Chỉ tiêu vi sinh - Quy trình sản xuất yaourt bổ su- 123docz.net

4.2.3.1. Giới hạn cho phép của các vi sinh vật có trong sản phẩm chế biến từ thịt

(TCVN: 7049 - 2002)

VI SINH VẬT MỨC TỐI ĐA

Tổng số vi sinh vật hiếu khí (cfu/g)

Coliforms (cfu/g) Escherichia coli (cfu/g)

Clostridium perfringens (cfu/g) Salmonella (trong 25g)

Listeria monocytogenes (trong 25g) Staphylococcus aureus (cfu/g) Clostridium botulinum (trong 1g)

104 50 0 10 Không phát hiện Không phát hiện 100 Không phát hiện

4.2.3.2. Phương pháp xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật

• Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trong sản phẩm − Định nghĩa

Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm.

− Nguyên tắc

Tổng số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30oC/72h ± 6h hoặc 37oC/48h ± 6h.

Sơ đồ 4.1. Quy trình phân tích xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trong sản phẩm − Thuyết minh quy trình

+ Chuẩn bị mẫu

Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm vào 225ml dung dịch pha loãng mẫu. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 2,5 phút. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ có được dung dịch pha loãng 10-1.

25g mẫu + 225ml BPW → đồng nhất trong 30 giây → độ pha loãng 10-1

Pha loãng trong nước muối sinh lý → độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4

Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ môi trường PCA đã được làm nguội đến 45oC

Lắc đều và chờ đĩa thạch nguội → úp ngược → đem ủ ở nhiệt độ 30oC trong 72h

Đọc kết quả các kết quả từ 25- 250 khuẩn lạc

Tính toán kết quả: N A =

Dịch pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette (pipetman) vô trùng chuyển 1ml vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng → đồng nhất, ta sẽ có được dịch pha loãng 10-2. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết.

+ Đổ đĩa

Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến từ 30 – 300 tế bào vi sinh vật. Dùng micropipette với các đầu tip vô trùng để chuyển 1ml dịch pha loãng vào giữa đĩa petri vô trùng. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy từ 2 -3 đĩa. Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10- 15ml môi trường PCA đã nấu chảy làm nguội đến 45-50oC. Trộn đều mẫu vào môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3-5 lần. Đặt lên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc.

+ Ủ

Các đĩa được lật ngược lại và nuôi ủ ở 30oC trong 72 giờ. + Đọc kết quả

Hình 4.1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí

Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 30- 300 tế bào vi sinh vật để tính. Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong 1g mẫu được tính như sau:

N A (cfu/g) =

n1Vf1 + ….+ niVfi

Trongđó : A: số tế bào vi khuẩn(khuẩn lạc) trong 1g mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường f: độ pha loãng tương ứng

• Xác định tổng số Coliforms − Định nghĩa Coliforms

Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ

khí tùy nghi, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24- 48 giờ. Nhóm Coliforms hiện diện khắp nơi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị. Số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác.

− Nguyên tắc

Mẫu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Sau khi ủ 37oC ± 1oC trong 24 – 48 giờ, đếm số lượng khuẩn lạc Coliforms điển hình. Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng. Môi trường chọn lọc Coliforms là môi trường chứa lactose. Đây là nguồn carbon duy nhất, đồng thời môi trường còn chứa muối mật như một tác nhân chọn lọc và các tác nhân chỉ thị như neutral red, crystal violet. Khẳng định các dòng khuẩn lạc đặc trưng bằng môi trường canh chọn lọc như canh BGBL.

loãng 10

Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ môi trường TSA đã được làm nguội đến 45oC và chờ trong 30’

Đổ môi trường VRB lên môi trường TSA

Ủ nhiệt độ 37oC trong 24h

Chọn và đếm các khuẩn lạc có màu đỏ sen đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0.5mm

Ở mỗi đĩa chọn 3 -5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường BGBL

Tỷ lệ xác nhận R:

Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL

R = Số khuẩn lạc đã cấy Ủ 37oC ± trong 24 giờ Tổng số Coliforms (cfu/g) N A = x R nVf

+ Chuẩn bị mẫu

+ Cấy mẫu

Cấy chuyển 1ml dung dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy ít nhất vào 2 đĩa và chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp để cấy sao cho sau khi mỗi đĩa xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc.

Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và làm nguội đến 45oC, trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ. Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ để phục hồi khả năng của Coliforms. Đổ thêm 10 – 15ml môi trường VRB. Chờ môi trường đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 ± 1oC trong 24h.

+ Đọc kết quả

Chọn các đĩa có số đếm từ 10 – 100 khuẩn lạc Coliforms để tính. Khuẩn lạc

Coliforms có màu đỏ đến đỏ sậm và đường kính > 0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có

vùng tủa muối mật.

Hình 4.2. Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường VRB + Khẳng định

Quy trình khẳng định thực hiện như sau: chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa đã đếm được với các hình dạng khác nhau cấy chuyển sang môi trường canh BGBL và ủ ở 37oC trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi vi sinh vật sinh khí trong ống Durnham. Tỷ lệ xác nhận là tỷ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số khuẩn lạc khẳng định.

Hình 4.3. Kết quả khẳng định Coliforms trên môi trường BGBL + Tính toán kết quả

Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ xác định, tính mật độ của Coliforms theo công thức:

A(cfu/g hay cfu/ml) = x R

n1vf1 + … + nivfi

Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm được

ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng v: thể tích cấy vào mỗi đĩa

fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm R: tỷ lệ xác nhận

Kết quả Coliforms được làm tròn chẵn chục và được biểu diễn ở dạng số mũ có cơ số thập phân.

• Định tính E.Coli − Định nghĩa

Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ

khí tùy nghi, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở nhiệt độ 37oC trong 24 – 48 giờ.

Coliforms chịu nhiệt là Coliforms có khả năng lên men lactose, sinh acid và

sinh hơi ở nhiệt độ 44oC trong 24 – 48 giờ.

Coliforms phân (feacal Coliform) là Coliform nhiệt có thử nghiệm indol

trong môi trường trypton dương tính

E.Coli là Coliforms phân có nghiệm pháp IMVic lần lượt là + + - -.

− Nguyên tắc

Phương pháp này dung để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện E.Coli trong một khối lượng mẫu xác định.

Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh (BGBL), kiểm tra trên môi trường phân lập (EMB) và thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa phù hợp (nghiệm pháp IMViC).

Sơ đồ 4.3. Quy trình Định tính E.Coli pha loãng 10

Lấy 1ml mẫu ở độ pha loãng 10-1cho vào 10ml môi trường BGBL

Ủ ở 44oC ± 0,5 trong 24 giờ

Chọn các ống sinh hơi cấy chuyển sang môi trường EMB. Mẫu không sinh hơi được coi là âm tính

Ủ ở 37oC ± 0,5 trong 24 giờ

Cấy chuển sang TSA → Ủ ở 37oC ± 0,5 trong 24 giờ

Cấy vào môi trường 1 trypton, 2 MR – VP, 1 Simmons Citrate

Ủ ở 37oC ± 0,5 trong 24 giờ

Sử dụng các loại thuốc để test thử nghiệm IMViC

Khuẩn lạc đặc trưng của E.Coli trên EMB: tròn lồi, đường kính <0,5mm, có ánh kim tím

− Thuyết minh quy trình + Chuẩn bị mẫu

+ Tăng sinh

Cấy 1ml mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10-1 vào ống nghiệm chứa 10ml canh BGBL, ủ 44oC trong 24 giờ.

+ Phân lập

Sau 24 giờ , chọn các ống nghiệm cho phản ứng dương tính (môi trường đục và có sinh hơi) và cấy chuyển sang môi trường phân lập EMB. Ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Nhận dạng khuẩn lạc E.Coli : Khuẩn lạc tròn, màu tím, có bờ đều, đường kính 0,5 mm, có ánh kim tím.

Hình 4.4. Khuẩn lạc đặc trưng của E.Coli trên môi trường EMB + Khẳng định

Những khuẩn lạc nghi ngờ được thực hiện qua các bước thử nghiệm sinh hóa (thực hiện nghiệm pháp IMViC).

Chọn ít nhất 2 khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường phân lập cấy chuyển sang môi trường rắn không chọn lọc (môi trường TSA), ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Các thử nghiệm sinh hóa được dùng khẳng định E.Coli như sau:

STT Thử nghiệm sinh hóa Kết quả

1 2 3 4 Indol Methyl Red Voges Proskauer Khả năng sử dụng citrate + + - -

+ Báo cáo kết quả

Phát hiện hay không phát hiện E.Coli trong 25g mẫu. • Định tính Samonella.

− Định nghĩa

Salmonella là loại trực khuẩn, gram (-), yếm khí tùy tiện, dài 2-3µm, không

sinh bào tử, lên men glucose và manitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indol, không phân giải urê, sinh H2S.

Salmonella có nhiều trong các loại thịt tươi sống, cá, trứng, sữa, các loại thức

ăn cho gia súc.

− Nguyên tắc

Phát hiện có hay không Salmonella trong khối mẫu xác định. Quy trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm được thực hiện qua 4 bước:

+ Tiền tăng sinh + Tăng sinh chọn lọc + Phân lập

+ Khẳng định + Môi trường LDC − Quy trình thực hiện

Cân 25g mẫu + 225ml BPW, đồng nhất mẫu trong 30 giây → độ pha loãng 10-1

Đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24h

Lấy 0,1 ml canh trường cho vào 10ml môi trường RV

Ủ ở 42oC ± 0,5 trong 24 giờ

Cấy chuyển trên môi trường XLD và ủ ở nhiệt độ 37oC, 24h

Khuẩn lac đặc trưng của Salmonella trên XLD: tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm cả khuẩn lạc, môi

trường quanh chuyển sang đỏ

Cấy chuyển sang môi trường TSA

Ủ ở 37oC trong 24 giờ

Cấy chuyển vào môi trường thử nghiệm sinh hóa: môi trường TSI, Mannitol, phenol red broth, Urea broth, LDC both

Sơ đồ 4.4. Quy trình định tính Samonella − Thuyết minh quy trình

+ Tiền tăng sinh

Tiền tăng sinh các loại mẫu thông thường: cân 25g mẫu cho vào túi vô trùng. Thêm 225ml dung dịch peptone đệm và đồng nhất mẫu. Thời gian đồng nhất mẫu có thể là 15 hoặc 30 giây tùy theo từng loại mẫu. Ủ 37oC trong 24 giờ.

+ Tăng sinh chọn lọc

Trộn môi trường canh sau sau khi đã ủ 24 giờ trước khi cấy chuyển 0,1mm sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV. Sau đó, ủ mẫu ở nhiệt độ 42oC trong thời gian 24 giờ.

+ Phân lập

Dùng que cấy vòng lấy một vòng sinh khối vi sinh vật từ môi trường tăng sinh chọn lọc RV cấy ria lên môi trường chọn lọc Salmonella là môi trường XLD. Trên môi trường XLD, khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không tâm đen. Một số dòng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc. Môi trường XLD chuyển sang màu hồng.

Ủ ở 37oC trong 24 giờ

Biểu hiện đặc trưng của Salmonella: Trên TSI: đỏ/vàng/H2S(+)/gas(+); Mannitol(+); Urea(-), LDC(+)

Hình 4.5. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD

Tất cả các đĩa môi trường sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 37oC trong 22 – 26 giờ. Sau khi ủ, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella để khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và thừ nghiệm các đặc tính kháng nguyên.

+ Khẳng định

Khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella phải được kiểm tra sinh hóa và kháng huyết thanh. Từ mỗi môi trường phân lập, cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc (môi trường TSA), ủ ở 37oC trong 24 giờ, các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng để thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh.

+ Khẳng định bằng thừ nghiệm sinh hóa

Các thử nghiệm sinh hóa chính được sử dụng cho Salmonella là lên men glucose, lactose, saccharose, H2S, urea, indol, VP, ODC, LDC, mannitol. Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm như sau:

Thử nghiệm trên môi trường KIA hoặc TSI: Salmonella chỉ lên men được glucose trong các môi trường nói trên vì thế phần nghiêng có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện màu đen trên môi trường. Có thể có hiện tượng sinh hơi qúa làm vỡ thạch môi trường này hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo ra một khoảng trống bên dưới ống nghiệm.

Hình 4.6. Kết quả trên môi trường TSI

Thử nghiệm LDC (+): sau khi nuôi cấy, môi trường chuyển thành kiềm, màu môi trường được chuyển sang màu ban đầu.

Hình 4.7. Thử nghiệm LDC (+)

Thử nghiệm urea (-): Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng cam.

Hình 4.8. Thử nghiệm Urea (-)

Lên men mannitol (+): môi trường sau khi nuôi cấy bị acid hóa chuyển sang màu vàng.

Hình 4.9. Thử nghiệm Mannitol (+) Thử nghiệm Indol, VP (-)

+ Khẳng định bằng thử nghiệm kháng huyết thanh

Thử nghiệm kháng huyết thanh phải được thực hiện song song với mẫu trắng (dung dịch nước muối sinh lý) nhằm loại trừ khả năng ngưng kết giả. Dùng kháng huyết thanh Salmonella polyvalent O và Salmonella polyvalent H. Phản ứng dươnng tính khi sinh vật thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh nhưng không có hiện tượng ngưng kết với nước muối sinh lý.

+ Báo cáo kết quả

Với quy trình kiểm nghiệm này, cho phép kết luận có hoặc không có

Salmonella được phát hiện trong 25g mẫu. Tuy nhiên không cho phép phân biệt các

dòng Salmonella hiện diện trong mẫu. Để khẳng định được dòng Salmonella nào nhiễm vào trong thực phẩm thì phải thực hiện thử nghiệm ngưng kết với các loại kháng huyết thanh đơn giá khác nhau, đồng thời có thể gởi chủng tới các phòng thí nghiệm chuyên định danh vi sinh vật.

• Định lượng Staphylococcus aureus − Định nghĩa

Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tùy ý, hình cầu, gram