hợp mà carotenoid kết hợp với một protein đơn giản hoặc một glycoprotein Dạng 1 thường hiện diện ở buồng trứng, trứng và máu của động vật không xương sống Mặt khác, dạng 2 thường được tìm thấy ở vùng bề mặt (vỏ và da) của chúng

Carotenoid được cho là nằm sâu trong lòng phức hợp, bị cách ly gần như hoàn toàn với môi trường nước, với nhóm 4 và 4’-keto của nó được định vị gần bề mặt của phân tử protein Cơ chế “liên kết nhờ sức căng” được các nhà nghiên cứu

đề xuất yêu cầu phải có sự ăn khớp giữa chuỗi polypeptide và các nhóm methyl của chuỗi polyene, đồng thời phải có sự duy trì bền vững của cấu trúc vòng β-ionone Hàm lượng cao các loại amino acid kích thước nhỏ tạo điều kiện dễ dàng hơn cho

sự khớp nối giữa chuỗi polyme và khung sườn polypeptide Cấu trúc của phức hợp carotenoprotein hầu như được hình thành từ các xoắn ngẫu nhiên (random coil) và

có dạng cấu hình phiến β Một minh chứng rõ rệt là trong thành phần carotenoprotein, hàm lượng amino acid leucine (giúp làm bền kiểu cấu hình xoắn α) rất thấp nhưng hàm lượng các loại amino acid khác như proline, serine, glycine và asparagine (làm phá vỡ cấu trúc xoắn α) tương đối cao Điển hình như trong phức hợp crustacyanin, tỉ lệ cấu trúc xoắn α chỉ chiếm khoảng 6% [39] Bên cạnh đó, trong thành phần phức hợp carotenoprotein, các amino acid thường thấy trong dạng cấu hình β như isoleucine, valine, threonine và glutamine hiện diện với tỉ lệ không nhỏ, đồng thời một số lượng lớn các “cấu trúc quay ngược” β (β-bends) cũng được tìm thấy (cấu trúc này hỗ trợ sự hình thành của dạng cấu hình phiến β đối song song

Sự dịch chuyển bước sóng hấp thụ cực đại

Phức hợp carotenoprotein hòa tan trong nước và có tính bền vững, trong một vài trường hợp, màu sắc của nó bền đến vài năm trong không khí ở điều kiện nhiệt

độ phòng Ngoài ra, sự tương tác giữa protein và astaxanthin dẫn đến sự thay đổi lớn về bước sóng của bức xạ hấp thụ cực đại (spectral shift), từ đó dẫn đến sự thay đổi về màu sắc của nó Chẳng hạn, trong cơ thể động vật giáp xác, astaxanthin thường liên kết với các phân tử protein tạo thành phức hợp α-crustacyanin, hấp thụ cực đại bức xạ ở bước sóng 628 nm, tạo nên màu xanh đen đặc trưng thường thấy ở các loài thủy sản sống Dưới tác dụng của nhiệt, liên kết trên bị phá hủy và giải phóng astaxanthin tự do (có bước sóng hấp thụ cực đại chỉ là 480nm) màu đỏ cam

Sự thay đổi bước sóng của bức xạ hấp thụ cực đại của astaxanthin trong phức hợp carotenoprotein so với dạng phân tử tự do phụ thuộc vào sự liên kết của nó với thành phần apoprotein, về vị trí không gian, và chính bản chất cấu trúc của astaxanthin

1.2.3 Ứng dụng của carotenoprotein

Carotenoid và carotenoprotein chịu trách nhiệm tạo nên những màu sắc khác nhau trong cơ thể động vật giáp xác Những hợp chất này thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới nhờ vào các tính chất quan trọng của chúng như có nguồn gốc tự nhiên, không chứa độc tố, cung cấp những sắc tố tan được cả trong nước và chất béo Một trong những ứng dụng được quan tâm lớn hiện nay của phức hợp carotenoprotein là nó có thể được sử dụng làm thức ăn cho

cá hồi để tạo nên màu sắc tươi tự nhiên cho thịt cá [30] Do cá hồi không thể tự tổng hợp astaxanthin, chúng phải thu nhận astaxanthin từ nguồn bên ngoài như ở các loại

vi tảo hoặc từ thức ăn có bổ sung loại sắc tố này [36]

Mặt khác, trong tình hình hiện nay, khi mà nguồn astaxanthin tổng hợp bị kiểm duyệt nghiêm ngặt về tính an toàn với sức khỏe con người, nhu cầu astaxanthin tách chiết từ nguồn nguyên liệu tự nhiên phát triển mạnh mẽ hơn bao giờ hết [30] Bên cạnh đó, nhờ vào tính chất không gây ra các phản ứng dị ứng trong cơ thể người, dạng astaxanthin tự nhiên (ở dạng tự do và dạng phức hợp

carotenoprotein) hiện nay đã được nghiên cứu trong những ứng dụng mỹ phẩm và thẫm mỹ [32]

Một hướng ứng dụng khác của phức hợp carotenoprotein, đó là dựa trên tính chất dịch chuyển bước sóng của bức xạ hấp thụ cực đại của phức hợp này so với phân tử sắc tố tự do, kéo theo sự thay đổi về màu sắc, mà carotenoprotein có thể được sử dụng làm chất chỉ thị cảm ứng nhiệt độ, đối với cả khoảng nhiệt gây ra xảy

ra sự đổi màu thuận nghịch và không thuận nghịch

Cuối cùng, carotenoprotein còn có tiềm năng trong việc sử dụng để bổ sung vào nguồn thực phẩm cho người khi mà nhu cầu về protein thực phẩm ngày càng tăng mạnh trên toàn cầu, đặc biệt là ở các nước chưa phát triển Carotenoprotein chứa nhiều loại amino acid thiết yếu, đồng thời lại kết hợp với thành phần carotenoid (chủ yếu là astaxanthin), rất có lợi cho sức khỏe con người nhờ khả năng chống oxy hóa mạnh (gần gấp 10 lần so với các loại carotenoid khác như zeaxanthin, lutein, canthaxanthin và β-carotene, và mạnh hơn gấp 500 lần so với α-tocopherol) Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tập trung vào đối tượng carotenoprotein như là nguồn thực phẩm mới giúp giảm thiểu hoặc kiểm soát các bệnh liên quan đến vấn đề ăn uống như: chứng xơ vữa động mạch, ung thư, suy thận và suy gan [17] cũng như giúp kiểm soát cân nặng cho các bệnh nhân đang được điều trị [38]

1.3 Tổng quan về enzyme protease

1.3.1 Đặc tính của enzyme protease

Enzyme là chất xúc tác sinh học mang bản chất protein ra, có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học xảy ra nhanh chóng trong điều kiện sinh lý bình thường của cơ thể sống và chỉ cần một lượng nhỏ cũng xúc tác để chuyển hóa một lượng cơ chất lớn

Protease là enzyme thủy phân liên kết peptid của phân tử protein Enzyme protease được phân thành hai dạng là endoprotease và exoprotease

- Các endoprotease như trypsin, chymotrypsin, chymosin thủy phân các liên kết peptid bên trong chuỗi polypeptid

- Các exoprotease cắt các liên kết ở hai đầu tận cùng của chuỗi polypeptid, các exoprotease cắt vào đầu các nhóm carboxyl tận cùng được gọi là carboxylpeptidese còn những enzyme tác dụng vào đầu có nhóm amin tận cùng gọi

là aminopeptidase [27]

Các endo và exoprotease kể trên cộng tác với nhau rất có hiệu quả trong việc phân giải protein Có thể nói rằng, chức năng chính của endoenzyme tạo ra một lượng lớn các chuỗi peptid có đầu C và đầu N tự do để tạo điều kiện cho các exoprotease hoạt động [23]

Tuy nhiên, tác dụng của các protease rất phức tạp, bản chất của các mạch nhánh của acid amin ở bên cạnh các liên kết peptid có ảnh hưởng mạnh đến hoạt động của các enzyme Trên thực tế, các protease rất đặc hiệu và tỷ lệ những liên kết peptid trong một phân tử protein bị bẻ gãy bởi một protease là không cao [27]

Hiện nay, các enzyme protease đã được thương mại hóa như enzyme Alcalase, Flavourzyme, Protamex, Neutrase …

Enzyme Alcalase

Năm 1947, Linderstrom, Lang và Ottesen tại phòng thí nghiệm Carlsberg đã

tiến hành nuôi cấy Bacillus licheniformis và thu được loại enzyme Subtilisin

Carlsberg Nó được thu lần đầu tiên ở dạng kết tinh vào năm 1952 và từ đó đến nay, subtilisin là protease vi sinh vật công nghiệp quan trọng nhất, được sử dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa Subtilisin là một nhóm enzyme protease kiềm (serine protease) và Alcalase là một dẫn xuất thuộc nhóm này đã được thương mại hóa Điều kiện hoạt động tối ưu của Alcalase là ở khoảng pH hơi kiềm Một số nghiên cứu cho thấy enzyme Alcalase hoạt động tối ưu ở pH = 8, nhiệt độ 50 –

600C [29] Alcalase được xếp vào nhóm endoprotease, nó bị bất hoạt ở điều kiện pH thấp

Enzyme Flavourzyme

Flavourzyme là peptidase mang cả hai hoạt tính endo và exoprotease

(aminopeptidase), được sản xuất từ quá trình lên men chìm loài Aspergillus oryzae

Enzyme này hoạt động thủy phân protein trong điều kiện trung tính hoặc acid yếu

Điều kiện hoạt động tối ưu của Flavourzyme 500 L là pH 5 – 7, nhiệt độ khoảng

500C Flavourzyme 500 L có hoạt tính 500 L APU/g Flavourzyme có thể bị ức chế hoạt động ở 90°C trong 10 minutes hoặc 120°C trong 5 giây [21]

1.3.2 Ứng dụng của enzyme protease

Ngày nay, cùng với sự phát triển của các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học… thì enzyme protease được ứng dụng khá rộng rãi nhất là trong ngành công nghiệp thực phẩm

Quá trình thủy phân protein có thể được tiến hành bằng cách sử dụng đơn enzyme hoặc kết hợp nhiều enzyme, tuy nhiên hiệu quả của quá trình thủy phân khi

sử dụng đơn enzyme không được tốt Vì vậy, sự kết hợp các hệ enzyme endoprotease và exoprotease khác nhau được tiến hành Việc bổ sung endoprotease trong giai đoạn đầu của quá trình sẽ làm tăng số lượng chuỗi peptid do đó tăng số lượng đầu C và đầu N tận cùng để các exoprotease hoạt động [27] Hơn nữa, sau khi thêm endoprotease, pH của dung dịch phản ứng sẽ giảm chậm từ giá trị pH ban đầu

là 8,5 xuống gần 7 đây là pH thích hợp của các exopeptidase, sau 24 giờ thủy phân bằng exopeptidase, giá trị pH của dịch thủy phân giảm còn 6,5 [21]

Khi thủy phân một enzyme, hiệu suất thường đạt không cao do enzyme đó chỉ mang một trong hai đặc tính hoặc là exo hoặc là endoprotease Theo nghiên cứu của Adriena Drya´kova (2010) khi sử dụng một enzyme để thủy phân protein sữa chua trong 4 loại enzyme được sử dụng là Alcalase, Neutrase, Protamex và Flavourzyme thì Flavourzyme cho hiệu quả thủy phân cao nhất với DH đạt được tương ứng là 37% điều đó đã chứng tỏ ưu thế vượt trội khi enzyme mang bản chất exoprotease [15]

Như vậy việc kết hợp nhiều enzyme để thủy phân protein là có triển vọng Theo Chulaporn Kamnerdpetch và cộng sự (2007) [21], trong quá trình thủy phân bột khoai tây, Alcalase hoặc Flavourzyme thích hợp để thủy phân hơn novo – pro D hoặc corolase Tuy nhiên độ thủy phân đạt cao nhất chỉ đạt 22%, (đối với mẫu sử dụng Flavourzyme) Báo cáo cũng chỉ ra rằng, việc sử dụng kết hợp endoprotease

Alcalase hoặc novo – pro D và exopeptidase Flavourzyme cho hiệu quả thủy phân tốt hơn khi sử dụng đơn enzyme Độ thủy phân đạt cao nhất 44% khi sử dụng phối hợp Alcalase và Flavourzyme (2% Alacalse (v/w) + 5% Flavourzyme (w/w)) Hơn nữa, hàm lượng amino acid trong dịch thủy phân đạt rất cao, đặc biệt là các acid amin thiết yếu (His, Phe, Trp and Tyr) và acid amin chứa lưu huỳnh methionine (Met)[21]

1999, Javier Vioque và cộng sự đã tiến hành thủy phân Rapeseed Protein, kết quả cho thấy rằng, nếu chỉ sử dụng Alcalase thì độ thủy phân đạt tối đa là 27%, tuy nhiên khi ông tiến hành ủ Alcalase trong 60 phút rồi cho tiếp Flavourzyme vào và ủ tiếp 2 giờ, độ DH đạt tối đa là 60% [28]

Việc sử dụng hai enzyme Alcalase và Flavourzyme cũng đã được Cristina Megías (2009) ứng dụng trên sunflover protein Theo Cristina Megías sau khi thủy phân Alcalase 60 phút, DH đạt 27%, tuy nhiên, nếu dùng cả hai loại enzyme Alcalase và Flavourzyme thì sau 2 giờ thủy phân DH có thể đạt > 66% [19]

Theo Hee Jeong Chae (1998), sử dụng kết hợp 3 enzyme Neutrase, Alcalase

và Flavourzyme để thủy phân protein sẽ cho độ thủy phân cao hơn khi sử dụng kết hợp hai enzyme Alcalase và Flavourzyme Theo tác giả này, độ thủy phân đạt cao nhất khi sử dụng kết hợp 3 enzyme là 51% trong khi đó giá trị DH chỉ đạt 47 % khi

sử dụng hai enzyme [26]

Đối với phế liệu protein tôm, việc ứng dụng enzyme để tách protein trong quá trình sản suất chitin đã được quan tâm từ lâu Tuy nhiên, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở hướng nghiên cứu đơn enzyme để tách protein Do vậy việc ứng dụng phương pháp kết hợp đa enzyme trong quá trình tách protein tôm là một hướng mới cần được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn trong thời gian đến

Enzyme protease được dùng để thủy phân protein trong sản xuất chitin, astaxanthin, bột đạm… Phần lớn phế liệu tôm tại Việt Nam cũng như trên thế giới hiện nay chủ yếu được sử dụng để sản xuất chitin – chitosan, một ứng dụng có ý nghĩa lớn Công nghệ sản xuất chitin - chitosan còn đang gặp nhiều bất cập khi các

quy trình sản xuất chitin - chitosan quy mô lớn tại Việt Nam chủ yếu là quy trình hóa học Việc sử dụng hóa chất với nồng độ cao dẫn đến lượng chitin - chitosan thu được chưa cao và nhiều tạp chất Mặt khác các quy trình này chỉ tập trung vào việc thu nhận chitin – chitosan chưa chú trọng đến việc tận thu các sản phẩm khác của phế liệu tôm như protein, chất màu Các hóa chất và chất hữu cơ chưa được tận thu thải ra gây ô nhiễm môi trường

Việc kết hợp enzyme protease trong quá trình sản xuất chitin - chitosan có ưu thế hơn so với phương pháp hóa học truyền thống Nó giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng và thải ra môi trường Mặt khác, quy trình cải tiến với sự vượt trội về chất lượng chitin - chitosan thu được và thu hồi sản phẩm protein - astaxanthin có giá trị dinh dưỡng và sinh học, làm hạn chế các chất hữu cơ chứa trong nước thải, giảm thiểu chi phí xử lý môi trường Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trầm trọng do các cơ sở chế biến chitin - chitosan gây

ra, góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp sản xuất chitin - chitosan từ phế liệu thủy sản Đây là một hướng đi cho phương pháp sản xuất sạch hơn Bên cạnh đó, việc kết hợp sinh học và hóa học còn đảm bảo vấn đề giá thành sản xuất hợp lý, cơ hội cho mở rộng sản xuất với quy mô lớn Chitin - chitosan thu được có chất lượng cao hơn so với phương pháp hóa học, đặc biệt là độ nhớt và phân tử lượng Đồng thời, giảm hơn 50% lượng hóa chất sử dụng so với phương pháp hóa học truyền thống

Enzyme protease còn dùng để thủy phân phế liệu cá để sản xuất phế phẩm dẫn mùi giàu đạm dùng trong thức ăn nuôi tôm, cá hạn chế ô nhiễm môi trường Với công nghệ sản xuất đơn giản sử dụng chất xúc tác enzyme của vi khuẩn đã phân lập được bổ sung vào phế liệu thủy sản (đầu, xương cá), chúng sẽ tự tách phần thịt

ra khỏi xương Với phần thịt được cô đặc giàu chất đặc giàu chất đạm trộn với thức

ăn cho tôm, phần xương được làm sạch, sấy khô, nghiền thành bột dùng cho chăn nuôi gia súc Biện pháp không những xử lý ngay được chất thải rắn với chi phí thấp,

mà còn mang lại hiệu quả kinh tế từ việc sản xuất ra thức ăn dùng cho chăn nuôi được người tiêu dùng chấp nhận

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Các nhà nghiên cứu trên thế giới từ lâu đã quan tâm đến lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan, protein và carotenoid từ phế liệu tôm bằng nhiều phương pháp như phương pháp hóa học, phương pháp sinh học hay kết hợp giữa phương pháp hóa học và sinh học

Quá trình sản xuất chtin – chitosan theo phương pháp hóa học diễn ra theo các bước sau:

Nguyên liệu → xử lý acid (khử khoáng)→ xử lý kiềm (khử protein và deaceatyl) → sản phẩm (có độ deaceatyl khác nhau)

Quy trình sản xuất chitosan của Pháp [6]

Hình 1.1 Quy trình sản xuất chitin của Pháp

Quy trình sản xuất này rút ngắn được thời gian sản xuất rất nhiều Sản phẩm thu được rất sạch có màu trắng đẹp do đã khử được sắc tố triệt để Tuy nhiên NaOCl là một chất oxy hóa mạnh nên ảnh hưởng đến mạch polymer làm cho độ

Vỏ tôm Hấp chín, phơi khô Xay nhỏ Tách protein

Rửa trung tính Ngâm HCl

Ngâm aceton

Ngâm NaOCl

Rửa trung tính Deacetyl chitin

Rửa trung tính

NaOH 40%

Nhiệt độ = 850

C Thời gian 4 giờ w/v = 1/4

NaOH 3,5%

Nhiệt độ = 650

C Thời gian 2h w/v = 1/10

HCl 1N Nhiệt độ phòng Thời gian 2 h w/v =1/10

NaOCl 0,135%

Nhiệt dộ phòng Thời gian 6 phút w/v = 1/10

Chitosan

nhớt của sản phẩm giảm rõ rệt Mặt khác, aceton rất đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm cao

Tách chiết chitin bằng phương pháp hóa học tuy có ưu điểm như đơn giản, hiệu quả, dễ triển khai ở qui mô lớn Tuy nhiên, phương pháp hóa học cũng có một

số nhược điểm như xử lý bằng acid và kiềm ở nồng độ cao, thời gian dài dẫn đến chất lượng sản phẩm chitin, chitosan thu được có độ nhớt và phân tử lượng thấp, đồng thời sản phẩm có thể còn chứa tạp chất hóa học, chưa tận thu nguồn protein và astaxanthin có giá trị để ứng dụng trong chế biến thức ăn Bên cạnh đó, lượng hóa chất thải ra từ qui trình sản xuất là rất lớn, gây ô nhiễm môi trường Vì vậy, việc hạn chế sử dụng hóa chất, cải tiến công nghệ theo hướng thân thiện môi trưởng, ứng dụng công nghệ sinh học trong chế biến chitin - chitosan là xu thế hiện nay nhằm nâng cao chất lượng chitin, chitosan, tận thu các thành phần có giá trị phi chitin (protein và astaxanthin,…), giảm thiểu chất thải hóa học, góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp chế biến chitin

Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto (2006) [25]

Hình 1.2 Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto

Quy trình này có ƣu điểm là rút ngắn đƣợc thời gian sản xuất rất nhiều Sản phẩm chitin thu đƣợc cho chất lƣợng khá tốt, màu trắng đẹp do đã đƣợc khử sắc tố trong công đoạn chiết astaxanthin Ngoài ra còn tận thu đƣợc protein và astaxanthin mang lại hiệu quả kinh tế cao, đồng thời giảm thiểu đƣợc lƣợng hóa chất sử dụng

Synowiecki và cộng sự (2000) nghiên cứu ứng dụng Alcalase để khử protein

của phế liệu vỏ tôm Cangon cangon thu hồi chitin - protein Ban đầu vỏ tôm Cangon cangon đƣợc khử khoáng sơ bộ bằng dung dịch HCl 10% ở 200C trong 30

pH = 8,5

t0 = 550C

tỷ lệ enzyme/ nguyên liệu: 3% w/v = 1/1

phút và khử protein bởi enzyme thương mại Alcalase ở 550C và pH 8,5 Độ thủy phân cao nhất 30% và dịch thủy phân thu được chứa 63% protein so với vật chất khô [34]

Nghiên cứu của Synowiecki và Al-Khateeb (2001) cho rằng enzyme tốt nhất cho việc phân tách carotenoprotein là Trypsin Phương pháp enzyme lấy đi khoảng 90% protein và carotenoid từ phế liệu tôm Protease nội tại thích ứng với nhiệt độ thấp rất hữu ích cho quá trình xử lý vỏ phế liệu giáp xác, phương pháp trên dựa trên việc kiểm soát tự động sự phân giải protein Sản phẩm đó thu được có chứa khoảng 4,5% carotenoid, đây cũng là nguồn hợp chất tốt để tạo màu đẹp cho cá hồi và lòng

đỏ trứng gà Việc xử lý sơ bộ phế liệu giáp xác bằng enzyme protease thương mại còn tăng hàm lượng carotenoid khoảng 58% [35]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Đối với phế liệu tôm thì các ngiên cứu trong nước từ trước tới nay chủ yếu tập trung ở các lĩnh vực thu hồi, tách chiết và ứng dụng chitin, chitosan Gần đây,

do sự cập nhật những thông tin khoa học mới về chitin – chitosan cũng như nhu cầu thị trường tăng mạnh, đã thúc đẩy các nhà khoa học trong nước nghiên cứu hoàn thiện quy trình tách chiết chitin – chitosan, đồng thời mở rộng những ứng dụng của chúng trong đời sống

Các quy trình tách chiết chitin, chitosan phần lớn là các quy trình hóa học, trong đó, ở mỗi công đoạn đều tiến hành xử lý bằng các loại hóa chất phù hợp (điều kiện xử lý phụ thuộc vào loại nguyên liệu và yêu cầu về chất lượng sản phẩm muốn thu nhận) Thời gian gần đây, để cải tiến quy trình sản xuất chitin – chitosan với tiêu chí giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng và nâng cao chất lượng sản phẩm thu hồi, đã xuất hiện một số đề tài nghiên cứu về việc ứng dụng enzyme protease trong quy trình sản xuất Chẳng hạn như sử dụng các loại enzyme Papain, Flavourzyme, Alcalase để khử protein trong quy trình sản xuất chitin (Trần Thị Luyến, 2000; Trang Sĩ Trung, 2008)

TS Trang Sỹ Trung [12] đã nghiên cứu quy trình sản xuất chitin bằng phương pháp kết hợp sinh học và hóa học có thể tận thu protein làm bột dinh

dưỡng, thức ăn cho gia súc, các chất khác như lipid và astaxanthin cũng được thu hồi trong quá trình sản xuất, giảm lượng hóa chất sử dụng và đặc biệt giảm lượng chi phí lớn cho công ty xử lý ô nhiễm môi trường Quy trình sản xuất như sau:

Hình 1.3 Quy trình sản xuất Chitin của TS Trang Sỹ Trung, trường

Đại học Nha Trang

Từ quy trình sản xuất cho thấy, thời gian để cho ra sản phẩm ngắn (khoảng

30 giờ), nồng độ hóa chất sử dụng thấp (NaOH 2%, HCl 4%), nhiệt độ thấp (500

C trong quá trình thủy phân bằng enzyme và ở nhiệt độ thường với việc sử dụng hóa chất) Bên cạnh đó lại có thể tận thu protein và astaxanthin góp phần làm tăng hiệu

Xay nhỏ Phế liệu vỏ đầu tôm

Khử protein bằng enzyme Flavourzyme

Thu dịch protein-astaxanthin

Khử protein còn lại bằng NaOH loãng

Rửa trung tính Khử khoáng bằng HCl Rửa trung tính

pH = 6,5 thời gian 6 giờ nhiệt độ 500

C enzyme/phế liệu : 0,1% (v/w)

Thời gian 12 giờ Nhiệt độ phòng NaOH 2%

Thời gian 6 giờ Nhiệt độ phòng HCl 4%

Chitin

quả kinh tế và giảm tác nhân gây ô nhiễm môi trường cung với giảm một lượng đáng kể nồng độ của những hóa chất độc hại gây tác động xấu cho chitin và môi trường Do đó, chất lượng chitin thu được rất cao và hiệu quả kinh tế thu được cũng cao Từ đây, mở ra một hướng nghiên cứu cho các nhà khoa học để có thể sản xuất

ra chitin chất lượng cao và có thể thân thiện với môi trường có thể ứng dụng trong sản xuất ở quy mô công nghiệp

Ngoài việc sử dụng nguồn phế liệu tôm để sản xuất chitin và chitosan như đã trình bày, một số nghiên cứu trong nước gần đây cũng tập trung vào quy trình tách

chiết các sắc tố carotenoid (chủ yếu là astaxanthin) Năm 1995, Nguyễn Văn Ngoạn

đã nghiên cứu thu hồi astaxanthin từ phế liệu tôm ở quy mô phòng thí nghiệm Quy trình sử dụng nguyên liệu đầu và vỏ tôm tươi, trải qua các công đoạn: khử protein, khử khoáng và thu hồi astaxanthin bằng dung môi acetone Quy trình này đã bước đầu cho phép kết hợp thu hồi cả protein, astaxanthin và chitin Bên cạnh đó (năm

2000) Nguyễn Thái Uyên, Mai Hoàng Dũng lại chiết xuất carotenoid từ vỏ tôm

bằng cách sử dụng cồn 960

(thời gian chiết trong 7 -10 ngày) Dịch chiết sau đó được cô cạn thành bột sệt màu cam và trộn vào thức ăn nuôi tôm, cá cảnh để nghiên cứu khả năng tạo màu của hỗn hợp này Đề tài “Xây dựng quy trình chiết xuất astaxanthin từ vỏ tôm” (Hoàng Thị Huệ An, 2002) đã trình bày phương pháp tách chiết astaxanthin bằng cách kết hợp cồn và ether dầu mỏ Sản phẩm astaxanthin thu được có thể dùng làm phụ gia trong chế biến thức ăn nuôi tôm, cá (dưới dạng dầu astaxanthin cô đặc hay bột màu astaxanthin)

Nhìn chung, các nghiên cứu nói trên chỉ mới tập trung thu hồi từng hợp chất một cách riêng lẽ; đặc biệt là đối với protein và astaxanthin, có rất ít những nghiên cứu về quy trình thu hồi chúng dưới dạng phức hợp carotenoprotein Điều này làm giảm tính bền vững của astaxanthin khi astaxanthin được thu hồi ở dạng phân tử tự

do

Trần Lê Minh (2010) [8] với đề tài : “So sánh khả năng thủy phân protein của 3 loại enzyme protease thương mại: Alcalase, Flavourzyme và Protamex trong quá trình thu nhận phức hợp carotenoprotein từ phế liệu đầu tôm” cho thấy khi sử

dụng Alcalase và Protamex (có hoạt tính endoprotease) thì hiệu suất thu hồi của 2 enzyme này cao hơn Flavourzyme (có hoạt tính exoprotease) Với enzyme Alcalase hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin lần lượt là 12,6% và 52,5% với tỉ lệ nước/phế liệu là 1/1; tỉ lệ enzyme/phế liệu là 1%; thời gian thủy phân là 1 giờ; pH

tự nhiên trong khoảng 6,0 – 6,5 Enzyme Protamex với hiệu suất thu hồi protein và carotenoid lần lượt là 22,5% và 52,3% trong điều kiện tỉ lệ nước/phế liệu là 1/1; tỉ lệ enzyme/phế liệu là 0,5%; thời gian thủy phân là 1 giờ; pH tự nhiên trong khoảng 6,0 – 6,5 Enzyme Flavourzyme với hiệu suất thu hồi protein và carotenoid lần lượt

là 35,0% và 45,7% trong điều kiện tỉ lệ nước/phế liệu là 1/1; tỉ lệ enzyme/phế liệu là 1%; thời gian thủy phân là 1,5 giờ; pH tự nhiên trong khoảng 6,0 – 6,5

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu:

2.1.1Nguyên liệu đầu tôm:

Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được lấy tại phân xưởng chế

biến Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17) Nguyên liệu sau khi lấy được vận chuyển ngay bằng thùng xốp cách nhiệt (<5 0C) về phòng thí nghiệm Phế liệu đầu tôm trước khi sử dụng được rửa sạch, để ráo Trong trường hợp chưa thí nghiệm ngay thì bao gói bảo quản đông trong điều kiện nhiệt độ - 20 0C tại phòng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường

2.1.2 Enzyme Alcalase

Enzyme Alcalase 2.4 L (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) Là protease

của Bacillus licheniformis với hoạt tính endopeptidase

Nhiệt độ bảo quản tốt nhất 0 - 100

Enzyme Flavourzyme 500 L được sản xuất từ quá trình lên men chìm loài

Aspergillus oryzae Flavourzyme là peptidase mang cả hai hoạt tính endo và

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ tổng quát thí nghiệm

Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Mô tả thí nghiệm: Nguyên liệu đầu tôm sau khi được thu mua và vận chuyển về phòng thí nghiệm được rửa sạch, để ráo rồi bổ sung 0,05% EDTA (w/w) sau đó xay nghiền với kích thước 2 - 3 mm, sau đó đem thủy phân qua hai giai đoạn Giai đoạn 1 với enzyme Alcalase ở điều kiện nhiệt độ 550C, thời gian và nồng

Nghiền nhỏ

Thủy phân bằng enzyme Alcase

Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme

Lọc qua vải lọc Kết tủa carotenprotein

Ly tâm thu kết tủa

Đánh giá chất lượng sản phẩm

Carotenoprotein

Nguyên liệu đầu tôm

Bổ sung 0.05% EDTA (w/w) so với nguyên liệu đầu

Nghiền nhỏ 2 - 3mm Giai đoạn 1:

Tỷ lệ enzyme/phế liệu: 0% → 0,4% Thời gian: 1h →5h

Nhiệt độ 550

C

Giai đoạn 2:

Tỷ lệ enzyme/phế liệu: 0% → 0,4% Thời gian: 1h →5h

Nhiệt độ 550

C

Ly tâm 3500 vòng/ 30 phút

độ enzyme Flavourzyme cố định (xác định thời gian và nồng độ enzyme Alcalase) nhằm xác định điều kiện tốt nhất cho enzyme Alcalase Sau khi tiến hành xác định dƣợc điều kiện thủy phân tối ƣu cho enzyme Alcalase tiến hành đánh giá hiệu suất thu hồi carotenoprotein Tiếp tục xác định thời gian và nồng độ cho enzyme Flavourzyme ở giai đoạn 2 ở điều kiện nhiệt độ 550C, thời gian và nồng độ enzyme Alcalase đã xác định ở giai đoạn 1 nhằm xác định điều kiện thủy phân tối ƣu khi kết hợp 2 enzyme

2.2.2 Xác định chế độ thích hợp để tách chiết protein giàu carotenoid từ đầu tôm bằng Alcalase

2.2.2.1 Xác định tỷ lệ enzyme/phế liệu thích hợp cho công đoạn thủy phân bằng Alcalase

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm cho công đoạn xác định tỷ lệ enzyme Alcalase

Ly tâm thu kết tủa

Đánh giá chất lƣợng sản phẩm

Carotenoprotein

Nguyên liệu đầu tôm

Bổ sung 0.05% EDTA (w/w) so với nguyên liệu đầu

Nghiền nhỏ 2 - 3mm

Nhiệt độ 550

C Thời gian 2 giờ

Nhiệt độ 550

C Thời gian 2 giờ

Tỷ lệ enzyme/phế liệu: 0,1%

Ly tâm 3500 vòng/ 30 phút