Nghiên cứu quy trình sản xuất cao đặc hai loài diệp hạ châu quy mô pilot

Nước ta có ít nhất 2 phân loài giống P.a • Đã đề xuất phương pháp hong khô dược liệu thay thế cho phơi nắng • Đã định lượng được nhóm chất có hoạt tính trong cao đặc là Alcaloid và Ligna

Bộ Y tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Tên đề tài

Nghiên cứu quy trình sản xuất

cao đặc hai loài diệp hạ châu

quy mô pilot

Chủ nhiệm đề tài : DS Nguyễn Văn Phong

Cơ quan chủ trì đề tài : Công ty cổ phần hóa d−ợc việt nam M∙ số đề tài: 01/06-10 Nghiên cứu KHCN phát triển nguồn d−ợc liệu và thuốc cổ truyền

7267

30/3/2009

Hà Nội, 2008

Bộ Y tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Tên đề tài

Nghiên cứu quy trình sản xuất

cao đặc hai loài diệp hạ châu

quy mô pilot

Chủ nhiệm đề tài : DS Nguyễn Văn Phong

Cơ quan chủ trì đề tài : Công ty cổ phần hóa d−ợc việt nam Cấp quản lý: Bộ Y tế

Thời gian thực hiện: Từ 01/2007 đến 12/2008

Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 1400 Triệu đồng

Trong đó kinh phí SNKH: 800 Triệu đồng

Hà Nội, 2008

Báo cáo kết quả đề tài nghiên cứu cấp bộ

1 Tên đề tài

Nghiên cứu quy trình sản xuất cao đặc hai loài Diệp hạ châu quy mô pilot

2 Chủ nhiệm đề tài: DS Nguyễn Văn Phong

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Công ty cổ phần hóa dược việt nam

4 Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y Tế

5 Thư ký đề tài: KS DS Nguyễn Mạnh Hựng

6 Phó chủ nhiệm đề tài: PGS TS Lờ Xuõn Quế

7 Danh sách những người thực hiện chính

8 Các đề tài nhánh (đề mục) của đề tài (nếu có)

9 Thời gian thực hiện: Từ 1/2007 đến 12/2008

Những chữ viết tắt*)

*) Một số chữ viết tắt trong mục Tài liệu tham khảo không được liệt kê và giả thích trong mục này

Môc lôc

Phần A: Tóm tắt kết quả nổi bật của đề tài (chủ nhiệm ĐT tự đánh giá) 8

1.2 Kết quả cụ thể (các sản phẩm cụ thể) 8

1.3 Hiệu quả về kinh tế 9 1.4 Hiệu quả về xã hội 9

2 Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội 10

3 Đánh giá thực hiện ĐT (đối chiếu với ĐCNC được phê duyệt ) 10

(a) Tiến độ 10 (b) Thực hiện mục tiêu nghiên cứu 10

(c) Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cương 11

(d) Đánh giá việc sử dụng kinh phí 11

4 Các ý kiến đề xuất 11

Phần B: Nội dung báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ 12

1.3 Mục tiêu nghiên cứu 13

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 18

3.1 Thiết kế nghiên cứu 24 3.2 Mẫu và đối tượng nghiên cứu 24

3.3 Phương pháp nghiên cứu 24

3.3.1 Chỉ tiêu nghiên cứu 24

3.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu 25

3.3.3 Một số thiết bị hóa chất vật tư chính 30

3.3.4 Xây dựng Quy trình sản xuất cao đặc qui mô pilot 31

4 Kết quả nghiên cứu 32

4.1.1 Chi DHC (Phyllanthus) 32

4.1.2 Phyllanthus amarus Schum et Thonn 32

4.1.3 Phyllanthus urinaria Linn 33

4.1.4 Nguồn dược liệu DHC ở nước ta 34

4.2 Thu hái sơ chế và bảo quản dược liệu 38

4.2.2 Nguồn dược liệu 38 4.2.3 Quy trình thu hái, sơ chế 38

4.2.4 Quy trình bảo quản dược liệu 39

4.4.1 Định tính hóa học DHC đắng 45

4.4.2 Hàm lượng tro DHC đắng 50

4.4.3 Nghiên cứu chiết DHC đắng bằng nước quy mô PTN 50

4.4.4 Chiết DHC đắng bằng cồn/nước 30/70 trong PTN 53

4.4.5 Chiết DHC đắng bằng cồn/nước 50/50 trong PTN 56

4.4.6 Chiết DHC đắng bằng cồn 94o trong PTN [12,25] 58

4.4.7 Hàm lượng hoạt chất trong DHC đắng 59

4.5.1 Định tính thành phần hóa học DHC (P.u) 60

4.5.2 Định lượng một số hoạt chất DHC (P.u) 61

4.6 Bàn luận kết quả nghiên cứu phòng thí nghiệm 61

4.6.1 So sánh định tính thành phần hóa học 61

4.6.2 So sánh định lượng thành phần hóa học hai loài P.a và P.u 62

4.6.3 So sánh hiệu quả chiết của dung môi 63

4.6.4 Bàn luận về quy trình chiết phòng thí nghiệm 64

4.6.5 Lựa chọn dung môi và quy trình chiết pilot 65

4.7 Điều chế cao đặc hai loài P.a và P.u qui mô pilot 66

4.7.1 Kết quả chiết pilot tạo cao đặc 66

4.7.2 Kết quả phân tích kiểm tra cao đặc chiết pilot 67

4.7.3 Bảo quản nghèo oxi hai loài cao đặc p.a và p.u 72

4.8.1 Nguyên phụ liệu dung môi hoá chất 74

4.8.3 An toàn lao động 76

4.8.4 Sơ đồ Quy trình sản xuất 77

4.8.5 Mô tả Quy trình sản xuất qui mô pilot cao đặc DHC 78

4.8.6 Kiểm tra chất lượng 80

4.8.7 Bã chiết – bảo vệ môi truờng 80

4.8.8 Các hồ sơ và sổ ghi chép cần thiết cho sản xuất cao 81

4.8.9 Quản lý chất lượng 82

4.9 Sản xuất 200 kg cao đặc DHC đắng 83

4.9.1 Nguyên liệu 83

4.9.3 Hiệu suất chiết – tạo cao đặc 83

4.10 Đánh giá chất lượng cao đặc sản xuất được 84

4.10.6 Phiếu kiểm nghiệm 92

4.11.1 Tiêu chuẩn nguyên liệu DHC đắng P.a 93

4.11.2 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cao đặc DHC 96

4.12.2 Nội dung xây dựng mẫu mã thương hiệu 100

4.12.3 Kết quả xây dựng mẫu mã thương hiệu 101

5 Bàn luận 103

6 Kết luận và kiến nghị 105

7 Tài liệu tham khảo 108

Phần A Tóm tắt kết quả nổi bật của đề tài

1 Kết quả nổi bật của đề tài

1.1 Đóng góp mới của đề tài

• Đã xác định được không chỉ có 1 loài Phyllanthus amarus Schum et Thonn (P.a)

duy nhất Nước ta có ít nhất 2 phân loài (giống) P.a

• Đã đề xuất phương pháp hong khô dược liệu thay thế cho phơi nắng

• Đã định lượng được nhóm chất có hoạt tính trong cao đặc là Alcaloid và Lignan

• Đã xây dựng được Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot

• Đã áp dụng phương pháp bảo quản chống oxy hóa, kín khí nghèo oxy, cho bảo quản dược liệu và cao đặc DHC đắng

1.2 Kết quả cụ thể (các sản phẩm cụ thể)

* Về xác định tiêu chuẩn hóa dược liệu

Thu thập đ ược dược liệu DHC tại các địa điểm Thái Nguyên, Bắc Giang, Cát

Bà, Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Yên Bài , phân biệt được loài P.a và loài P.u

* Về bao gói bảo quản

Đã bảo quản thử nghiệm trong điều kiện nghèo oxy cho dược liệu và cao đặc thành phẩm, đạt chất lượng và kéo dài được thời gian lưu kho

* Về xây dựng thương hiệu

Đã xây dựng tiêu chuẩn dược liệu DHC đắng, tiêu chuẩn chất lượng cao đặc thành phẩm

Đã sản xuất hơn 200kg cao đặc DHC, và ổn định Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot, bước đầu cung ứng sản phẩm cao đặc cho thị trường

* Về đào tạo

Góp phần đào tạo 01 cao học với luận văn ‘Nghiên cứu hóa học thực vật

cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) mọc hoang tại Thái Nguyên’, kết

quả tốt

* Về công trình công bố

- 01 bài báo trên tạp chí Hóa học : Nguyễn Văn Phong, Nguyễn Mạnh Hùng, Nguyễn Văn Thông, Đinh Văn Thịnh, Đỗ Thị Lan Hương, Lê Xuân

Quế, Nghiên cứu chế tạo cao diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus

Schum et Thonn qui mô pilot, TC Hóa học, T.46, 5A, 2008, tr.454-457

- 01 tham dự Hội thảo ‘Nghiên cứu và phát triển các sản phẩm tự nhiên’

14/11/2008, ĐHBK Hà Nội

1.3 Hiệu quả về kinh tế

Đã sản xuất 2000kg cao đặc thành phẩm và tính theo giá thị trường có thể

thu hồi vốn đầu tư sản xuất pilot sau 1 - 2 năm

1.4 Hiệu quả về xã hội

• Giải quyết việc làm cho nông dân thu hái cây DHC đắng mọc tự nhiên và gieo trồng loại cây này

• Góp phần phát triển ngành công nghệ hóa dược

• Từng bước đưa công nghệ sản xuất có tính công nghiệp trong việc khai thác nguồn thảo mộc cho đông dược

2 Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội

• Đã phối hợp với công ty dược phẩm Đà Nẵng bào chế thuốc điều trị bệnh gan từ cao đặc DHC đắng sản xuất tại CTCP Hóa Dược Việt Nam

• Một phần nhỏ sản phẩm cao đặc DHC đắng đã được sử dụng trực tiếp không cần bào chế, thay thế cho việc ‘sắc’ thuốc truyền thống hay ‘hãm’ chè từ DHC khô

3 Đánh giá thực hiện đề tài so với đề cương đã được phê duyệt

(a) Tiến độ: Đúng theo tiến độ

(b) Thực hiện mục tiêu nghiên cứu

Thực hiện đầy đủ các mục tiêu nghiên cứu đề ra

(c) Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cương

• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong đề cương

• Chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu như đã ghi trong đề cương

• Khối lượng cao đặc sản xuất được vượt nhiều lần so với dự kiến

(d) Đánh giá việc sử dụng kinh phí

Kinh phí đã được thực hiện theo định mức, nội dung và đối tượng chi như đã được phê duyệt trong đề cương, đã thanh quyết toán xong

4.2 Đề nghị Bộ Y tế xem xét cho phép xây dựng một dự án ‘‘Công nghệ hóa thảo dược Việt Nam phòng chống và điều trị bệnh gan’’, cơ quan chủ trì xây

dựng Dự án sẽ là Công Ty Cổ Phần Hóa Dược Việt Nam, ngoài ra còn có các cơ quan phối hợp các bộ các ngành

Theo Tổ chức Y tế Thế giới, trên thế giới hiện có đến trên 350 triệu người (khoảng 5% dân số thế giới) viêm gan B mãn tính Châu Á có số người mắc bệnh mãn tính nhiều nhất, trên 200 triệu Hàng năm có đến 2 triệu người nhiễm virus viêm gan B bị chết do ung thư gan, viêm xơ gan Chưa kể đến số bệnh gan do phơi nhiễm đối với hoá chất, thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, các loại ô nhiễm môi trường khác Vì vậy nhu cầu thực tế về thuốc trị bệnh gan sẽ rất lớn

Phần B Nội dung báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ

1 Đặt vấn đề

1.1 Tình hình chung – tính cấp thiết

Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, có hệ thực vật rất phong phú, đa dạng, với khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài đã được nhân dân ta dùng làm thuốc [3, 4], là nguồn tài nguyên thiên nhiên quí báu, nguồn gen vô giá không phải quốc gia nào cũng có

Hệ thực vật phong phú là tiền đề cho sự phát triển ngành hoá học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta, là nguồn nguyên liệu có giá trị cho ngành hóa dược đang trên đà phát triển

Các phương thuốc y học cổ truyền, các nguồn đông dược có những ưu thế nhất định, đối với nhiều lĩnh vực y tế có tính vượt trội cao, nhất là độc tính thấp, hiếm khi có tác dụng không mong muốn, và dễ sử dụng Nguồn tài nguyên sinh học này có thể tái tạo tự nhiên hay nhân giống và sinh khối nhân tạo, không gây

ô nhiễm môi trường, không làm tổn hại đến môi sinh Hiện có tới 60%-70% các loại thuốc chữa bệnh đang lưu hành hoặc đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên [3]

DHC là một cây thuốc quí, được nhiều nước trên thế giới sử dụng, ngày càng đuợc quan tâm nghiên cứu DHC có tác dụng bảo vệ gan, chống viêm gan, làm phục hồi chức năng gan và ức chế virus viêm gan B phát triển Nhiều chế phẩm bào chế từ DHC đã được lưu hành ở nước ta, thay thế một phần thuốc nhập đắt tiền, mang lại lợi ích hết sức thiết thực về y tế, xã hội, và đặc biệt về kinh tế cho bệnh nhân bị bệnh gan ở nông thôn

Tuy nhiên việc sản xuất thuốc còn phụ thuộc thời vụ thu hái, việc chế biến nguyên liệu, bào chế bán thành phẩm còn thủ công, nhỏ lẻ, chất lượng sản phẩm chưa ổn định

Để sản xuất qui mô lớn, có tính công nghiệp, cần có nguồn nguyên liệu ổn định, cả về chất lượng và số lượng, không bị ảnh hưởng bởi thời vụ thu hái Vì vậy việc chiết hoạt chất tạo cao đặc qui mô đủ lớn, làm nguồn nguyên liệu ổn định đảm bảo chất lượng cao cung ứng cho bào chế thuốc là hết sức cần thiết

1.2 Giả thiết nghiên cứu của đề tài

Từ nhu cầu cấp thiết trên đây và thực tế sử dụng đông dược nói chung và DHC nói riêng, có thể giả thiết xây dựng được Quy trình sản xuất qui mô pilot cao đặc DHC, tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng, và đảm bảo tính ổn định lâu dài của sản phẩm

1.3 Mục tiêu của đề tài là

Xuất phát từ nhu cầu thực tế, giả thiết trên đây, đề tài đề ra mục tiêu sau:

• Xây dựng quy trình sản xuất cao đặc qui mô pilot

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn ) và Diệp

hạ châu (Phyllanthus urinaria L.)

• Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng hai loại cao này

• Theo dõi độ ổn định của cao

hạ châu theo phương pháp của y học hiện đại

2.1.1.1 Về thực vật học

DHC từ lâu được sử dụng làm thuốc ở nhiều nước : Trung Quốc, Ấn độ, các nước Nam Mỹ (Peru, Achentina, ) Trên thế giới đã phát hiện trên 700 loài Diệp hạ châu, với tên gọi dân gian rất khác nhau, nhưng trong số được nghiên cứu nhiều nhất

vẫn là hai loài Phyllanthus amarus Schum et Thonn và Phyllanthus urinaria L

Có thể liệt kê một số tài liệu khoa học nghiên cứu về hai loài DHC này:

1 Nghiên cứu về loài Phyllanthus urinaria L [28, 34, 37, 38, 50]

2 Nghiên cứu về loài Phyllanthus amarus Schum et Thonn [25, 29, 33, 36, 41, 42,

49, 59, 62]

Ngoài ra còn có một số loài khác được nghiên cứu:

3 Nghiên cứu về loài Phyllanthus niruri [46, 48, 50, 67]

4 Nghiên cứu về loài khác (Phyllanthus acidus [55], (Phyllanthus emblica-) [52])

5 Nghiên cứu về Phyllanthus, không phân biệt loài nào [63, 69, 70] cho thấy

khả năng sử dụng hỗn hợp các loài Diệp hạ châu

2.1.1.2 Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học

Các nhóm chất chính có giá trị về tác động sinh học [27, 35, 44, 64]

- Lignan (có nhiều trong lá, thân), gồm các hợp chất chính sau:

+ Phyllanthin và Hypophyllanthin, có tới > 0,3% khối lượng (w)

+ Lintetralin, Lintetralin ( 4-hydroxy: Seco:, iso:) : > 0,02% w

+ Niranthin, Niranthin (demethylenedioxy, hydroxy): > 0,04% w

+ Nirphyllin, Nirtetralin > 0,09% w

- Flavonoid (trong lá, thân):

+ Catechin,(+):, Catechin, epi: (-):;Catechin-3-o-gallate,epi: (-):

+ Gallocatechin, (+):;Gallocatechin, epi: (-): ; Gallocatechin-3-o-gallate, epi: (-): + Phyllanthus Flavonoid FG-1 ; Phyllanthus Flavonoid FG-2

+ Cholesterol, 24-iso-propyl: ; Estradiol ; Fraternusterol ;

+ Phyllanthosecosteryl Ester ; Phyllanthosterol ; Phyllanthostigmasterol ; β- Sitosterol Ngoài ra còn có tannin, lipid, coumarin

Còn có nhiều nghiên cứu mới về hoá học của DHC [35, 44, 45, 64]

2.1.1.3 Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học

Nghiên cứu khả năng chữa bệnh của DHC có các nội dung sau:

a/ Tác dụng hồi phục gan, điều trị viêm gan B, các bệnh khác về gan [28, 33,

đ/ Tác dụng chống ung thư (anticancer-cytotoxicity), chống HIV, [30, 45, 54]

2.1.1.4 Kết quả nghiên cứu về độc tính

Trong suốt thời gian hơn 30 năm nghiên cứu và sử dụng DHC để điều rị bệnh, trên thế giới chưa ghi nhận trường hợp ngộ độc nào

2.1.2 Một số chế phẩm từ DHC của nước ngoài

1 Sản phẩm từ DHC: bột lá, hạt (seeds), dịch cồn (tinture) Bột lá khô 5g pha nước nóng uống (như pha chè) http://www.tropilab.com/shatterst.html

2 CT ChromaDex (www.chromadex.com) sản phẩm Phyllanthin và

hypophyllantin, Quercetin (5mg, 10mg)

3 CT Pharmasave: Bột DHC 200mg/lần, 3 lần/ngày, điều trị bệnh gan, kể cả

u gan (http://www.nhiondemand.com/)

4 Live 52 của Ấn Độ,

2.1.3 Chiết Diệp hạ châu

Chiết DHC được thực hiện chủ yếu với dung môi nước, tiếp theo là

dung môi cồn/nước Quy trình chiết DHC được giới thiệu trong hình 1.3:

* Thu hái: có thể chiết ngay tất cả các bộ phận của cây thu hoạch được, hoặc

chiết từng bộ phận riêng biệt, đặc biệt là lá, thân cây

* Xử lý sơ chế: Có thể xử lý sản phẩm thu hái trước khi chiết, ví dụ phơi sấy

khô, cắt hoặc xay nghiền nhỏ Ví dụ chiết 10kg nguyên liệu / 100 lít nước

* Chiết: chiết truyền thống sử dụng dung môi nước Có thể sử dụng rung siêu âm để

chiết Thiết bị chiết thường làm bằng thép không gỉ

* Quá trình lọc: chiết theo phương pháp thông dụng với nguồn nguyên liệu xác

định, như thu hái tự nhiên hoặc canh tác có giám sát, lọc chỉ để loại bỏ phần xơ bã

* Cô đặc có thể làm tiêu hao một phần hoạt chất do bay hơi, phân huỷ, và đặc biệt là

oxi hoá Thông dụng nhất là cô đặc áp suất thấp

* Công đoạn bao gói bảo quản rất quan trọng đối với sản phẩm lưu kho lâu dài

Hình 1.3 Các công đoạn chủ yếu trong Quy trình chiết xuất Diệp hạ châu

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

còn là tên lưu hành thông dụng ở nước ta chỉ chung các loài cây thuốc cổ truyền

thuộc chi DHC (Phyllanthus), rất có giá trị và đã được sử dụng trong dân gian

hàng nghìn năm nay, không chỉ ở nước ta mà còn ở nhiều nước khác trên khắp thế giới, điển hình là Ấn Độ, Nam Mỹ

Chi DHC (chi Phyllanthus) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae),

Chi Phyllanthus là một trong những chi lớn nhất của họ Thầu dầu, với

khoảng hơn 700 loài, phân bố khắp nơi đặc biệt tập trung ở vùng Đông Nam Á

và vùng nhiệt đới của Nam Mỹ Hai loài DHC được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là [6-10, 13-18, 20 24 26]:

1 Cây Diệp hạ châu (cây chó đẻ răng cưa) không có vị đắng, có tên khoa

học là Phyllanthus urinaria L., được dân gian sử dụng làm thuốc chữa nhiều

loại bệnh và được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây [8, 20, 60, 61]

2 Cây DHC đắng có tên khoa học là Phyllanthus amarus Schum et

Thonn mọc hoang phổ biến ở nước ta và nhiều nước khác trên thế giới, được sử dụng để chữa đinh râu, mụn nhọt, lở loét, rắn cắn…, và đặc biệt là thuốc chữa viêm gan có hiệu quả, được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu [8, 9, 10, 13, 15,

a/ DHC Phyllanthus urinaria L

b/ DHC đắng Phyllanthus amarus Schum et Thonn

Hình 1.1 Ảnh hai loài Diệp hạ châu

Bảng 1.1 Một số đặc điểm của hai loại cây DHC [61]

Bộ phận DHC đắng Phyllanthus amarus

Schum et Thonn

Diệp hạ châu

Phyllanthus urinaria L

Thân cành tròn, hình trụ dẹt, có hai mấu cạnh

Lá nhỏ, mỏng, gân mờ to dày hơn, gân mập nổi rõ Cụm hoa hoa đực và hoa cái mọc trên

cùng đốt

hoa cái ở dưới, hoa đực ở trên cành

Bề mặt quả trơn nhẵn nhăn hoặc gai

Trần Đình Thắng và đồng tác giả [16] đã nghiên cứu phân lập và xác định

một số chất phenolic từ cây DHC Phyllanthus urinaria L

Nhiều tác giả đã nghiên cứu so sánh hai loài DHC trên [61]

- Chiết được Alcaloid bằng hỗn hợp dung môi CHCl3-MeOH (9:1)

- Chiết được polyphenol bằng hỗn hợp dung môi CHCl3-EtOAc-HCOOH (7:3:1)

Các chất Alcaloid của DHC đắng (P a) được nghiên cứu và giới thiệu

trong [24] Viện Dược liệu chế tạo Phyllantin từ bột cao khô DHC [9] Các hợp chất Lignan được chiết xuất và nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan [60]

Hoạt tính sinh học của các chất chiết xuất từ DHC đã chứng minh [14]

+ Chống oxi hoá (phương pháp DPPH) (Hypophyllantin và Phyllantin)

+ Hoạt tính kháng vi sinh vật (8 chủng điển hình, trong đó có Escherichia coli) tác động của Hypophyllantin, Phyllantin được so sánh với penicilin + Sử dụng 3 chủng vi sinh để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của hai chất trên, Hypophyllantin và Phyllanthin đều có khả năng chống oxi

hoá, kháng khuẩn 3 chủng E coli, B subtilis và S cerevisiae

- Thử nghiệm độc tính tế bào (cytotoxicity), đối với tế bào Caco2 (human colonic carcinoma cell line- Abcam) cho thấy Alcaloid chiết từ DHC có tác dụng dương tính trên tế bào Caco2 [24, 61]

- Một số nghiên cứu khả năng bảo vệ khôi phục chức năng gan [9, 15, 26]:

+ Đối với chuột, sử dụng dịch chiết DHC qua đường uống 15 ngày trước khi tác động CCl4, CCl4 + dầu oliu (qua đường uống), 24h sau tác động, máu chuột được kiểm tra ALT và AST Kết quả cho thấy cả hai loài DHC đều có tác dụng bảo vệ gan rất rõ nét

+ Rễ, thân, lá đều có tác dụng bảo vệ gan, thân lá có hiệu quả cao hơn [26]

- Bột cao DHC đắng (bột Phyllanthin), 1g tương đương 11g dược liệu khô, được thử nghiệm trên động vật (chuột và thỏ) [9] Kết quả: bột phyllantin

có tác dụng bảo vệ gan, chống viêm và xơ gan, lợi tiểu, lợi mật [9], nhất là tác dụng bảo vệ chống viêm xơ gan rất rõ rệt

- Chế phẩm Hepamarin có tác dụng của chế phẩm chống viêm gan [10, 18]

Về hiệu quả kinh tế, điều trị bằng Hepamarin chỉ hết hơn 1200000đ/3 tháng, khoảng 1/10 so với điều trị bằng Intron A (11 880000đ/3 tháng)

2.2.1.4 Về độc tính [ 9, 10, 13, 14, 15, 18, 21, 24, 26, 61]

Độc tính của DHC được quan tâm nghiên cứu bằng nhiều phương pháp

- Bột DHC đắng (Phyllan amarus Schum et Thonn.) đã loại tạp chất gọi là

Phyllatin, được thử độc tính cấp và độc tính bán trường diễn [9]:

+ 500g dược liệu khô cho 1kg chuột trong một tuần, cả lô 10 con chuột đều khỏe mạnh [9] Không tìm được LD50 Như vậy DHC có độc tố rất thấp, có

độ an toàn cao trong việc dùng làm thuốc điều trị bệnh

+ Độc tính bán trường diễn được thử nghiệm trên thỏ với liều 10g khô/kg/ngày trong vòng 30 ngày liền, không biểu hiện nhiễm độc về mặt sinh hoá, huyết học và tổ chức học [9]

Kết qủa nghiên cứu này phù hợp với kết quả công bố trên thế giới

2.2.2 Chế phẩm từ DHC

1 Hemaparin (XN dược COPHAVINA sản xuất [10, 18]

2 Phyllanthin (Viện dược liệu) [9, 21]

3 Viên bao phim VG-5 (CTCP Dược DANAPHA), Sylgan-S

4 Viên BOBINA, Viên nang Hamega (CT Dược thảo Phúc Vinh)

5 Liver 94 (Viện 103 và Bệnh viện Thanh Nhàn, Hà Nội)

6 Bột DHC đắng- hepaphyl, [Bệnh viện Quân khu IV và XN Dược phẩm Trung ương),

7 Trà DHC (Viện dược liệu,), DHC (CTCP Dược phẩm 2/9)

8 Viên bao phim LIVSIN-94 (Nhà sản xuất HATAPHAR)

9 Sirô ORALLIVER (CTCP Dược phẩm Hà Tây),

3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

3.1 Thiết kế nghiên cứu

Đề tài được thiết kế nghiên cứu xây dựng và triển khai Quy trình sản xuất cao đặc DHC ở mức pilot

3.2 Mẫu và đối tượng nghiên cứu

Cây DHC đắng (P.a) và DHC (P.u) là đối tượng nghiên cứu của đề tài Cả hai loài DHC này đều được lựa chọn theo kết quả đánh giá về thực vật học

Mẫu cây DHC được khảo sát tại nhiều vùng (Bắc Giang, Hải Dương, Thái Nguyên, Thái Bình, Hà Nội, Yên Bái, Hải Phòng, Cát Bà …), được thu hái tự nhiên Phần lớn DHC khô làm nguyên liệu sản xuất được thu mua trong dân Các

mẫu thí nghiệm được thu hái và phân loại, nghiên cứu thực vật học, định tính, định lượng và chiết xuất tạo cao đặc

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Chỉ tiêu nghiên cứu

• Chỉ tiêu: Nguồn nguyên liệu

• Chỉ tiêu phân loại nhận dạng về thực vật học

• Chỉ tiêu thành phần hóa học của DHC

• Chỉ tiêu Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot

• Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm cao đặc (tính chất, độc tính, bảo vệ gan)

• Chỉ tiêu độ ổn định của cao

• Chỉ tiêu tiêu chuẩn hóa nguyên liệu và sản phẩm

3.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu

3.3.2.1 Phương pháp đánh giá nguồn nguyên liệu

- Khảo sát tại các địa phương, cả hai nguồn : nguồn DHC mọc tự nhiên và nguồn DHC gieo trồng theo thời vụ hàng năm [17]

- Khảo sát khả năng sơ chế

- Khảo sát tài liệu, số liệu lưu trữ, thông tin về việc sử dụng DHC

3.3.2.2 Phương pháp phân loại nhận dạng về thực vật học

- Nghiên cứu tổng quan tài liệu thực vật học các loài DHC [6, 7, 17, 47]

- Ý kiến chuyên gia (Viện Sinh Thái Tài Nguyên, Đại học sư phạm Hà Nội II)

- Quan sát mô tả hình thái học (cây, cành, lá, hoa quả, màu sắc, vị)

- Định tính thành phần hóa học

3.3.2.3 Phương pháp định tính và định lượng thành phần hóa học của DHC

Cả hai phương pháp định tính và định lượng thành phần hóa học chủ yếu đều dựa theo tài liệu [12, 22]

*) Định tính: Phương pháp định tính theo tài liệu [12, 22], các chất : Alcaloid, Coumarin, Dầu béo, Đường khử, Flavonoid, Protit, Saponin, Tanin, Xianua

Một số ví dụ định tính nhóm hoạt chất

+ Định tính Alcaloid

a) Lấy 50 ml dịch chiết DHC, kiềm hóa bằng 10ml dung dịch NH3 25%) Tiếp tục rót vào khoảng 50 ml CHCl3 lắc mạnh và để cho phân lớp, dịch chiết được lọc và chuyển vào phễu chiết, thêm vào phễu chiết 10 ml dd HCl 10% Hỗn hợp được lắc đều cẩn thận rồi để yên trong vài phút Lớp cloroform tách ra còn lại lớp axit Lấy phần axit để thử định tính bằng các thuốc thử sau:

(20-b) Thuốc thử Dragendorff Cho vài giọt thuốc thử trên vào dịch cần nghiên cứu thấy có kết tủa vàng cam

c) Thuốc thử Wagner Cho vài giọt thuốc thử trên vào dịch cần nghiên cứu thấy có kết tủa mầu nâu

d) Cho vài giọt axit picric trong cồn vào dịch, thấy cho kết tủa màu vàng

d) Hỗn hợp FeCl3 1% + K3Fe(CN)6 1% trong nước

Dịch chất thử được cô đặc, nhỏ lên giấy lọc để khô tự nhiên sau đó phun thuốc thử trên dưới dạng sương mù thấy xuất hiện màu xanh lục

+ Hàm lượng Alcaloid bằng phương pháp cân [12]

Cho vào dịch chiết nước 30 ml HCl 2N và đun sôi hồi lưu trong 1 giờ, lọc cặn bằng giấy lọc thu dịch chiết và kiềm hoá bằng dung dịch NH3 đặc đến pH 10-11, để lắng cặn và lọc qua giấy lọc, sấy khô cặn thu được ở 400C, cặn đã được sấy khô đem tán nhỏ và hoà tan vào 100 ml methanol, lọc cặn thu dịch chiết methanol và thu hồi methanol dưới áp suất thấp thu được Alcaloid tổng số

+ Xác định hàm lượng Flavonoid bằng phương pháp cân [12]

Dịch chiết nước được lắc với cloroform để loại hết tạp chất Thu phần dịch chiết tan trong nước và chiết với ethylacetat đến không màu, thu hồi ethylacetat

dưới áp suất thấp ta thu được Flavonoid tổng số

+ Xác định hàm lượng Lignan bằng phương pháp cân [44, 45]

Chiết kiệt methanol, lọc, thu hồi dung môi được cặn Chiết bằng dung môi methanol trong nước, tỉ lệ 0, 30, 50, 60 %, cuối cùng là 80 và 100% Trộn 2 dịch chiết cuối cùng này rồi đem thu hồi dung môi dưới áp suất thấp, sau đó sấy ở

400C đến khối lượng không đổi, đem xác định khối lượng

3.3.2.4 Phương pháp thực hiện chỉ tiêu Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot

*) Chiết xuất qui mô phòng thí nghiệm

và cô cạn dưới áp suất giảm còn khoảng 1/4 thể tích dịch chiết

Cụ thể:

Chiết lần 1: 100g nguyên liệu, + 700ml nước, sôi ở áp suất thường, 4h,

- Dịch chiết (nước) : 100g DHC được 150ml - 200ml dịch chiết

- Cao đặc: Cô cách thủy, áp suất thấp, được 20g – 25g cao đặc (hàm ẩm <20%)

*) ChiÕt xuÊt qui m« pilot

+ Các bước tiến hành

Phương pháp tương tự như chiết trong phòng thí nghiệm trên đây, nhưng qui mô lớn hơn: 50 – 100 kg dược liệu ban đầu Chiết trên dây chuyền pilot, thể tích nồi chiết hai vỏ 1,5m3, gia nhiệt là hơi nước bão hòa từ hệ nồi hơi nước, đảm bảo tránh nhiễm bẩn sản phẩm Cô tuần hoàn, áp suất thấp, cô hở

+ Sản phẩm:

- Dịch chiết (nước) : 100kg DHC được 100lit - 200lít dịch chiết

- Cao đặc: cô sấy thu được 20kg – 25kg cao đặc (hàm lượng nước < 20%)

3.3.2.5 Phương pháp xác định chỉ tiêu chất lượng cao đặc [22]

*) Phương pháp xác định tính chất hóa lý sinh

- Bằng cảm quan, nhận xét về màu sắc, mùi, vị

- Phương pháp cân, xác định hàm lượng nước

- Nuôi cấy phòng thí nghiệm xác định vi khuẩn, men, mốc

- Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử phân tích định lượng kim loại nặng

- Phương pháp cực phổ, sắc kí phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật

*) Phương pháp xác định thành phần hóa học

- Phương pháp sắc ký bản mỏng, phương pháp trọng lượng xác định hàm lượng một số chất chính, phương pháp LCMS, HPLC

*) Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp của cao

Nghiên cứu độc tính cấp của cao DHC sản xuất được dựa trên các kết quả

đã có: độc tính cấp DHC đắng đã được nghiên cứu trong tài liệu [9, 10] Phương pháp được mô tả chi tiết trong tài liệu [11, 23]

*) Phương pháp nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao

Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao DHC đắng sản xuất được dựa theo một số nghiên cứu trước [9, 10], theo phương pháp gây tổn thương gan thực nghiệm bằng CCl4, với lô đối chứng sinh lý và lô đối chứng bệnh lý không uống thuốc (cao DHC) Nếu cao có tác dụng bảo vệ gan sẽ hạn chế được tổn thương gan do CCl4

*) Phương pháp nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn

- Tiêu chuẩn dược liệu: chú ý đặc biệt đến phân loại, nhận biết

- Tiêu chuẩn cao đặc: chất lượng theo Dược điển Việt Nam III

- Nghiên cứu bao gói bảo quản theo tài liệu [1, 12]

3.3.2.6 Phương pháp xác định chỉ tiêu độ ổn định của cao [1, 22]

+ để ổn định về điều kiện thường 4 giờ;

+ điều kiện thường 12 giờ;

Cộng là 1 chu kỳ, có thể qui đổi tương đương 1 tháng lưu kho

3.3.3 Một số thiết bị hóa chất vật tư chính

c/ Dụng cụ thủy tinh các loại

d/ Trang bị khác: máy so màu, máy đo độ nhớt, đo pH, sắc ký lớp mỏng, máy khuấy, hiển vi quang học, cắt lát, …

e/ Một số thiết bị vật tư chuyên dụng (thuốc thử, động vật thí nghiệm, bộ kit phân tích, …) của các cơ sở cộng tác nghiên cứu:

+ Phòng thí nghiệm hóa hữu cơ, Đại học Sư Phạm Thái Nguyên

+ Phòng nghiên cứu vi sinh, Đại Học Y Thái Nguyên

+ Phòng thử nghiệm (độc tố, tác dụng bảo vệ gan) Viện Dược liệu, Hà Nội + Phòng vi sinh, Viện hóa học các hợp chất tự nhiên, VAST, Hà Nội

+ Trung tâm phân tích, Viện Hóa học, VAST, Hà Nội

+ Bảo quản nghèo oxy, Viện Kỹ thuật Nhiệt đới, VAST, Hà Nội

+ PTN hóa sinh, phân loại thực vật (Đại Học Sư phạm Hà Nội II, ĐH quốc gia Hà Nội, Viện Sinh Thái VAST Hà Nội)

f/ Dây chuyền chiết dược liệu - cô - sấy: Nồi hơi sản xuất hơi nước quá bão hòa gia nhiệt sạch, nồi chiết 1 – 3 m3, bể lắng lọc, nồi cô áp thấp, nồi cô hở, sấy, (CTCP Hóa Dược Việt Nam, cơ sở Đức Giang, Long Biên, Hà Nội) g/ Một số thiết bị phụ trợ sản xuất (máy phát điện, tủ lạnh, hệ chiết …) (CTCP Hóa Dược Việt Nam, cơ sở Đức Giang Long Biên và Ngã Tư Sở Hà Nội)

3.3.4 Xây dựng Quy trình sản xuất cao đặc qui mô pilot

4 Kết quả nghiên cứu

4.1 Nguồn dược liệu DHC

4.1.1 Chi DHC (Phyllanthus)

Ở Việt Nam chi DHC (Phyllanthus) có 45 loài thuộc 5 phân chi:

Kirganelia, Cicca, Phyllanthodendron, Phyllanthus và Eriococcus [7, 17, 47]

Cả hai loài DHC P a và P u đều thuộc phân chi Phyllanthus

Hoa nhỏ, cánh màu trắng, mọc ở dưới nách lá Có 5 lá đài, chỉ nhị dính nhau Hoa cái có đĩa mật nhiều thuỳ Quả hình cầu nhỏ có 3 khía, hơi dẹt, vỏ trơn, mọc rủ xuống ở dưới lá Khi quả già tự nứt vỏ, tung hạt ra

Là cây ưa sáng, ưa ẩm mọc trên các bãi đất bỏ hoang có nhiều mùn, ở nơi đất trống ven đường

Ảnh 4.1: Một phần loài

P a (Cát Bà Hải Phòng 2008)

Ảnh 4.2: Cành mang hoa quả loài

P a (Cát Bà Hải Phòng 2008)

Có thể sử dụng cây này để chữa bệnh viêm gan, vàng da, lậu, lở loét, sỏi mật, cảm cúm…

Ảnh 4.3: Quả loài P amarus Ảnh 4.4: Lát cắt dọc quả loài P amarus

4.1.3 Phyllanthus urinaria Linn

Hình ảnh minh họa từ hình 4.5 đến 4.8

Cây thảo sống hàng năm hoặc sống dai, cao 20-30cm Thân nhẵn, có màu hồng (ở Cát Bà có loài thân tía đỏ) Lá mọc so le, cuống lá rất ngắn, xếp hai dãy sít nhau như một lá kép lông chim, lá thuôn hình bầu dục ngược Lá kèm hình tam giác nhọn

Ảnh 4.5: Cành mang quả loài P u Ảnh 4.6: Loài P u quả đỏ (Cát Bà)

Hoa mọc ở kẽ lá, đơn tính cùng gốc Cụm hoa đực mọc ở nách lá phía đầu cành Hoa đực có 6 lá đài hình bầu dục ngược, đĩa mật có 6 tuyến, nhị 3, chỉ nhị rất ngắn, dính nhau ở gốc

Ảnh 4.7: Quả loài P urinaria Ảnh 4.8: Hạt loài P urinaria

Hoa cái mọc đơn ở dưới cành, 6 lá đài hình bầu dục mũi mác, đĩa mật hình vòng phân thuỳ, các vòi nhuỵ rất ngắn xẻ đôi thành hai nhánh uốn cong, bầu nhuỵ hình trứng Quả nang, không có cuống, hình cầu hơi dẹt, có gai Hạt hình 3 cạnh Mùa hoa quả từ tháng 4 đến tháng 8

Cây mọc hoang ở khắp nơi trong nước cũng như ở các nước trong vùng nhiệt đới, dùng làm thuốc chữa bệnh

4.1.4 Nguồn dược liệu DHC ở nước ta

Hai loài P a và P u phân bố rộng rãi ở nước ta [5, 6, 7, 17, 47], từ bờ biển phía Nam, đến vùng đất Tây Bắc

Về màu sắc, loài P u trong đất liền chưa thấy toàn thân màu tía Tuy nhiên vùng đảo Cát Bà có loài P.u toàn thân tía, quả tía đỏ, mặt sau lá màu tía sẫm đậm (hình 4.9), đầu lá bầu, chưa thấy loài đầu lá nhọn

Hình 4.9 Loài P u Cát Bà, thân quả màu tía đỏ, mặt sau lá sẫm

Loài P a có lá khác nhau: lọai đầu lá nhọn và loại đầu lá bầu (hình 4.10 đến 4.11) Loại P a đầu lá bầu cũng có hai loại: loại lá ngắn như vẩy hến (hình 2 mục 2), loại lá dài có hai cạnh song song

Hiện nay chưa nghiên cứu sâu được về đặc điểm, nhất là hoạt chất sinh học và tác dụng dược lý khác nhau, của các loại cây cùng loài

- Loài P.u thân quả tía đậm và loài thân tía nhạt quả xanh hay vàng,

- Loài P.a đầu lá bầu ngắn và dài, và loài đầu lá thon nhọn

Ở Ấn Độ có 3 loài P.a, được nghiên cứu hóa học và dược lý khá chi

tiết Việc phân loại 3 loài này hiện đang còn chưa thống nhất Nhưng về thành phần hoạt chất có khác nhau, tác dụng điều trị bệnh gan khá giống nhau

Hình 4.10 P.a Cát Bà, lá dài, đầu lá bầu

Hà Tây, Bắc Giang

Hình 4.11 P.a Cát Bà, lá dài, đầu lá thon nhọn

Hình 4.12 Mặt sau lá DHC Cát Bà, từ trái sang phải:

2 lá P.a đầu lá nhọn và bầu, P.u đầu lá bầu màu tía sẫm

Phần lớn dược liệu DHC hiện nay là thu mua từ dân, thu hái tự nhiên không theo thời vụ nhất định Chưa kể có thể nhầm lẫn trong phân biệt giữa

các loài DHC Sự nhầm lẫn này có thể xảy ra, không chỉ ở nước ta mà ngay cả

ở nước ngoài Trong khi đó việc phân loại một số cá thể chưa thống nhất Ví

dụ điển hình là loài P.a và loài Phyllanthus niruri vẫn chưa thống nhất về

4.2 Thu hái sơ chế và bảo quản dược liệu

4.2.1 Mùa thu hái [5, 47]

DHC P.a và P.u đều là loại thân cỏ sinh trưởng vào mùa xuân hạ, có thể ra hoa hai lần trong năm, vào tháng 4 - 6 và lần thứ hai vào tháng 8 - 9 Có hai mùa thu hái hè và cuối thu (có thể coi là vụ chiêm và vụ mùa ) Thời điểm thu hái theo kinh nghiệm là vào lúc trước khi hoa nở, hoặc chậm là trước khi quả chín

Hiện nay dược liệu được thu hái tự nhiên, vào các khoảng thời gian, lần thứ nhất vào tháng 4 đến tháng 6, lần thứ hai vào tháng 10 đến tháng 11,

4.2.2 Nguồn dược liệu

Nguồn thu mua được nhiều nhất là từ Hải Dương, Bắc Giang Năm 2008 là

40 tấn Một số địa phương đã bắt đầu gieo trồng Diệp hạ châu:

- Viện dược liệu Trung ương (diện tích khoảng 6 mẫu ta), - Trung tâm nghiên cứu cây thuốc Thanh Hóa, - Một số hộ gia đình và cá nhân ở Bắc Giang, - Một xã ở Thanh Hóa trồng trong vườn thuốc địa phương, - Thành phố Hồ Chí Minh

Tuy nhiên diện tích trồng DHC chưa nhiều, sản lượng thấp, chỉ đạt 3 – 6 tấn/ha/năm Các cơ sở trồng cây DHC chủ yếu để cung cấp nguyên liệu cho sử dụng tại chỗ, chưa có quy mô trồng công nghiệp thành thương phẩm

4.2.3 Quy trình thu hái, sơ chế

Thu hái: Có thể thu hoạch DHC theo hai cách:

- Nhổ cả gốc, rửa sạch đất cát

- Cắt tận gốc (bỏ phần rễ)

Sơ chế: Sau thu hoạch, nếu có cả gốc rễ cần rửa sạch bằng nước sạch sinh hoạt

trước khi phơi (như hiện nay), hoặc hong khô trong bóng râm thoáng gió (theo kinh nghiệm) Nếu sấy dược liệu DHC bằng nhiệt hay tia hồng ngoại, không được để nhiệt độ lên cao quá 40oC

Độ ẩm trong dược liệu phải <12% Sấy kiệt ở nhiệt độ thấp hơn 40oC làm cho hàm lượng nước trong dược liệu chỉ còn <10%, chất lượng bảo quản lâu dài

sẽ tốt hơn

Bảng 4.1 giới thiệu kết quả xác định hàm lượng nước trong cây DHC đắng Thái Nguyên Hàm lượng nước trong cây tươi thay đổi tùy theo mùa vụ, loài cây, thời điểm thu hái và mẫu thân, lá, ngọn hay cả gốc rễ

Bảng 4.1 Hàm lượng nước trong cây DHC đắng Thái Nguyên

Mẫu Khối lượng trước

4.2.4 Quy trình bảo quản dược liệu

4.2.4.1 Bảo quản truyền thống

Dược liệu với độ ẩm <12% có thể bảo quản thông thuờng được 3 tháng, độ

ẩm càng cao, thời hạn bảo quản càng bị thu ngắn

Sau khi hong khô, cây DHC được bó chặt và đóng trong bao sợi dứa hoặc sợi nhân tạo, 10 - 25 kg/bao, tùy theo kích thước của bao

Trong quá trình bảo quản lá tự rụng, càng ngày càng nhiều (bảng 4.2) Sau 2- 4 tháng bảo quản, lá rụng đến trên 80% Sự rụng lá tách khỏi cành thân do bảo quản và việc xuất hiện nấm mốc, bọ mạt, sâu hại là một dấu hiệu giảm chất lượng – cần sử dụng dược liệu nhanh nhất có thể

Bảng 4.2 Bảo quản truyền thống DHC khô, thời gian 100 ngày

STT t,

Ngày

Khối lượngtổng, kg

Khối lượng

lá rụng, kg

Khối lượng còn lại, kg

Nhận xét

1 1 1 0,05 0,95 Sắc tươi, thơm, không có mùn bụi

2 30 1 >0,05 >0,9 Thơm, tươi, không có mùn bụi

4 90 1 0,15 0,85 bụi, mùn, lá rụng, bọ mạt, sâu

5 100 1 >0,15 <0,85 Lá mủn vụn, có bọ mạt, sâu

Sau khi bảo quản truyền thống, hàm lượng chất tan tăng lên chút ít có thể

do phân hủy cây làm cho phần xơ màng tế bào cũng tan lẫn trong dịch chiết, tuy nhiên hàm lượng Lignan giảm khá rõ rệt (bảng 4.3)

Bảng 4.3 Hiện tượng tăng cân và giảm hàm lượng Lignan, sau 90 ngày bảo quản STT t,

Ngày

Khối lượng, kg

% chất tan chiết nước

1 1 10,00 19,05 0,86 Sắc tươi, thơm, không có mùn bụi

2 90 10,10 21,25 0,83 Xuất hiện bụi, mùn bọ mạt …