Nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược

372 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết quả xác định tên khoa học của 30 dược liệu nghiên cứu Phụ lục 2: Một số thuốc thử đã dùng để phát hiện các nhóm chất và cách pha Phụ lục 3: Quy trình thiết

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ DỮ LIỆU CHUẨN CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU THƯỜNG DÙNG

PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA GIÁM SÁT

CHẤT LƯỢNG DƯỢC LIỆU VÀ THUỐC ĐÔNG DƯỢC

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Văn Tựu

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

7374

25/5/2009

NĂM 2009

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ DỮ LIỆU CHUẨN CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU THƯỜNG DÙNG

PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA GIÁM SÁT

CHẤT LƯỢNG DƯỢC LIỆU VÀ THUỐC ĐÔNG DƯỢC

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Văn Tựu

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương

Cấp quản lý: Bộ Y tế

Thời gian thực hiện: Từ tháng 8/2006 đến tháng 1/2009

Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 400 triệu đồng Trong đó: Kinh phí SNKH 400 triệu đồng

NĂM 2009

1 Tên đề tài: Nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường

dùng phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược

2 Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Văn Tựu

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương

4 Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y tế

5.Thư ký đề tài: ThS Phạm Thị Giảng

6 Danh sách những người thực hiện chính:

− TS Nguyễn Văn Tựu: Chủ nhiệm đề tài

− PGS.TS Trịnh Văn Lẩu: Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương

− ThS Phạm Thị Giảng: Thư ký đề tài

− ThS Nguyễn Tuấn Anh: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

− DS Trịnh Thị Quy: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

− ThS Nguyễn Đức Toàn: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

− DS Nguyễn Thị Lan Phương: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

− Ds Nguyễn Việt Hà: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

− ThS Nguyễn Thị Phương Thảo: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

− CN Ngô Văn Trại: Khoa Tài nguyên, Viện Dược liệu

− DS Trần Thị Thu Trang: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

− DS Trần Thị Thu Hương: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

− DS Đỗ Thị Bích Thuận: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

7 Thời gian thực hiện: Từ tháng 8/2006 đến tháng 01/2009

ACN Acetonitril

BP British Pharmacopoeia (Dược điển Anh )

CP Pharmacopoeia of the Peoples’s Republic of China, English editon,

(Dược điển Trung Quốc, bản tiếng Anh)

DAD Diode array Detector (detector chuỗi Diod)

DĐVN III Dược điển Việt Nam, lần xuất bản thứ ba

ELSD Evaporative light - scattering detector (Detector tán xạ ánh sáng

hiệu năng cao)

IR Infrared Spectrophotometry (Phổ hấp thụ hồng ngoại)

JP The Japanese Pharmacopoeia, Fourteeth Edition (Dược điển Nhật )

MS Mass Spectra (Phổ khối)

RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

TR Retention time (Thời gian lưu)

UV – VIS Ultraviolet and Visible absorption Spectrophotometry (Phổ hấp thụ

tử ngoại khả kiến) USP The united States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ 30)

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

Trang

Phần A TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI …… 1

1 Kết quả nổi bật của đề tài……… 1

2 Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội……… 2

3 Đánh giá tình hình thực hiện đề tài so với đề cương đã được phê duyệt……… 3

4 Các ý kiến đề xuất……… 3

Phần B NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 4

1 ĐẶT VẤN ĐỀ……… 4

2 TỔNG QUAN……… 6

2.1 Tổng quan về tình hình nghiên cứu xây dựng dữ liệu chuẩn của các dược liệu ……… 6

2.2 Tổng quan về một số phương pháp liên quan……… 7

2.2.1 Phương pháp cảm quan ……… 7

2.2.2 Phương pháp sử dụng kính hiển vi ……… 8

2.2.2.1 Phương pháp cắt, nhuộm và soi vi phẫu 8

2.2.2.2 Phương pháp soi bột dược liệu 8

2.2.3 Một số phương pháp sắc ký ……… 8

2.2.3.1 Phương pháp TLC và phương pháp HPTLC 8

2.2.3.2 Phương pháp HPLC 10

2.2.3.3 Phương pháp GC 12

2.3 Tổng quan về một số nhóm hợp chất chính thường gặp trong dược liệu ……… 14

2.3.1 Terpenoid ……… 15

2.3.1.1 Monoterpen và sesquiterpen……… 15

2.3.1.2 Mono và diterpenoid glycosid ……… 16

2.3.1.3 Triterpenoid và steroid ……… 16

2.3.1.4 Saponin ……… 16

2.3.2 Alcaloid ……… 18

2.3.3 Hợp chất phenol……… 19

2.3.3.1 Flavonoid ……… 19

2.3.3.2 Coumarin ……… 20

2.3.3.3 Lignan ……… 20

2.3.3.4 Các acid phenolic ……… 20

2.3.3.5 Anthranoid ……… 21

2.4 Tổng quan về thành phần hóa học và một số phương pháp kiểm tra chất lượng của 30 dược liệu nghiên cứu ………… 21

2.5 Tổng quan về hesperidin, emodin và geniposid 30

2.5.1 Hesperidin 30

2.6 Tổng quan về phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế

một số hợp chất liên quan ………

32 2.6.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế flavonoid và hesperidin

32 2.6.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế anthranoid và emodin ………

33 2.6.3 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế iridoid glycosid và geniposid ………

33 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… 34

3.1 Thiết kế nghiên cứu ……… 34

3.2 Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiên cứu ……… 34

3.2.1 Chọn mẫu ……… 34

3.2.2 Cỡ mẫu ……… 34

3.2.3 Đối tượng nghiên cứu ……… 34

3.2.4 Các chất chuẩn đối chiếu hoặc chất đánh dấu 35

3.3 Phương pháp nghiên cứu ……… 36

3.3.1 Chỉ tiêu nghiên cứu ……… 36

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu ……… 36

3.4 Trang thiết bị, dung môi hóa chất ……… 47

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ……… 48

4.1 Thu thập, xác định tên khoa học mẫu dược liệu chuẩn …… 48

4.2 Theo dõi,bảo quản và lưu giữ các mẫu dược liệu nghiên cứu 48 4.3 Phân tích các đặc điểm vi học và thành phần hóa học của các dược liệu ……… 49

4.3.1 Bạch thược 50 4.3.2 Bạch truật 59

4.3.5 Chỉ thực 83

4.3.14 Diệp hạ châu đắng 184

4.3.18 Hương phụ 226

4.3.24 Nghệ 286 4.3.25 Ngưu tất 297 4.3.26 Quế 306 4.3.27 Riềng 317

4.4 Phương pháp chiết tách, tinh chế emodin, hesperidin và

geniposid từ các dược liệu nghiên cứu để làm chuẩn …….…

358 4.4.1 Chiết tách, tinh chế emodin từ thân rễ đại hoàng ……… 358

4.4.2 Chiết tách và tinh chế hesperidin từ trần bì ……… 361

4.4.3 Chiết tách và tinh chế geniposid từ quả dành dành ………… 365

5 KẾT LUẬN ……… 369

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……… 372

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Kết quả xác định tên khoa học của 30 dược liệu

nghiên cứu

Phụ lục 2: Một số thuốc thử đã dùng để phát hiện các nhóm chất

và cách pha

Phụ lục 3: Quy trình thiết lập dữ liệu chuẩn của dược liệu

Phụ lục 4: Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế hesperidin

từ trần bì

Phụ lục 5: Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế emodin từ

đại hoàng

Phụ lục 6: Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế geniposid

từ quả dành dành

Phụ lục 7: Các phổ nmr, ms, ir của hesperidin, emodin và

geniposid

Phụ lục 8: Danh mục các sản phẩm của đề tài

Phụ lục 9: Dự thảo tiêu chuẩn của hesperidin, emodin và

geniposid

PHẦN A - TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

1 KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

a Đóng góp mới của đề tài

− Đã thu thập và xác định đúng tên khoa học, đúng bộ phận dùng của 30 dược liệu nghiên cứu và một số loài khác để so sánh

− Xây dựng được bộ dữ liệu chuẩn của 30 dược liệu đã thu thập được khác với các dược liệu đã được nghiên cứu trước đây về cùng khía cạnh nghiên cứu, qua đó đưa ra quy trình thiết lập bộ dữ liệu chuẩn từ dược liệu nói chung

− Bộ dữ liệu bao gồm 30 mẫu dược liệu được định danh đúng và các đặc điểm

về hình thái bên ngoài, bột, vi phẫu và các đặc điểm hóa học đặc trưng thông qua các sắc ký đồ dấu vân tay Dữ liệu được lưu dưới dạng atlas nên có tính khách quan và khoa học

− Lần đầu tiên đề tài đã kết hợp nhiều phương pháp và kỹ thuật phân tích khác nhau từ các kỹ thuật thường quy như TLC đến các kỹ thuật hiện đại như HPTLC, HPLC với detector UV-VIS và detector DAD, ELSD, GC và GC-

MS, có so sánh với các chất đối chiếu tinh khiết

− Chiết xuất, phân lập được 3 chất đối chiếu: Hesperidin, geniposid và emodin

từ các dược liệu trần bì, dành dành và đại hoàng đạt yêu cầu về độ tinh khiết làm chuẩn

− Dùng các chất đối chiếu đã phân lập được để làm chuẩn so sánh trong phân tích định tính trần bì, dành dành và đại hoàng bằng phương pháp TLC, HPLC

− Quy trình thiết lập dữ liệu chuẩn đối với dược liệu

Các sản phẩm hiện đang được lưu giữ tại Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Dược liệu, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Danh mục các sản phẩm của đề tài ghi ở phụ lục 8

c Hiệu quả về đào tạo:

− Góp phần đào tạo 2 thạc sỹ dược học:

c Đỗ Thị Thanh Thủy Năm tốt nghiệp: 2008

+Tên đề tài: “Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn emodin từ đại hoàng

phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc”

d Nguyễn Việt Hà Năm tốt nghiệp: 2009

Tên đề tài: “Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn geniposid từ quả dành

dành phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc”

− Góp phần đào tạo 1 dược sỹ đại học:

+ Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Hương Thơm Năm tốt nghiệp: 2007

Tên đề tài: “Nghiên cứu xây dựng chất chuẩn Hesperidin và ứng dụng

trong kiểm nghiệm thuốc”

− Đào tạo một số cán bộ mới của Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Dược liệu thông qua các nội dung nghiên cứu của đề tài

− Tham gia đào tạo nhiều lượt cán bộ làm công tác kiểm nghiệm dược liệu và thuốc đông dược của các Trung tâm Kiểm nghiệm dược phẩm - mỹ phẩm và các công ty Dược

− Đã công bố được 2 bài báo trên tạp chí Kiểm nghiệm thuốc

d Hiệu quả về kinh tế

Kết quả nghiên cứu của đề tài được lưu lại dưới dạng hình ảnh có thể là tư liệu tham khảo thay thế trong trường hợp thiếu dược liệu chuẩn khi kiểm tra chất lượng dược liệu Các sản phẩm phân lập được từ dược liệu có thể dùng làm chuẩn phòng thí nghiệm, tiết kiệm hơn khi mua chuẩn

e Hiệu quả về mặt xã hội

Kết quả của đề tài có thể được ứng dụng vào công tác kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu, qua đó, góp phần quản lý tốt chất lượng dược liệu và chế phẩm đông dược, hạn chế tình trạng dược liệu giả mạo hiện nay

f Hiệu quả khác

Đề tài góp phần bổ sung nguồn dữ liệu vào kho dữ liệu chuẩn của dược liệu lưu hành tại Việt Nam, làm cơ sở cho việc xây dựng, soát xét các chuyên luận của Dược điển Việt Nam

2 ÁP DỤNG VÀO THỰC TIỄN SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG XÃ HỘI

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã và đang được áp dụng trong phân tích, kiểm tra chất lượng dược liệu và các thành phẩm đông dược tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và hệ thống kiểm tra giám sát chất lượng thuốc trong

cả nước góp phần nâng cao chất lượng đông dược và thuốc đông dược

3 ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI SO VỚI ĐỀ CƯƠNG

ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT

a Tiến độ

Đề tài đã được thực hiện đúng tiến độ: Từ 8/2006 đến tháng 01 / 2009

b Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu đề ra

− Xây dựng được bộ dữ liệu chuẩn của 30 dược liệu thường dùng ở Việt Nam hiện chưa có hoặc thiếu các dữ liệu tin cậy phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược

− Chiết xuất, phân lập và tinh chế được 3 chất đối chiếu đạt yêu cầu làm chất đối chiếu từ các dược liệu trên

− Đưa ra quy trình thiết lập bộ dữ liệu chuẩn từ dược liệu

c Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến trong bản đề cương

+ Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong đề cương +

Đề tài đã tạo ra đầy đủ các sản phẩm như đã nêu ở mục b theo đúng dự kiến trong bản đề cương Ngoài ra, còn xây dựng tiêu chuẩn dự thảo đối với

3 chất phân lập được

d Đánh giá viêc sử dụng kinh phí

Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 400 triệu đồng

Trong đó: Kinh phí sự nghiệp khoa học: 400 triệu đồng

Kinh phí từ nguồn khác: Không

Toàn bộ kinh phí đã được thanh quyết toán

4 CÁC Ý KIẾN ĐỀ XUẤT

− Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của đề tài và quy trình thiết lập dữ liệu chuẩn của dược liệu, có thể tiếp tục nghiên cứu áp dụng trên nhiều dược liệu khác

− Triển khai ứng dụng nghiên cứu chỉ thị ADN của dược liệu để bổ sung dữ liệu về đặc tính di truyền, giúp cho việc định danh và định tính dược liệu được chính xác hơn

− Từ các kết quả nghiên cứu của một số đề tài về chuẩn dược liệu và dấu vân tay sắc ký, hội đồng Dược điển nên tập hợp toàn bộ những dữ liệu chuẩn này

để tiến tới hoàn chỉnh bộ dữ liệu chuẩn của dược liệu lưu hành tại Việt Nam

và làm cơ sở xây dựng, sóat xét và thẩm định một số chuyên luận dược liệu

− Tiếp tục triển khai nghiên cứu thiết lập chất chuẩn từ dược liệu với quy mô lớn hơn để cung cấp nguồn chuẩn cho các cơ sở kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược

PHẦN B- NỘI DUNG CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, việc sử dụng thuốc từ dược liệu có xu hướng gia tăng trên phạm vi toàn cầu, không chỉ đối với phần đông dân số ở các nước đang phát triển mà còn cả ở những nước phát triển Ở Mỹ, số đơn thuốc có sử dụng hoạt chất từ dược thảo chiếm 25% tổng số đơn thuốc pha chế tại cửa hàng; hàng năm Trung Quốc sử dụng khoảng 700.000 tấn dược liệu và sản xuất khoảng 6.266 mặt hàng; giá trị buôn bán dược liệu ở Ấn Độ hàng năm đạt hơn

60 tỷ Rupi [12]

Ở nước ta, việc sản xuất, kinh doanh các mặt hàng thuốc có nguồn gốc từ dược liệu tăng lên không ngừng Theo thống kê của Cục quản lý dược Bộ Y tế, tính đến tháng 5 năm 2007, cả nước đã có hơn 3000 mặt hàng thuốc có nguồn gốc dược liệu đã được Bộ Y tế cấp số đăng ký, chiếm gần 1/3 tổng số thuốc sản xuất trong nước đã được cấp số đăng ký [24] Thị trường dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu cũng vì thế rất đa dạng và phong phú về nguồn gốc và chủng loại Do đó nhu cầu về dược liệu rất lớn, hàng năm nước ta tiêu thụ từ 30 - 50.000 tấn dược liệu các loại [25] Trong khi đó, chất lượng dược liệu đang là vấn đề bức xúc không chỉ đối với các cơ quan quản lý mà còn của toàn ngành Y

tế cũng như của cả cộng đồng Dược liệu dùng làm thuốc được cung cấp từ nguồn thu hái hoang dại, trồng trọt và nhập khẩu Nguồn dược liệu sản xuất trong nước hiện nay mới đáp ứng được 46% nhu cầu của thị trường [6], còn khoảng 60% phải nhập khẩu Nguồn nhập khẩu chủ yếu theo con đường tiểu ngạch, thiếu kiểm sóat Do nguồn gốc dược liệu phức tạp, không rõ ràng, số lượng lại lớn khó kiểm sóat dẫn đến tình trạng dược liệu giả mạo, nhầm lẫn, kém chất lượng vẫn được tự do lưu thông trên thị trường gây ảnh hưởng không tốt đến độ an toàn, hiệu lực và chất lượng của các chế phẩm từ dược liệu

Trước thực trạng trên, đã có nhiều đề tài, hội nghị, bài báo về vấn đề quản

lý chất lượng dược liệu nhưng tình hình chất lượng dược liệu chưa có chuyển biến đáng kể [20] Vì vậy, việc kiểm tra chất lượng dược liệu trong giai đoạn hiện nay cần phải được đẩy mạnh hơn bao giờ hết Trong mấy năm gần đây,Bộ

Y tế cũng đã quan tâm nhiều đến vấn đề này và đã cấp kinh phí cho dự án nâng cao năng lực phòng kiểm tra chất lượng đông dược, dược liệu Song đối với việc kiểm tra chất lượng thuốc nói chung và kiểm tra chất lượng dược liệu nói riêng, bên cạnh trang thiết bị hiện đại, cần phải có chất chuẩn đối chiếu

Mặt khác, đối với dược liệu,muốn áp dụng tiêu chuẩn DĐVN III để định tính, định lượng các hoạt chất hoặc chất đặc trưng, cần phải có chuẩn dược liệu hay chất đối chiếu hóa học là hoạt chất hay chất đặc trưng của dược liệu đó để

so sánh mà những chuẩn này thực tế còn thiếu chưa đáp ứng được Vì thế, việc kiểm tra chất lượng dược liệu ở nhiều nơi chủ yếu chỉ dừng lại ở mức độ cảm quan, dựa vào kinh nghiệm hay làm một số phản ứng hoa học thông thường nên kết quả đánh giá chất lượng còn hạn chế Hiện nay, đã có một số công trình nghiên cứu của Viện Dược liệu, Kiểm nghiệm thuốc trung ương, Trường Đại học dược [4,16,22] nhằm cung cấp những dữ liệu chuẩn về dược liệu khắc phục phần nào những khó khăn về chuẩn Song các công trình nghiên cứu này mới chỉ khảo sát trên một số dược liệu với một số khía cạnh nhất định như vi phẫu, bột, TLC hoặc HPLC và còn hàng trăm dược liệu khác chưa được khảo sát hoặc khảo sát chưa đầy đủ Ngoài ra, đã có không ít đề tài nghiên cứu chiết xuất

và phân lập được các chất đặc trưng từ dược liệu, một số ít trong đó có thể dùng làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc nhưng nhìn chung việc nghiên cứu chiết xuất, phân lập hoạt chất từ dược liệu nhằm đạt yêu cầu làm chuẩn vẫn còn

ít, chưa đáp ứng được nhu cầu về chất chuẩn trong kiểm nghiệm thuốc có nguồn gốc từ dược liệu

Để góp phần phát triển, bổ sung thêm nguồn dữ liệu chuẩn của các dược liệu thường dùng và chất đối chiếu từ dược liệu phục vụ việc kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược, trên cơ sở kết quả đạt được của đề tài cấp cơ sở đã được nghiệm thu 2003-2005, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường dùng phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược”

Mục tiêu của đề tài :

− Xây dựng bộ dữ liệu chuẩn của 30 dược liệu thường dùng ở Việt Nam mà chưa có hoặc thiếu các dữ liệu tin cậy về chất lượng phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược

− Chiết xuất, phân lập ít nhất 3 chất đối chiếu từ các dược liệu nghiên cứu đạt yêu cầu làm chất đối chiếu

− Đưa ra quy trình thiết lập bộ dữ liệu chuẩn từ dược liệu

Nội dung nghiên cứu:

− Thu thập, định danh 30 dược liệu nghiên cứu

− Phân tích các đặc điểm hình thái, vi học của 30 dược liệu nghiên cứu

− Phân tích các đặc điểm hóa học đặc trưng của 30 dược liệu trên bằng phương pháp TLC,HPLC và /hoặc GC-MS Từ các sắc ký đồ thu được lựa chọn các đặc điểm đặc trưng làm dấu vân tay sắc ký cho các dược liệu

− Tập hợp các dữ liệu phân tích thành file dữ liệu cho mỗi dược liệu nghiên cứu

− Lưu trữ và bảo quản cơ sở dữ liệu thu thập được vào đĩa CD

− Đóng gói, theo dõi, bảo quản các mẫu dược liệu nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm, đưa ra nhận xét về thời hạn bảo quản thích hợp ở điều kiện phòng thí nghiệm đối với dược liệu nghiên cứu

− Từ kết quả nghiên cứu đưa ra quy trình thiết lập dữ liệu chuẩn cho một dược liệu

− Chiết xuất, phân lập và tinh chế 3 chất hesperidin, emodin và geniposid từ trần bì, đại hoàng và dành dành để làm chất đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm đông dược dược liệu Xác định cấu trúc các chất phân lập được

Do đó, việc nghiên cứu xây dựng dữ liệu chuẩn của dược liệu đã và đang được chú ý nhiều không chỉ ở nước ta mà còn ở các nước trên thế giới

Trước kia, trong các chuyên luận dược liệu, để định tính dược liệu, dược điển các nước chỉ đưa ra yêu cầu về đặc điểm hình thái bên ngoài, vi phẫu, bột của dược liệu và một số phản ứng hóa học đặc trưng bằng phản ứng trong ống nghiệm hoặc bằng kỹ thuật TLC Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật,việc sử dụng kỹ thuật số để chụp lại ảnh của dược liệu hay đặc điểm vi phẫu, bột dược liệu dưới kính hiển vi làm dữ liệu chuẩn về mặt thực vật của dược liệu đã trở nên phổ biến Để ghi lại các đặc điểm đặc trưng của dược liệu, người ta sử dụng kỹ thuật điểm chỉ dấu vân tay (fingeprint) như dấu vân tay hóa học, dấu vân tay ADN bằng các phương pháp phân tích hiện đại như phương pháp sắc ký, điện di, quang phổ, nhiễu xạ tia X, phân tích gen [33,36,41,42,67,73,99] hoăc kết hợp nhiều phương pháp khác nhau.Trong những phương pháp trên, sắc ký như TLC, HPTLC, HPLC, GC hoặc sắc ký kết hợp phương pháp đo phổ như LC-MS, GC-MS, FTIR, HPLC-DAD là phương pháp hay được sử dụng nhất để định tính và kiểm tra chất lượng dược liệu [44,45,46,53,58,115] Các dấu vân tay sắc ký là các sắc ký đồ chỉ ra các đặc trưng hóa học đa thành phần của dược liệu Vì vậy, trong những năm gần đây, bên cạnh TLC,dược điển các nước như USP, BP, CP, JP đã có nhiều chuyên luận dược liệu và chế phẩm đông dược áp dụng phương pháp HPLC, GC hay HPTLC trong định tính, định lượng hoạt chất hay nhóm chất đặc trưng của dược liệu

Trên thế giới, đã có nhiều tác giả tiến hành thu thập mẫu dược liệu và nghiên cứu về các mặt thực vật học, hóa học và đưa ra các dữ liệu dưới dạng atlas

Ở Đức và Ấn Độ, việc nghiên cứu thiết lập dữ liệu chuẩn của dược liệu nhằm tiêu chuẩn hóa và kiểm tra chất lượng dược liệu và các thuốc từ dược liệu

đã sớm được quan tâm Tính đến năm 2002, cuốn sách “Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals” của Max Wichtl đã được xuất bản 4 lần bằng tiếng Đức, trong đó đưa ra các ảnh chụp về đặc điểm hình thái và sắc ký đồ TLC [102].Năm 1996, 2 tác giả người Đức là H.Wagner và S Bladl đã cho ra mắt lần thứ nhất Atlas TLC của 170 dược liệu và đến năm 2001 xuất bản lần 2 với 230 dược liệu [93]

Năm 2002, Pulok K Mukhejee, khoa Công nghệ Dược phẩm, trường Đại học Jadavpur, Kolkata, Ấn Độ đã nghiên cứu đưa ra các hình ảnh về đặc điểm hình thái và sắc ký đồ TLC của các chất đặc trưng của 25 vị dược liệu ở Ấn Độ [78] Trung Quốc là một nước đóng góp nhiều công trình khoa học nghiên cứu

về dược liệu, đặc biệt về lĩnh vực phân tích đặc điểm hóa học, đặc điểm di truyền, thiết lập dấu vân tay hóa học, dấu vân tay ADN coi đó là phương tiện hữu hiệu để so sánh, phân loại, định tính và đánh giá chất lượng dược liệu [33,71,105,106]

Năm 2005, Hồng Kông Trung Quốc đã xuất bản tập 1 bản tiêu chuẩn của

8 dược liệu trồng tại Hồng Kông, tiếp đó 7/2008 tập 2 ra đời với 24 chuyên luận dược liệu Các chuyên luận này bao gồm những hình ảnh về hình thái bên ngoài,

vi phẫu, sắc ký đồ của HPLC phân tích các chất đặc trưng đại diện cho các dược liệu trong tiêu chuẩn [38]

Ở nước ta, việc nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu cũng đã được Bộ Y

tế quan tâm, chỉ đạo nhiều, đặc biệt trong mấy năm gần đây, đã có không ít các

đề tài nghiên cứu về vấn đề này đã công bố hoặc đang trong giai đoạn thực hiện

Năm 2002, Nguyễn Viết Thân đã cho ra mắt tập 1 quyển “Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi”, trong đó có ảnh màu chụp cây thuốc, vị thuốc, vi phẫu, bột của 100 dược liệu [20] Năm 2005, Trịnh Văn Quỳ và cộng

sự đã công bố các dữ liệu chuẩn bao gồm ảnh chụp vị thuốc,vi phẫu, bột và sắc

ký đồ TLC của 25 dược liệu và sắc ký đồ HPLC, GC-MS của 11 dược liệu [16] Tiếp theo, Nguyễn Kim Bích và cộng sự đã phân tích dấu vân tay TLC của 20 dược liệu [4], Nguyễn Thị Bích Thu đã phân tích dấu vân tay HPLC của 10 dược liệu [22] Ngoài ra, người ta còn nghiên cứu xây dựng chỉ thị dấu vân tay ADN của một số dược liệu và coi đó là một đặc trưng của dược liệu cần kiểm tra khi định tính [17]

2.2 Tổng quan về một số phương pháp liên quan

Phương pháp kiểm tra chất lượng dược liệu nói chung đã được WHO và dược điển các nước quy định bao gồm các phương pháp kiểm tra đặc điểm hình thái bên ngoài, vi phẫu, bột, định tính, định lượng hoạt chất hoặc chất hay nhóm chất đặc trưng, thử tinh khiết [2,31,51,77,78,103]

Để kiểm tra tính xác thực của dược liệu, người ta kiểm tra về các đặc điểm hình thái bên ngoài, vi phẫu, bột và định tính bằng các phép thử hóa học, quang phổ, sắc ký, chỉ thị ADN Cho đến nay, phương pháp dùng chỉ thị ADN

đã được áp trong kiểm tra chất lượng dược liệu ở một số nước trên thế giới nhưng ở nước ta phương pháp này chưa được nghiên cứu nhiều

2.2.1 Phương pháp cảm quan

Là phương pháp dùng các giác quan để kiểm tra về hình dáng, màu sắc, đặc điểm vết bẻ ngang, mùi vị, dùng thước để xác định kích thước của dược liệu Đây là phương pháp đơn giản và nhanh nhất để định tính, đánh giá sơ bộ về mặt chất lượng dược liệu Tuy nhiên, khi mẫu dược liệu thay thế hoặc giả mạo có đặc điểm bên ngoài rất giống mẫu dược liệu thật thì cần thiết phải áp dụng các phương pháp khác [1]

2.2.2 Phương pháp sử dụng kính hiển vi

Là phương pháp sử dụng kính hiển vi để nhận biết các đặc điểm của các

mô, tế bào, hoặc các chất chứa trong tế bào, ở các lát cắt, bột, các mô đã được

làm rã ra hoặc các tiêu bản bề mặt của dược liệu Phương pháp thông dụng nhất

là phương pháp soi vi phẫu và soi bột

2.2.2.1 Phương pháp cắt, nhuộm và soi vi phẫu

Cắt dược liệu thành những lát mỏng theo chiều ngang hoặc dọc bằng lưỡi dao cạo, ống cắt vi phẫu cầm tay hay máy cắt vi phẫu, đem soi ngay lát cắt hoặc

xử lý lần lượt với cloramin T 5%, cloral hydrat, dung dịch acid acetic 1%, nước cất rồi nhuộm với dung dịch xanh methylen và dung dịch đỏ carmin, sau đó soi dưới kính hiển vi

2.2.2.2 Phương pháp soi bột dược liệu

Nghiền dược liệu thành bột mịn, cho một lượng nhỏ bột vào một giọt dung dịch soi như nước cất, glycerin, cloral hydrat trên lam kính, khuấy kỹ và cẩn thận bằng kim mũi mác, đậy lam kính, di nhẹ rồi quan sát dưới kính hiển vi

phân tích di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động với các tốc độ khác nhau nên được tách và phân bố khác nhau trên pha tĩnh Kết quả thu được sắc ký

đồ trên lớp mỏng, ở đó các thành phần của hỗn hợp cần tách phân bố rải rác dọc theo đường đi của dung môi động Tùy thuộc bản chất chất phân tích, ta có thể nhận biết các thành phần được tách ra trên bản mỏng bằng ánh sáng thường (nếu chất phân tích có màu), soi huỳnh quang ở các bước sóng 254 nm, 366 nm, phun thuốc thử hiện màu hoặc dùng thiết bị densitometer để đo cường độ ánh sáng phản xạ hoặc truyền qua trong vùng UV-VIS

Khi phân tích, cần so sánh sắc ký đồ của dung dịch thử với sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Để định tính, sắc ký đồ của dung dịch thử phải có những vết chính giống với những vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn về các đặc trưng sắc ký như màu sắc, giá trị Rf

Rf là hệ số di chuyển và là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích Giá trị Rf được tính bằng tỷ lệ dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:

b

a

Rf =Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm của vết (cm)

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết (cm)

Rf có giá trị từ 0 đến 1 và nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như chất làm pha tĩnh, độ dày và độ hoạt hóa của lớp mỏng, dung môi động, tạp chất, nhiệt độ phân tích, lượng mẫu phân tích Vì vậy, để so sánh thường phải triển khai song song với dung dịch chuẩn [2,55]

Hiện nay, mặc dù đã có nhiều kỹ thuật sắc ký hiện đại hơn nhưng TLC vẫn là một phương tiện có hiệu quả trong phân tích các thuốc thảo dược từ việc nghiên cứu sàng lọc ban đầu cho đến bán định lượng và định lượng vì đây là một kỹ thuật đơn giản và rẻ tiền nhất, có thể áp dụng được với hầu hết các hợp chất tự nhiên Do đó, TLC là kỹ thuật chủ yếu được WHO và dược điển các nước áp dụng trong kiểm tra chất lượng dược liệu và chế phẩm của chúng [2,77,103]

Tuy nhiên TLC có độ nhậy và độ phân giải chưa cao, hiện nay người ta đã cải tiến TLC thành HPTLC Sự khác nhau cơ bản giữa TLC thông thường và HPTLC là cỡ hạt và lỗ xốp của chất hấp phụ Với HPTLC, chất hấp phụ có cỡ hạt nhỏ (2 - 10µm) và bản mỏng có độ dày nhỏ hơn (khoảng 100 - 200 µm) trong khi TLC thông thường dùng chất hấp phụ có cỡ hạt và khoảng phân bố lớn hơn (5 - 25µm), độ dày của bản mỏng thường ≥ 250µm Nhờ cỡ hạt nhỏ, lớp chất hấp phụ mỏng kết hợp với việc sử dụng công nghệ tinh xảo và tự động nên HPTLC có khả năng phân giải, độ nhậy cao, lượng mẫu và dung môi ít, khoảng

di chuyển của dung môi ngắn (5 – 6 cm), thời gian phân tích nhanh Các chất hấp phụ thường được dùng trong các bản mỏng hiệu năng cao tráng sẵn hiện nay

là silicagel và C18 với độ dày 100 µm Để định tính, định lượng các thành phần phân tích được tách ra, người ta quét bản mỏng qua thiết bị scanner, một hệ

thống phát hiện quang phổ với phổ hấp thụ UV-VIS, kích thích huỳnh quang và phổ phát xạ của các thành phần được tách ra trên bản mỏng Nhờ đó, có thể phát hiện đồng thời nhiều thành phần ở nhiểu bước sóng khác nhau và lựa chọn được bước sóng mà ở đó cho tín hiệu pic cao nhất, giúp cho việc định tính, định lượng chất phân tích [55]

HPTLC thích hợp cho việc phân tích định tính, định lượng thành phần trong dược liệu và thuốc từ dược liệu, vì vậy, hiện nay, kỹ thuật này đã được đưa vào DĐTQ 2005 để định tính, định lượng nhiều hoạt chất, chất đặc trưng trong dược liệu và một số chế phẩm đông dược như định lượng berberin trong hoàng liên, acid hyodeoxycholic trong bột mật lợn, oxymatrine trong Quảng đậu căn [77]

2.2.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là phương pháp tách mà trong đó pha động là chất lỏng, pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc là chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Cơ chế của quá trình sắc ký lỏng là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ

Trong HPLC, mẫu phân tích được tiêm qua buồng tiêm và được đi vào cột nhờ pha động, các thành phần trong mẫu phân tích được tách ra trên pha tĩnh chứa trong cột rồi đi qua detector để phát hiện và cho các tín hiệu được ghi trên sắc đồ

Pha tĩnh hay dùng nhất trong HPLC là pha tĩnh mà trong đó các nhóm silanol trên bề mặt hạt silicagel (chất mang) đã được liên kết với các nhóm hóa học khác nhau tạo nên các hợp chất siloxan có độ phân cực khác nhau tùy theo nhóm liên kết: ⎢ ⎢

- Si-O-Si -R ⎢ ⎢ Khi R là các nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl và pha động phân cực, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC)

Khi R là nhóm khá phân cực như alkylamin hay alkylnitril pha động là dung môi ít phân cực, ta có sắc ký pha thuận (NP-HPLC) Hiện nay, kỹ thuật RP-HPLC được sử dụng rộng rãi vì tách tốt được nhiều hợp chất khác nhau Cột thông dụng là cột ODS (RP18), C8 với cỡ hạt 5 hay 10µm Để cải thiện khả năng tách, tiết kiệm dung môi và thời gian, gần đây người ta đã đưa sắc ký lỏng nhanh (UFLC) vào ứng dụng rộng rãi Trong UFLC, kích thước hạt chất mang nhỏ (thường từ 1,7 – 2,2 µm) và có thể sử dụng cột ngắn hơn (5-10cm)

Có nhiều loại detector khác nhau như detector tử ngoại – khả kiến VIS),tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), khúc xạ (RI), điện hóa trong đó detector chuỗi diode (DAD) cho phép thay đổi bước sóng theo chương trình đã đặt trong một quá trình sắc ký và đồng thời đo phổ của chất phân tích ở nhiều bước sóng cùng lúc, cho phép so sánh phổ để định tính

(UV-Để định tính một chất người ta so sánh thời gian lưu của pic chất đó trên sắc ký đồ của dung dịch thử với thời gian lưu của pic chất chuẩn trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Đồng thời ta cũng sử dụng thời gian lưu tương đối (RRT) của một pic để xác định pic đó, thời gian lưu tương đối của một pic được tính toán dựa trên thời gian lưu của pic được chọn để đánh dấu theo công thức sau:

Thời gian lưu của pic so sánh

RRT = - Thời gian lưu của pic đánh dấu Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết trên cột (N) Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức:

Để đặc trưng cho mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký người ta thường sử dụng độ phân giải R giữa 2 píc cạnh nhau Độ phân giải giữa 2 píc (píc số 1 và số 2) được tính theo công thức sau:

tR: Thời gian lưu

ωb: Độ rộng đáy píc

Khi: R = 0,75 hai píc không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều

R = 1,0 hai píc tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%

R = 1,5 hai píc tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3% [2,15,31,76,82]

Để xây dựng một dấu vân tay của dược liệu bằng phương pháp HPLC, ta chọn các điều kiện chiết mẫu, điều kiện sắc ký như cột, pha động, loại detector phát hiện thích hợp với các thành phần hóa học của dược liệu đó Tiến hành sắc

ký với nhiều lần mẫu thử và mẫu chuẩn đối chiếu để xem xét độ lặp lại, độ tinh khiết và ổn định của các pic được rửa giải ra trên sắc ký đồ Sau đó tiến hành chọn lựa các pic đặc trưng cho dược liệu, các pic này phải đảm bảo các yêu cầu sau:

− Pic phải xuất hiện ổn định

− Độ lặp lại tương đối (RSD) của thời gian lưu phải nhỏ hơn 1%

− Pic có độ tinh khiết cao (≥ 95,0%)

− Diện tích pic phải tương đối lớn (thông thường phải >1% tổng diện tích các pic chính)

− Độ phân giải với các pic cạnh không nhỏ hơn 1,0

Trong số các pic đặc trưng này ta chọn ra một pic là pic đánh dấu (thông thường là pic của chất đối chiếu), tính toán thời gian lưu tương đối (RRT) của các pic còn lại so với pic đánh dấu theo công thức đã nêu trên và đưa ra bảng dữ

2

5 , 0

2 2

54 , 5 16

δR t R b R

t t

t N

2 5 , 0 1 5 , 0 2 , 1 ,

1 2 1

2

ω ω ω

−

= +

−

b b

R

t R

liệu về các pic đặc trưng trong sắc ký đồ của dược liệu Bảng dữ liệu này cùng với sắc ký đồ chuẩn là dấu vân tay HPLC của dược liệu theo điều kiện sắc ký đã qui định

2.2.3.3 Phương pháp sắc ký khí (GC)

Với ưu điểm về độ nhạy, độ phân giải và độ lặp lại cao, ngày nay sắc ký khí được áp dụng rộng rãi trong phân tích nói chung và phân tích dược phẩm nói riêng Sắc ký khí là phương pháp chia tách trong đó pha động là 1 chất khí (được gọi là khí mang) và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên bề mặt chất mang trơ dạng rắn hay phủ đều lên thành phía trong của cột Tuỳ thuộc bản chất pha tĩnh chia thành hai loại sắc ký khí:

− Sắc ký khí rắn (gas solid chromatography - GSC): chất phân tích được hấp phụ trực tiếp trên pha tĩnh là các tiểu phân rắn

− Sắc ký khí lỏng (gas liquid chromatography - GLC): pha tĩnh là 1 chất lỏng không bay hơi

Tương tự sắc ký lỏng, các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký khí cũng bao gồm thời gian lưu, hệ số dung lượng, độ phân giải, số đĩa lý thuyết, chiều cao đĩa lý thuyết Cấu tạo máy sắc ký khí gồm hệ thống cung cấp khí, buồng tiêm mẫu, cột phân tích, detector, bộ phận phân tích xử lý dữ liệu

Khí mang dùng cho sắc ký phải là khí trơ, có độ tinh khiết cao và độ nhớt thấp Khí mang thường dùng là khí hydro, heli hoặc nitơ tùy thuộc vào detector

sử dụng, trong đó heli là khí mang thông dụng nhất và thích hợp với hầu hết các detector dùng cho sắc ký khí Trên cùng 1 cột tách khi dùng các khí mang khác nhau và ở các tốc độ dòng khác nhau, hiệu suất của quá trình sắc ký cũng thay đổi Hiệu suất tách lớn hơn và thời gian phân tích ngắn hơn là ưu điểm của hydro, khi tăng tốc độ dòng lớn hơn nhiều tốc độ dòng tối ưu nhưng hiệu suất (chiều cao đĩa lý thuyết) giảm rất ít Tuy nhiên dùng khí mang hydro khá nguy hiểm vì hydro có thể gây nổ khi tiếp xúc với oxy không khí, không dùng được cho detector khối phổ và là tác nhân phản ứng với các hợp chất không bão hòa trên bề mặt kim loại Khí mang nitơ cho hiệu suất tách tốt chỉ trong trường hợp nhiệt độ cột tách và tốc độ dòng thấp Độ tinh khiết là yếu tố rất quan trọng của khí mang đối với sắc ký khí, tạp chất có trong khí mang như các hydrocarbon, oxy, nước không chỉ làm tăng tín hiệu nhiễu đường nền mà còn tương tác với pha tĩnh làm hỏng cột, do đó khí mang cần phải qua các bộ lọc để loại bỏ oxy, nước và vết các chất hữu cơ trước khi vào cột tách

Buồng tiêm là bộ phận đưa mẫu vào cột của máy sắc ký Dựa trên nhiệt độ của buồng tiêm khi tiêm mẫu, gồm có buồng tiêm nóng (vaporizing inlet) và buồng tiêm lạnh (cool inlet) Tùy thuộc tỷ lệ mẫu vào cột so với lượng mẫu ban đầu, các buồng tiêm có thể phân loại dựa trên các kỹ thuật tiêm chia dòng (split), không chia dòng (splitless) và tiêm trên cột (on-column)

Tiêm chia dòng/không chia dòng (Split/Splitless) là kỹ thuật tiêm phổ biến nhất

và thích hợp nhất dùng cho cột mao quản nhằm làm giảm lượng mẫu đưa vào cột Ở chế độ tiêm chia dòng, mẫu sau khi vào buồng tiêm được chia ra và chỉ 1

phần nhỏ đi vào cột, phần còn lại qua van chia dòng thoát ra ngoài Ở chế độ tiêm không chia dòng, van chia dòng đóng lại trong 1 khoảng thời gian xác định sau khi tiêm, mẫu đi thẳng vào cột và chỉ thoát ra ngoài khi van chia dòng mở Buồng tiêm này thích hợp với các loại cột sắc ký khí mao quản, đặc biệt cần thiết với những cột có đường kính trong rất nhỏ Thông số quan trọng nhất cần chú ý của buồng tiêm chia dòng là tỷ lệ chia dòng, tỷ lệ này phụ thuộc vào nồng

độ của mẫu phân tích và tính chất cột tách Với mẫu phân tích có nồng độ lớn, hoặc/và cột tách có đường kính trong, độ dày lớp pha tĩnh nhỏ thì tỷ lệ chia dòng lớn; và ngược lại

Cột tách sắc ký khí là phần trung tâm, quan trọng nhất của 1 hệ thống sắc ký nói chung Cột sắc ký khí được chia làm 2 loại: cột nhồi thường có đường kính trong từ 2 - 4mm, cột mao quản có đường kính trong từ 0,1 - 0,53mm Ngày nay cột mao quản được sử dụng rộng rãi hơn vì hiệu suất tách của cột và sự đa dạng của pha tĩnh so với cột nhồi Có thể tưởng tượng cột mao quản như một ống hình trụ rỗng ở giữa (open tubular), thành trong cột có chứa pha tĩnh là các tiểu phân rắn (PLOT), hoặc pha tĩnh là 1 chất lỏng không bay hơi được phủ lên thành phía trong của cột (WCOT) hay phủ lên các hạt chất mang dạng rắn (SCOT) Pha tĩnh dùng cho cột sắc ký khí gồm có pha tĩnh rắn và pha tĩnh lỏng Các pha tĩnh lỏng gồm có các nhóm cơ bản như các hydrocarbon, các ether, ester; các muối hữu cơ dạng lỏng, poly(siloxane)… trong đó các polysiloxane được sử dụng rộng rãi nhất

Khi lựa chọn cột tách phải dựa trên các thông số cơ bản của cột gồm có pha tĩnh, chiều dài và đường kính trong của cột, độ dày của lớp pha tĩnh, nhiệt độ tối đa Hiệu suất tách (độ phân giải) lớn hơn với cột có đường kính trong và độ dày lớp pha tĩnh nhỏ hơn Tuy nhiên nhiệt độ tối đa của cột, dung lượng mẫu và thời gian phân tích cũng là các yếu tố cần phải chú ý khi lựa chọn cột Việc lựa chọn pha tĩnh của cột phân tích tùy thuộc vào mục đích quá trình phân tích và bản chất chất phân tích Có thể lựa chọn pha tĩnh dựa vào độ phân cực của các chất phân tích

Detector là bộ phận phát hiện các chất, đáp ứng của detector phụ thuộc vào cấu trúc và nồng độ chất phân tích, bản chất và tốc độ dòng khí mang Sắc ký khí có nhiều loại detector khác nhau, phổ biến nhất là detector ion hóa ngọn lửa (FID), detector cộng kết điện tử (ECD) và detector khối phổ (MSD)

Detector ion hóa ngọn lửa (Flame Ionization Detector - FID) được sử dụng rộng rãi nhất do đáp ứng với nhiều hợp chất hữu cơ Nguyên tắc làm việc của FID dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của dòng ion dưới tác dụng của ngọn lửa hydro được đặt trong điện trường khi có chất phân tích đi qua FID đáp ứng với hầu hết các hợp chất hữu cơ, đáp ứng này tỷ lệ thuận với số nguyên tử carbon có trong chất phân tích FID không hoặc rất ít đáp ứng các khí He, H2, N2, O2, CO, CO2,

H2O, H2S, NO, NO2, SO2, HCOOH

Detector cộng kết điện tử (Electron Capture Detector - ECD) hoạt động dựa trên đặc tính của các chất có khả năng cộng kết điện tử tự do trong pha khí Bộ phận chính của ECD là buồng ion, tại đây diễn ra các quá trình ion hóa, bắt giữ điện

tử và tái liên hợp Độ nhạy của ECD phụ thuộc chủ yếu vào khả năng cộng kết điện tử của các chất phân tích Các hợp chất có khả năng bắt giữ điện tử lớn như các hợp chất dị nguyên, hợp chất có chứa nhóm chức hay các đa liên kết, đặc biệt là các chất có các nguyên tử halogen cho đáp ứng tốt với ECD Là detector

có độ nhạy rất cao, vì vậy rất phù hợp với yêu cầu phân tích lượng vết các hợp chất có chứa halogen, các thuốc trừ sâu, diệt cỏ

Hiện nay Detector khối phổ (Mass Selective Detector) cũng được sử dụng rộng rãi do không những có độ nhạy cao và đáp ứng với hầu hết hợp chất hữu cơ mà còn đưa ra phổ khối lượng đặc trưng của từng chất phân tích, cho phép xác định các chất dựa vào phổ khối lượng Phổ khối của 1 chất biểu diễn mối tương quan giữa đáp ứng của các ion được tạo thành và tỷ lệ khối lượng / điện tích (mass to

charge, m/z) của nó Detector khối phổ gồm có 3 phần chính: buồng ion hóa,

phân tích khối và bộ phận phát hiện

Có nhiều phương pháp ion hóa khác nhau trong đó được dùng phổ biến nhất là ion hóa do va chạm điện tử (Electron Impact - EI) và ion hóa hóa học (Chemical Ionization - CI) Cả 2 phương pháp được áp dụng chủ yếu để phân tích các chất không phân cực và 1 số ít chất phân cực với khối lượng phân tử nhỏ hơn 1200 Da Các ion đặc trưng tạo thành khi ion hóa do va chạm điện tử là

M+• và các ion do “bẻ gãy” cấu trúc, với ion hóa hóa học các ion đặc trưng tạo thành là MH+, (M−H)+, (M+RH)+, M−, (M−H)− Các ion có m/z khác nhau sau

khi ra khỏi buồng ion hóa được tách ra (về thời gian và khoảng cách) ở bộ phận phân tích khối dưới tác dụng của lực điện trường và lực từ trường [2,31,70]

2.3 Tổng quan về một số nhóm hợp chất chính thường gặp trong dược liệu

Thành phần hóa học trong cây thuốc được phân loại thành các nhóm chất khác nhau, trên cơ sở đó có phương pháp phân tích phù hợp với từng nhóm chất

Có nhiều cách phân loại tùy theo nguồn gốc sinh tổng hợp, theo khả năng hòa tan hoặc theo sự có mặt của nhóm chức quyết định tính chất của nhóm chất Theo một số tài liệu [1,9,25], người ta phân các nhóm chất trong dược liệu thành các nhóm chính như tinh dầu, alcaloid, glycosid tim, saponin, momo và diterpenoid glycosid, anthranoid, flavonoid,coumarin, tanin, carbohydrat, acid hữu cơ Trong đó, một số nhóm chất như anthranoid, saponin, flavonoid, coumarin, tanin, glycosid tim, momo và diterpenoid glycosid còn được xếp vào nhóm glycosid do cấu trúc của các chất thuộc nhóm này gồm phần đường liên kết với phần không đường

Các tác giả Wagner H., Bladl S [93] lại phân loại các nhóm chất theo phương pháp phát hiện chúng bằng TLC, gồm các nhóm chính như alcaloid, anthaglycosid, chất đắng, glycosid tim, coumarin, tinh dầu, flavonoid, arbutin, lignan

Việc phân nhóm theo cách này hay cách khác cũng chỉ mang tính chất tương đối, do tính đa dạng của các hợp chất thiên nhiên, một chất thuộc nhóm này có khi lại cũng được xếp vào nhóm khác Ví dụ chất wedelolacton có trong sài đất và cỏ nhọ nồi có thể được xếp vào nhóm isoflavonoid hay nhóm coumarin; một số chất vừa có cấu trúc khung steroid vừa chứa nitơ dị vòng nên

có thể được xếp vào nhóm saponin steroid hay alcaloid [2,4]

Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi chỉ đề cập đến một số nhóm chất chính có liên quan như terpenoid (tinh dầu, mono và diterpenoid glycosid) alcaloid, hợp chất phenol (flavonoid, coumarin, lignan, anthranoid), saponin Mỗi nhóm chất chỉ giới thiệu một cách tổng quát về khái niệm, sự phân loại của từng nhóm chất cũng như tính đa dạng và phức tạp của chúng là cơ sở tạo nên các đặc trưng riêng của từng thành phần chất trong tự nhiên

Những tính chất có liên quan đến việc chiết, tách và phát hiện các nhóm chất sẽ được trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Terpenoid [1,4,9,25]

Terpen là hydrocarbon mà phân tử của nó được cấu tạo bởi nhiều đơn vị

isopren C5H8 Terpenoid là terpen bị biến đổi về mặt hóa học, trong đó, nhóm methyl bị thay đổi vị trí hoặc mất đi, hay có thêm nguyên tử oxy.Một số tác giả dùng thuật ngữ "terpen" với nghĩa rộng hơn, bao gồm cả terpenoid Giống như terpen, dựa vào số đơn vị isopren, terpenoid được chia thành monoterpenoid (gồm 2 đơn vị isopren, C10), sesquiterpenoid (gồm 3 đơn vị isopren, C15), diterpenoid (có 4 đơn vị isopren, C20), sesterterpenoid (có 5 đơn vị isopren, C25), triterpenoid (có 6 đơn vị isopren, C30), tetraterpenoid hay carotenoid (có

8 đơn vị isopren, C40) và polyterpenoid gồm một số lớn đơn vị isopren

Các terpenoid còn được xếp thành nhóm theo tính chất bay hơi, ví dụ tinh dầu là những mono và sesquiterpen dễ bay hơi, sau đó đến nhóm diterpen ít bay hơi và nhóm không bay hơi Ở đây chỉ đề cập đến một số terpenoid hay gặp trong cây thuốc

2.3.1.1 Momoterpen và sesquiterpen (Tinh dầu)

Tinh dầu là hỗn hợp nhiều thành phần, thường có mùi thơm, không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, dễ bay hơi ở nhiệt độ thường và có thể điều chế được từ thảo mộc bằng phương pháp cất kéo hơi nước Ngoài các thành phần monoterpen, sesquiterpen, tinh dầu còn có các thành phần bay hơi khác như các dẫn chất nhân thơm và các dẫn chất có nitơ và lưu huỳnh

Các dẫn chất monoterpen như menthol có trong tinh dầu bạc hà, cineol và α-terpineol có trong tinh dầu tràm, geraniol, citronelal trong tinh dầu sả Một

số đại diện của dẫn chất sesquiterpen là Zingiberen, ar-curcumenen, farnesen trong tinh dầu gừng

β-Dẫn chất nhân thơm của tinh dầu như aldehyd cinamic trong tinh dầu quế, eugenol trong tinh dầu hương nhu và tinh dầu đinh hương, anethol trong tinh dầu hồi

2.3.1.2 Mono và diterpenoid glycosid

Monoterpenoid glycosid gồm những glycosid mà bộ khung của phần aglycon được cấu tạo từ 2 đơn vị isopren Trong cây, các monoterpenoid glycosid được gặp nhiều nhất là nhóm Iridoid, cho đến nay, người ta đã biết đến trên 600 chất Khung cơ bản gồm một vòng cyclopentan nối với một vòng hydropyran Iridoid gồm các nhóm:

- Iridoid có aglycon đủ 10 carbon: Geniposid, gardenosid, gardosid trong

quả dành dành (Gardenia jasminoides Ellis.), loganin trong lá kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)

- Iridoid không đủ 10 carbon: Rehmaniosid, catalpol trong sinh địa

(Rehmania glutinosa (Gaertn.) Libosch

- Iridoid trên 10 carbon: Plumericrin trong vỏ cây đại (Plumeria rubra L var acutifolia (Poir) Bailay)

Diterpenoid glycosid gồm những glycosid mà bộ khung của phần aglycon được cấu tạo bởi 4 đơn vị isopren Một số hợp chất thuộc loại này như steviosid

và những glycosid khác trong cỏ ngọt (Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley., darutosid trong hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.)…

Ngoài dạng glycosid, diterpen còn có thể tồn tại dạng tự do như tanshinon

I,IIA,IIB, miltiron, salviol và các diterpen khác có trong đan sâm (Salvia

miltiorrhiza Bunge.)

2.3.1.3 Triterpenoid và steroid

Triterpenoid được chia thành 4 nhóm chính: triterpen (true triterpen), steroid, saponin và glycosid tim Các triterpen thường có vị đắng nên còn được xếp vào nhóm chất đắng, chúng tồn tại trong cây dưới dạng tự do (ví dụ acid isoferulic, cimigenol và một số triterpen khác có trong thân rễ thăng ma

(Cimicifuga foetida L.) hoặc glycosid (ví dụ chandravadana, momordicosid K và

L có trong cây mướp đắng (Momordica charantia L.)

Các hợp chất sterol và triterpen đều bắt nguồn từ một nguồn gốc sinh nguyên là squalen Từ squalen trong cây cỏ, hình thành nhiều hợp chất sterol khác Trước đây, sterol chủ yếu được xem như là những hormon của động vật nhưng gần đây, số lượng các chất này được tìm thấy trong thực vật ngày càng nhiều Một số chất điển hình như phytosterol, β-sitosterol, stigmasterol Cả 2 kiểu glycosid tim đều do β-sitosterol tạo ra

2.3.1.4 Saponin

Saponin là nhóm glycosid gọi là saponosid Phân tử saponin gồm có phần aglycon thường gọi là sapogenin và phần đường Tùy theo cấu trúc hóa học của phần sapogenin mà saponin được chia thành 2 nhóm chính: saponin triterpen và saponin steroid Phần lớn saponin có trong cây thuộc loại saponin triterpen Phần đường có thể được nối qua nhóm OH ở vị trí C3 của phần aglycon

(monodesmosidic saponins), một số ít trường hợp phần đường gắn qua 2 nhóm

OH hoặc qua một nhóm OH và một nhóm carboxyl của aglycon (bisdesmosidic saponins)

a Saponin triterpen

Sapogenin của saponin triterpen là các triterpenoid, có 30 carbon, rất khác nhau về cấu trúc hóa học, phân loại chủ yếu dựa vào số lượng vòng hydrocarbon nên được chia làm 2 nhóm lớn là saponin triterpenoid pentacyclic (có 5 vòng) và saponin triterpenoid tetracyclic (có 4 vòng) Nhóm pentacyclic lại được chia thành 4 nhóm nhỏ gồm olean, ursan, lupan và hopan, trong đó, nhóm olean chiếm phần lớn trong số các saponin triterpennoid trong tự nhiên Phần aglycon của nhóm olean phổ biến là dẫn chất của 3-β hydroxy olean 12–ene, gọi là β-amirin, ví dụ acid oleanolic, hederagenin Nhóm saponin triterpenoid tetracyclic được chia thành 5 nhóm gồm damaran, cycloartan, lanostan, cucubitan và β-onoserin Đại diện nhóm damaran là các saponin của nhân sâm

(Panax Ginseng C.A Mey) như các ginsenosid Các dẫn chất cycloartan phân lập được từ một số loài thuộc họ Moraceae và các loài Astragalus họ Fabaceae

và nhiều họ khác, chúng có tác dụng hạ cholesterol, hạ huyết áp, cường tim và lợi tiểu Nhóm β-onoserin là các dẫn chất trung gian đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp các steroid và triterpenoid

b Saponin steroid

Sapogenin của nhóm này có cấu trúc khung steroid đặc trưng (gồm 4 vòng A, B, C, D), có 27 carbon Ngoài khung steroid còn có 2 dị vòng E và F Saponin steroid được chia thành 5 nhóm:

− Nhóm spirostan: Saponin nhóm này thường tồn tại ở 2 dạng đồng phân C25R(iso) và C25S (neo) Các sapogenin thuộc nhóm này là diosgenin có chủ yếu trong các loài Dioscorea và hecogenin có chủ yếu trong các loài Agave

− Nhóm furostan: Có cấu trúc tương tự nhóm spirostan chỉ khác là vòng F mở,

có 2 mạch đường (bidesmosid) ví dụ chất sarsaparillosid và avenacosid A

− Nhóm aminofurostan: Vòng F mở như nhóm furostan nhưng có nhóm -NH2

ở vị trí C-3, chất điển hình là jurubin có trong Solanum paniculatum

− Nhóm Spirosolan: Saponin thuộc nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy ở vòng F được thay thế bằng nhóm NH và có dạng isomer ở C-22 Ví dụ solasonin có trong cây cà lá xẻ Solanum laciniatum

− Nhóm solanidan: Điển hình là solanin phân lập được từ mầm khoai tây, hai vòng E và F có chung một nguyên tử carbon và nitơ

Các saponin thuộc nhóm aminofurostan, spirosolan và solanidan đều chứa nitơ, mang tính alcaloid, dưới dạng glucosid nên được gọi là glucoalcaloid

2.3.2 Alcaloid [1,25,93]

Alcaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng,

có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật, thường

có hoạt tính sinh học mạnh và cho phản ừng hóa học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alcaloid

Alcaloid có phổ biến trong thực vật, hiện nay đã biết khoảng trên 6 000 alcaloid từ hơn 5000 loài, hầu hết ở thực vật bậc cao, chiếm khoảng 15 – 20% tổng số các loài cây, tập trung ở các họ: như Trúc đào (Apocynaceae), Thuốc phiện (Papaveraceae), họ Đậu (Fabaceae) Rất ít trường hợp cây chỉ có một alcaloid duy nhất mà thường là hỗn hợp nhiều alcaloid, trong đó alcaloid có hàm lượng cao gọi là alcaloid chính, còn những alcaloid khác có hàm lượng thấp hơn gọi là alcaloid phụ Hàm lượng alcaloid phụ thuốc vào nhiều yếu tố như khí hậu, ánh sáng, chất đất, phân bón, giống cây, bộ phận thu hái, thời kỳ thu hái Trong cây, alcaloid ít khi ở trạng thái tự do (alcaloid base) mà thường ở dạng muối của các acid hữu cơ như citrat, tartrat, oxalat, malat, acetat (đôi khi ở dạng muối của acid vô cơ) tan trong dịch tế bào Ở một số cây alcaloid kết hợp với tanin hoặc acid đặc biệt khác Có một số ít trường hợp alcaloid kết hợp với đường tạo

ra dạng glycoalcaloid như solasonin, solamacgin trong cây cà lá xẻ (Solanum

− Dẫn xuất nhân pyrrol hoặc pyrrolidin

− Dẫn xuất nhân pyridin hoặc piperidin: ví dụ nicotin trong thuốc lá, arecolin trong hạt cau

− Dẫn xuất nhân tropan (= Piperidin+ N- methyl pyrrolidin): Scopolamin trong

cà độc dược

− Dẫn xuất nhân quinolin: Quinin, quinidin, cinchonin trong vỏ canhkina

− Dẫn xuất nhân isoquinolin: berberin trong hoàng liên, papaverin trong thuốc phiện

− Dẫn xuất nhân quinolizidin: spactein trong Sarothamnus scoparius

− Dẫn xuất nhân indol: Alcaloid của mã tiền, cựa khỏa mạch

− Dẫn xuất nhân imidazol: Pilocarpin trong Pilocarpus jaborandi

− Dẫn xuất nhân purin: Cafein, theophylin, theobromin trong chè, cà phê

− Dẫn xuất nhân quinazolin: α và β-dichroin trong thường sơn

− Dẫn xuất nhân acridin: Rutacridon trong Ruta graveolens

− Dẫn xuất nhân pyrrolizidin: Indicin trong cây Heliotropium indicum L

Trong các nhóm alcaloid có nhân dị vòng, 2 nhóm isoquinolin và indol có nhiều alcaloid được sử dụng trong điều trị bệnh và chúng được phân thành nhiều phân nhóm khác nhau

Dẫn xuất isoquinolin được phân thành 9 phân nhóm cấu trúc: Cấu trúc tetrahydroisoquinolin, benzylisoquinolin, ptalidisoquinolin, protoberrberin, protopin, aporphin, morphinan, benzophenanthridin và emetin

Nhóm indol gồm 6 phân nhóm cấu trúc: cấu trúc indolalkylamin, physostigmin, β-carbolin, ergolin, strychnin và các alcaloid nhân indol có cấu trúc phức tạp

c/ Alcaloid có cấu trúc khác: Alcaloid có cấu trúc steroid thường tập trung

ở họ Cà (Solanaceae) như solasodin, solanidin trong một số loài Solanum, họ Hành (Liliaceae), họ Trúc đào (Apocynaceae) Một số alcaloid có cấu trúc terpen, ví dụ aconitin trong ô đầu có cấu trúc diterpen

2.3.3 Hợp chất phenol [1,4,25,93]

Gần đây, hợp chất phenol được quan tâm đặc biệt vì chúng có khả năng

ức chế chất sinh ung thư và chất gây đột biến, ngoài ra, hợp chất polyphenol còn

có tác dụng chống oxy hóa, giảm đau

Hợp chất phenol bao gồm các hợp chất có ít nhất một vòng thơm và một hay nhiều nhóm thế hydroxyl tự do hoặc kết hợp với nhiều nhóm chức khác như ether, ester, glycosid Các hợp chất phenol tan trong nước vì phần lớn ở dạng glycosid Ở đây chỉ đề cập đến một số hợp chất hay gặp

2.3.3.1 Flavonoid

Là nhóm hợp chất phenol lớn nhất thường gặp ở thực vật, cho đến nay đã

có khoảng 4000 chất đã được xác định cấu trúc Khung cơ bản của flavonoid gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon

Dựa vào vị trí gốc aryl (vòng B) và mức độ oxy hóa của mạch 3C để phân loại flavonoid thành Euflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3, neoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4 Người ta còn phân biệt biflavonoid là những flavonoid dimer, triflavonoid cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignan

- Euflavonoid gồm các nhóm anthocyanidin, flavan, flavan 3-ol, flavan

4-ol, flavan 3,4-di4-ol, flavanon, 3-hydroxy flavanon, flavon, flavon4-ol, dihydrochalcon, chalcon, auron

+ Anthocyanidin là sắc tố phổ biến trong thực vật, có màu sắc thay đổi theo pH môi trường

+ Flavan 3-ol: Có nhiều dẫn chất khác nhau tùy theo nhóm thế ở 2 vòng A,B Ví dụ catechin và dẫn chất có trong lá trà Các dẫn chất flavan 3–ol có thể

ở dạng ester, glycosid hay ở dạng dimer, trimer, tetramer, pentamer, gọi là

proanthocyanidin (tanin ngưng tụ), ví dụ các chất theasinensnin A, B, C, D, F, G

có trong một loại trà Camellia sinensis CV viridis

− Flavon: Các dẫn chất flavon rất phổ biến trong thực vật, kết tinh không màu đến vàng nhạt

− Flavanon: Hesperidin, naringin là những flavanon hay gặp trong một số cây

Coumarin là những dẫn chất benzo-α-pyron, có cấu trúc C6 – C3 Chúng

có thể được phân loại thành các nhóm sau:

a Coumarin đơn giản hay còn gọi là coumarin không ngưng tụ (non-condensed coumarins): thường có các nhóm OH hoặc OCH3 được thế ở vị trí C-6 và C-

7, có khi được thế ở vị trí C-5 và C-8, ví dụ umbelliferon ở radix Angelicae,

radix Heraclei scopoletin trong radix Scopoliae

b Furanocoumarin: Các chất thuộc nhóm này có thêm một vòng furan được gắn ở vị trí C-6 và C-7 ( kiểu psoralen) hoặc C-7 và C-8 (kiểu angelicin), ví

dụ angelicin ở radix Angelicae, psoralen ở herba Rutae

c Pyranocoumarin: Các chất thuộc loại này có thêm vòng pyran được gắn ở vị trí C-6 và C-7 (xanthiletin), ví dụ xanthiletin hoặc C-7 và C-8 (seselin), ví dụ

visnadin, samidin ở fructus Ammi majoris

Ngoài ra, còn một số nhóm khác như Dimeric coumarin, C- phenylcoumarin

2.3.3.3 Lignan

Lignan là các hợp chất được tạo thành do sự oxy hóa của một cặp gồm 2 đơn vị p-hydroxyphenylpropen, thường được nối với nhau bởi một cầu oxy Chúng thường đươc tìm thấy trong quả, tâm gỗ và rễ của cây Có hàng trăm loại lignan, phân bố rộng rãi trong khoảng 70 họ thực vật Chúng khác nhau ở bậc oxy hóa, tạo vòng hoặc dẫn xuất Một số lignan hay được nhắc đến như

phyllanthin, hypophyllanthin trong diệp hạ châu đắng (Phyllathus amarus

Schum et Thonn.), silymarin như silybin, silychristin, silidianin có trong quả

cúc gai (Silybum marianum Gaertn.) có tác dụng bảo vệ gan

2.3.3.4 Các acid phenolic

Các acid phenolic: bao gồm 2 nhóm: dẫn xuất của acid benzoic và dẫn xuất của acid cinnamic

a Dẫn xuất của acid benzoic: Là dẫn xuất hydroxyl của acid benzoic, tồn tại chủ yếu ở dạng tự do, đôi khi ở dạng ester hay glycosid Một số chất đại diện như acid salicylic (dạng ester), acid gallic, procatechic (dạng tự do và dạng ester)

b Dẫn xuất của acid cinnamic: Hầu hết các acid như p-coumaric, acid caffeic, acid ferulic rất phổ biến trong cây; một số acid khác như o- coumaric, o-ferulic ít gặp hơn

2.3.3.5 Anthranoid

Những hợp chất anthranoid nằm trong nhóm lớn hydroxyquinon, sắc tố tìm thấy chủ yếu trong trong ngành nấm, địa y, thực vật bậc cao Căn cứ vào số vòng thơm đính vào nhân quinon mà người ta xếp thành benzoquinon, naphtoquinon, anthraquinon và naphtacenquinon Ở đây chỉ đề cập đến nhóm anthraquinon hay anthranoid

Anthranoid được phân thành 2 nhóm: nhóm phẩm nhuộm và nhóm nhuận tẩy, trong đó nhóm nhuận tẩy được quan tâm nhiều Những dẫn chất thuộc nhóm nhuận tẩy thường có 2 nhóm OH đính ở vị trí 1, 8 và ở vị trí 3 thường là nhóm -CH3, -CH2OH, CHO hoặc -COOH nên còn được gọi là oxymethyl- anthraquinon Người ta hay gặp các dẫn chất có cùng cấu trúc , chí khác nhau ở mức độ oxy hóa ở C3 Ví dụ trong đại hoàng, chút chít, thảo quyết minh đều có mặt cả 3 chất chrysophanol, aloe emodin, rhein Những dẫn chất anthranoid khi

ở trong cây có thể tồn tại dưới dạng oxy hóa (anthraquinon) hoặc dạng khử (anthron, anthranol) Trong cây, anthranoid tồn tại ở dạng aglycon và dạng glycosid, mạch đường thường nối vào vị trí 1, 8 hoặc 6, ví dụ frangulin A có

trong vỏ cây Rhamnus frangula L Dây nối glycosid chủ yếu loại O-glycosid,

đôi khi có loại C-glycosid như barbaloin với liên kết C-C ở vị trí 10, hoặc vừa O-glycosid vừa C-glycosid như aloinosid, cả 2 chất này đều có trong lô hội

Ngoài ra, một số dẫn chất anthranoid còn ở dạng dimer, ví dụ hypericin có

trong cây Hypericum perforatum, rheidin A, B, C có trong đại hoàng Rheum

DĐVN III [2] và DĐTQ 2005 [77] cũng như nhiều tác giả khác đã áp dụng phương pháp TLC để định tính tinh dầu trong dược liệu bạch truật

Gần đây, một sô tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC, GC-MS, FTIR

và phân tích ADN [33,53,87,114] để kiểm tra chất lượng Bạch truật

Có thể định tính Bạch thược bằng TLC, HPLC, ADN, FTIR [2,33,53,77,114] DĐTQ 2005 quy định hàm lượng paeoniflorin trong bạch thược không dưới 1,6%

Rễ củ của cây Cát sâm, còn gọi là Sâm nam (Millettia speciosa Champ.),

họ Đậu (Fabaceae) Theo một số tài liệu, rễ Cát sâm chứa alcaloid, saponin

[14,26,90]

Chưa thấy tài liệu về định tính, định lượng thành phần hóa học trong Cát sâm

2.4.5 Chỉ thực

Quả non của cây Cam chua (Citrus auratium L.) và giống cây trồng của

nó hoặc cây Cam ngọt (Citrus sinensis Osbeck.) họ Cam (Rutaceae) Trong Chỉ

thực có các alcaloid (Synephrin, tyramin ), glycosid, saponin, flavonoid (hesperidin, naringin ) [14,26,41]

DĐVN III [2] và DĐTQ 2005 [77] quy định định tính Chỉ thực bằng TLC, dùng synephrin làm chất đối chiếu DĐTQ 2005 còn định lượng synephrin bằng HPLC Một số tác gỉa cũng đã nghiên cứu định tính, định lượng các thành phần alcaloid, flavonoid trong Chỉ thực bằng HPLC và HPLC-MS [41,113]

Một số dược điển như dược điển Mỹ [89], DĐTQ 2005 [77] quy định xác định hàm lượng silymarin trong quả Cúc gai bằng HPLC Ngoài ra, silymarin cũng còn được xác định bằng phương pháp điện di mao quản [79]

2.4.7 Cây Cứt lợn (cây Hoa ngũ sắc)

Dược liệu là phần trên mặt đất của cây Cứt lợn, còn gọi là cây Hoa ngũ

sắc (Ageratum conyzoides L.), họ Cúc (Asteraceae) Thành phần hóa học của

cây Hoa ngũ sắc gồm tinh dầu, flavonoid, alcaloid nhóm pyrolizidin, carotenoid, saponin [18,26,92] Tinh dầu cây hoa ngũ sắc có 51 thành phần, trong đó có 13 chất monoterpen hydrocarbon (5,0%), 7 chất monoterpen có oxy (1,4%),16 chất sesquiterpen hydrocarbon (4,3%), 4 chất sesquiterpen có oxy (0,8%), 6 chất chromen (85,2%) Các chất chromen bao gồm 7–methoxy-2,2’-dimethylchromen (precocen I) và ageratochromene (precocen II) Hàm lượng precocen I cao khoảng 80% Sự có mặt của một số thành phần chính này có thể

là cơ sở để định tính tinh dầu cây Hoa ngũ sắc [92]

Một số tài liệu nghiên cứu gần đây cho rằng trong cây Diệp hạ châu không thấy có alcaloid [8] và không phát hiện thấy phyllanthin và hypophyllanthin [28] Để định tính dược liệu Diệp hạ châu, có thể dùng phương pháp TLC [2] hoặc HPLC [28, 94]

2.4.9 Dành dành (Chi tử)

Dược liệu là quả chín của cây Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis.),

họ Cà phê (Rubiaceae) Thành phần hóa học của quả Dành dành (còn gọi là Chi tử) gồm có các iridoid glycosid (gardosid, shanzhisid, geniposid, acid geniposidic, genipingentiobiosid, scandosid methyl ester, desacetylasperulosid methyl ester, gardenosid, 5β- hydroxygeniposid, 10–acetylgeniposid), các acid hữu cơ (acid picrocrocinic ) các sắc tố (α- crocin, α- crocetin), tanin, tinh dầu pectin [1,14,26,51,52,57]

DĐVN III [2], DĐTQ 2005 [77] và dược điển Nhật XIV [51] quy định định tính bằng TLC, dùng geniposid làm chuẩn so sánh DĐTQ 2005 còn quy định hàm lượng gardenossid trong dành dành phải ít nhất 1,8% Một số tác giả cũng đã đưa ra phương pháp định tính Dành dành bằng HPLC [108] và GC [109]

Để định tính Diệp hạ châu đắng, hiện nay người ta thường dựa vào việc phân tích các thành phần chính như lignan hoặc alcaloid bằng phương pháp TLC hoặc HPLC [28,43]

2.4.11 Đại hồi

Dược liệu là quả chín của cây Hồi (Illicium verum Hook.f.), họ Hồi

(Illiciaceae) Thành phần hóa học của Đại hồi chủ yếu là tinh dầu (8 - 9%) hoặc hơn Thành phần của tinh dầu có 6 thành phần chính là linalol, estragol, terpincol, cis- anethol (< 0,5%), anisaldehyd và nhiều nhất là trans anethol (85 – 90%) và một số thành phần khác như 1,4- cineol, β- bisabolen, α- pinen, terpineol và có thể có safrol Ngoài tinh dầu, Đại hồi còn chứa các thành phần khác như catechin, protocatechin, dầu béo, các chất vô cơ [1,5,14,26,58]

Nhiều dược điển đã quy định định tính Đại hồi bằng TLC, nhưng sử dụng chất đối chiếu khác nhau như Dược điển châu Âu 2002 [40] dùng anethol và dầu oliu; BP 2005 [31] dùng anethol; DĐVN III [2] dùng tinh dầu hồi chuẩn Một số nghiên cứu mới đây đã phối hợp phương pháp TLC với HPLC-MS để định tính Đại hồi dựa vào thành phần sesquiterpen lacton [58] hoặc định tính nhanh bằng kính hiển vi huỳnh quang và GC [54] hay phối hợp HPLC với GC để phân tích thành phần tinh dầu Đại hồi [100]

2.4.12 Đại hoàng

Dược liệu là thân rễ của cây Đại hoàng (Rheum palmatum L.), họ Rau

răm (Polygonaceae) Thành phần hóa học của Đại hoàng chủ yếu là những dẫn chất anthranoid (3 - 5% đối với Đại hoàng Trung Quốc), tồn tại dưới các dạng khác nhau: anthraquinon tự do (chiếm 0,10 - 0,20 % theo dược liệu khô gồm chrysophanol, rhein, aloe-emodin, emodin, physcion), glucosid của anthraquinon (chiếm 60 – 70% các dẫn chất trên và gồm glucosid của các aglycon nói trên), anthron ở dạng dimer (Các rheidin A, B, C, các palmidin A,

B, C, dirhein), anthron glucosid ở dạng dimer (các senosid A, B, C, D).Các chất

ở dạng khử chiếm 30 – 40 % anthranoid và thường gặp ở cây tươi vào mùa đông

Thành phần thứ hai đáng chú ý của Đại hoàng là tanin (5 – 12%), chủ yếu thuộc nhóm pyrocatechic, một phần thuộc nhóm pyrogallic, các chất này dễ tan trong cồn: D-catechin, glucogalin,tetrarin (chất này khi thủy phân cho acid galic

và acid cinamic, rheosmin) Ngoài ra còn có các chất vô cơ, tinh bột pectin, nhựa [1,5,14,26]

Một số dược điển như DĐVN III, CP 2005, dược điển Nhật quy định dùng phương pháp TLC để định tính Đại hoàng, dùng emodin làm chất đối chiếu [2], sennosid A [51] Đại hoàng hay rhein [77] Ngoài ra, JP XIV, CP 2005

còn quy định phát hiện rhaponticin khi trộn lẫn loài Rheum rhaponticum L bằng

TLC Các dẫn chất anthraquinon có thể được định tính bằng phương pháp tạo màu với magnesi acetat rồi đo quang ở bước sóng 515 nm hoặc HPLC, điện di mao quản [67,96]

2.4.13 Đan sâm

Dược liệu là rễ và thân rễ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.), họ

Hoa môi (Lamiaceae) Trong rễ Đan sâm có các hợp chất phenol và acid phenolic (danshensu, acid rosmarinic, acid rosmarinic methyl ester, các acid salvianolic A, B, C, G, acid lithospermic và dimethyl ester của nó), các hợp chất diterpen (miltiron, salviol, tanshinon I, II A, II B ), và các thành phần khác như β- sitosterol, tanin, vitamin E [14,26]

CP 2005 [77] quy định định tính thành phần diterpen hoặc acid phenolic trong Đan sâm bằng TLC, đối chiếu với rễ Đan sâm chuẩn, tanshinon II A và acid salvianolic Người ta cũng đã định lượng các thành phần diterpen và acid phenolic bằng HPLC hoặc nghiên cứu xây dựng dấu vân tay HPLC bằng LC-

MS, UPLC để đánh giá chất lượng dược liệu Đan sâm [38,49,64,66]

2.4.14 Địa cốt bì

Dược liệu là vỏ rễ cây Câu kỷ (Lycium chinense Mill.), họ Cà

(Solanaceae) Theo một số tài liệu, Địa cốt bì có alcaloid (kukoamin), dipeptid (lyciumamid), saponin, betain [14,26,32] Đã có một số tác giả nghiên cứu phương pháp HPLC với detector ELSD để định tính, định lượng betain trong Địa cốt bì [32]

là 3 chất đặc trưng của Đương quy Trung Quốc) Ngoài ra, còn có coumarin (umbeliferon, scopoletin, xanthotoxin, acutilobin ) acid hữu cơ (acid vanidic, palmitic, nicotinic ) polysachrid, acid amin, vitamin, sterol, nguyên tố vi lượng [14,26] Từ dịch chiết butanol, tác giả Nguyễn Thị Hòang Anh [27] đã phân lập được 10 hợp chất: phenyl β-D-glucopyranosid benzyl-O-β-D-apiofuranosyl-(1-6) β- D- glucopyranosid

Trong rễ đương quy Nhật Bản có 0,26% tinh dầu, 0,19% ligustilid, 0,024 % butylphtalid, 0,17% % n-butylidenphtalid, coumarin (umbeliferon, scopolin ), polysacharid, acid amin, sterol, polyacetylen [14,26]

Người ta đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau để định tính, định lượng các thành phần trong Đương quy như TLC, HPLC [38,77]

2.4.16 Hạ khô thảo

Dược liệu là cụm quả cây Hạ khô thảo (Prunella vulgaris L.), họ Hoa môi

(Lamiaceae) Trong Hạ khô thảo có glucosid đắng là prunelin trong đó phần không đường là acid ursolic, alcaloid tan trong nước, muối vô cơ, tinh dầu (d-camphor, d-fenchon, ít alcol fenchilic), delphinidin, cyanidin [3,5,26] DĐVN III quy định định tính Hạ khô thảo bằng TLC [2] Theo CP 2005, acid ursolic trong hạ khô thảo được định tính bằng TLC và định lượng bằng HPLC [77]

2.4.17 Hoàng đằng

Dược liệu là thân và rễ cây Hoàng đằng (Fibraurea tinctoria Lour.), họ

Tiết dê (Menispermaceae) Hoàng đằng chứa các alcaloid (palmatin từ 1-3%, jatrorrhizin, berberin, columbamin) diterpen (fibleucin, fibraucin, fibleucinosid, tynophynosid) [1,5,14,26]

DĐVN III quy định định tính Hoàng đằng bằng TLC, đối chiếu với palmatin hydroclorid và định lượng alcaloid toàn phần bằng phương pháp cân [2]

Trong kiểm tra chất lượng Hương phụ, người ta thường dùng thành phần của tinh dầu làm chất đánh dấu, ví dụ CP 2005 [77] quy định định tính Hương phụ bằng TLC, dùng α-cyperon làm chất đối chiếu Một số tác giả [63] đã áp dụng phương pháp HPLC để xác định α-cyperon hoặc tác giả Li Y, và Yang

YH [62] đã xây dựng dấu vân tay sắc ký khí để kiểm tra chất lượng Hương phụ

2.4.19 Kê huyết đằng

Theo một số tài liệu, dược liệu mang tên Kê huyết đằng với cùng công dụng được lấy từ thân leo của nhiều loài cây ở một số chi thuộc những họ khác

nhau như Millettia sp ,Butea superba Roxb., Spatholobus anberectus Don.,

Spatholobus harmandii Gagnep thuộc họ Đậu (Fabaceae), Sargentodoxa cuneata (Oliv.) Rehd et Wils., họ Huyết đằng (Sargentodoxaceae) [5,14,26]

Theo DĐVN III [2], dược liệu được lấy từ cây Kê huyết đằng (Spatholobus

suberectus Dunn.), họ Đậu (Fabaceae) Thành phần hóa học của các loài rất

khác nhau [26]

2.4.20 Kim ngân hoa

Dược liệu là nụ lẫn hoa của cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.), họ

Kim ngân (Caprifoliaceae) Thành phần hóa học của Kim ngân hoa gồm flavonoid (luteolin, luteolin 7- glucosid, lonicerin, loniceraflavon), acid clorogenic (6%), các acid isoclorogenic a,b,c, tinh dầu (α- pinen, hex-1-en; hex-3-en-1-ol;cis và trans-2-methyl-2-vinyl-5-(α-hydroxyisopropyl)-tetrahydrofuran; geraniol, α-terpineol, eugenol, linalol ), saponin [5,26,35]

Để đánh giá chất lượng Kim ngân hoa, CP 2005 quy định định tính bằng TLC, dùng acid clorogenic làm chất đối chiếu, định lượng acid clorogenic bằng HPLC; một số tác giả đã áp dụng HPLC với detector DAD, ELSD, MS hoặc điện di mao quản để xác định thành phần các nhóm chất, hay phân tích ADN [35,36,61,80,85,95]

2.4.21 Mã tiền

Dược liệu là hạt lấy từ quả chín cây Mã tiền (Strychnos nux- vomica L.),

họ Mã tiền (Loganiaceae) Hoạt chất chính của hạt Mã tiền là các alcaloid nhân indol, mới đây người ta đã tách được 13 alcaloid (strychnin chiếm 50%, strychnin–N-oxid, brucin, α-colubrin, β-colubrin, vomicin, icajin novacin, pseudostrychnin ), ngoài ra, trong hạt mã tiền còn có dầu béo (4-5%), glycosid (loganin), acid loganic, acid igasulic (= acid clorogenic), stigmasterin, cycloartenol [1,5,14,26,111]

Để kiểm tra chất lượng Mã tiền, dược điển các nước đều quy định xác định thành phần alcaloid phương pháp TLC (đối với định tính) và định lượng strychnin bằng phương pháp UV-VIS [2] hoặc HPLC [51,77,101]

2.4.22 Mẫu đơn bì

Dược liệu là vỏ rễ cây Mẫu đơn (Paeonia suffruticosa Andr.), họ Hoàng

liên (Ranunculaceae) Thành phần hóa học của Mẫu đơn bì gồm alcaloid, saponin, paeonol, paeonosid, paeoniflorin khi thủy phân thu được paeonolid, oxypaeoniflorin, tinh dầu [5,14,26] Có thể định tính Mẫu đơn bì bằng TLC, dùng paeonol làm chất đối chiếu hoặc bằng phương pháp dấu vân tay HPLC xác

định một số thành phần chính và định lượng paeonol bằng phương pháp đo VIS, HPLC, GC [2,34,38,45,77,106,107]

UV-2.4.23 Mộc thông

Dược liệu là thân leo của một số cây như Mộc thông bắc (Clematis

armandii Franch.), cây Tú cầu đằng (Clematis montana Buch, - Ham ex DC),

họ Hoàng liên (Ranunculaceae) [2,77]

Ngoài ra, theo một số tài liệu khác,Mộc thông còn được lấy từ nhiều cây

khác như Mộc thông nam (Iodes vitiginea (Hance.) Hemsl.), họ Mộc thông

(Phytocrenaceae), một số cây thuộc họ Mộc Hương (Aristolochiaceae) hoặc

Bạch mộc thông (Akebia quinata (Thunb.) Decne một số cây khác nữa thuộc họ Lardizabalaceae [14,26,77]

Nói chung, thành phần hóa học của Mộc thông chưa thấy được công bố nhiều, tuy nhiên hiện nay Mộc thông là một trong những vị thuốc đang được chú

ý nhiều vì liên quan đến sự có mặt của acid aristolochic, một tác nhân gây ung

thư gan mạnh Theo một số tài liệu gần đây, các cây thuộc họ Aristolochiaceae,

Bạch mộc thông (Mu tong = akebia stem) có chứa acid aristolochic [52,69]

Trong cây Clematis armandii L., người ta đã xác định được các thành phần

saponin triterpenic,clematin (một flavanon glycosid) [37] [84] và hiện nay cây

này cũng như loài Clematis sp đang được tiếp tục nghiên cứu về acid

aristolochic [56,69] Phương pháp HPLC đang được áp dụng để xác định acid

này CP 2005 quy định định tính mộc thông Clematis armandii L bằng TLC,

dùng acid oleanolic làm chất đối chiếu Trong cây Mộc thông nam có acid béo

2.4.24 Nghệ

Dược liệu là thân rễ cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.), họ Gừng

(Zingiberaceae) Thành phần hóa học của thân rễ Nghệ vàng có các chất màu (bao gồm curcumin I,II và III và một số chất màu khác), 1 - 5% tinh dầu (chủ yếu là sesquiterpen ceton artumeron, α-tumeron, β-tumeron và culon và các hợp chất terpen khác như pinen, camphen, limonen, borneol, camphor, curcumen ), hợp chất có tác dụng antioxydant và chống viêm, chất béo, polysaccharid Dựa vào thành phần các sesquiterpen để phân loại các loại nghệ [5,14,26]

Để kiểm tra chất lượng Nghệ, ngoài các phép thử hóa học, vi học, DĐVN III quy định định tính thành phần curcumin trong nghệ bằng phương pháp TLC, định lượng tinh dầu và chất chiết được bằng ethanol 90% [2] Ngoài việc quy dịnh như DĐVN III, CP 2005 còn quy định định lượng curcumin bằng HPLC [77] Một số nghiên cứu gần đây đưa ra các phương pháp xác định các thành phần curcuminoid, sesquiterpenoid trong nghệ bằng HPLC-MS, điện di mao quản, GC-MS [29,46,68,81]

2.4.25 Ngưu tất

Dược liệu là rễ cây Ngưu tất di thực (Achyranthes bidentata Blume.), họ

Rau giền (Amaranthaceae) Trong rễ Ngưu tất có saponin triterpenic, khi thủy phân cho sapogenin là acid oleanolic, ngoài ra còn có ecdysteron, inokosteron, polysaccharid, emodin, physcion [1,26] DĐVN III và CP 2005 quy định định tính Ngưu tất bằng TLC, dùng acid oleanolic làm chất đối chiếu [2,77] Có tác giả đã nghiên cứu định tính, định lượng đồng thời 4 phytoecdyson bằng phương pháp HPLC – DAD [60]

2.4.26 Quế

Dược liệu là vỏ thân, vỏ cành của cây Quế (Cinnamomum cassia Presl.),

hoặc một số loài quế khác thuộc họ Long não (Lauraceae) Ở đây chỉ đề cập đến

Quế C cassi Vỏ Quế chứa 1- 3 % tinh dầu (trong đó chủ yếu là aldehyd

cinnamic chiếm 75 – 90%, salicylaldehyd, methylsalicylaldehyd, eugenol, methyleugenol ), tanin, nhựa, chất nhầy, coumarin, dẫn chất flavonol [1,5,14,26]

DĐVN III và CP 2005 quy định định tính thành phần tinh dầu của Quế bằng TLC, đối chiếu với aldehyd cinnamic và xác định hàm lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước, ngoài ra, CP 2005 yêu cầu xác định hàm lượng aldehyd cinnamic bằng HPLC Gần đây, một số tác giả đã đưa ra phương pháp định lượng bốn thành phần chính cinnamaldehyd, acid cinnamic, alcohol cinnamyl, coumarin và thiết lập dấu vân tay gồm 5 chất đánh dấu để định tính bằng RP- HPLC [47] Có tác giả đã nghiên cứu sử dụng phương pháp nhiễu xạ tia X kết hợp phổ fourier để định tính Quế [97]

2.4.27 Riềng

Là thân rễ của cây Riềng (Alpinia officinarum Hance.), họ Gừng

(Zingiberaceae) Thân rễ Riềng chứa nhiều diarylhepanoid, flavonoid (quercetin

và 3-methylether, galangin và 3-methylether, kaempferol, kaeferid, isorhamnetin), tinh dầu (chủ yếu là cineol, methylcinnamat) [5,14,26]

CP 2005 yêu cầu định tính tinh dầu Riềng bằng TLC, định lượng bằng

GC, dùng cineol làm chất chuẩn [77]

Feng YF và cộng sự [42] đã dùng phương pháp GC xác định dấu vân tay

để phân biệt và đánh gía chất lượng Riềng

Liu Z và một số tác giả [65] áp dụng phương pháp HPLC với detector DAD và điện hóa để xác định 5 thành phần diarylheptanoid trong Riềng

2.4.28 Sa nhân

Là quả gần chín của cây Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu.) và

một số loài Sa nhân khác thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) Ở đây chỉ đề cập đến

loài Sa nhân tím C longiligulare Quả Sa nhân tím chứa khoảng 0,65% tinh dầu

(gồm α-pinen, camphor, β-pinen, caren-3 và limonen borneol [3,26]

CP 2005 quy định định tính thành phần tinh dầu Sa nhân bằng TLC, dùng bornyl acetat làm chất đối chiếu

Tác giả Deng C và cộng sự [39] đã đưa ra phương pháp phân tích nhanh bằng cách dùng hơi nước ở áp suất 50 bar, nhiệt độ 150°C để chiết xuất tinh dầu

Sa nhân, sau đó chiết và làm giàu bằng vi chiết pha rắn ở 80°C rồi phân tích thành phần tinh dầu bằng GC-MS

2.4.29 Thăng ma

Dược liệu là thân rễ của một trong các loài Thăng ma (Cimicifuga

heracleifolia Kom., C dahurica (Turcz.) Maxim., C foetida L.), họ Hoàng liên

(Ranunculaceae) Thân rễ Thăng ma chứa thành phần chủ yếu là các triterpen với hàm lượng 4,3% (cimigerol, cimigerol 3–O-β-D-xylopyranosid, dahurinol, acid isoferulic ), các xylosid cimifugosid H1 H6, các cimicifugamid isocimiciffugamid là các dẫn xuất của cinnamamid, các phenolic glycosid (isocimifugamid, cimidahurin, cimidahurinin), các hợp chất furochromon (visamminol, visnagin, norvisnagin) [26]

CP 2005 quy định định tính thành phần triterpen bằng TLC, dùng acid ferulic và acid isoferulic làm chất đối chiếu; định lượng acid isoferulic bằng HPLC [77] Một số tác giả khác đã xây dựng dấu vân tay HPLC với detector DAD, MS và ELSD để định tính và phân biệt các loài Thăng ma, dùng các thành phần triterpen glycosid làm chất đánh dấu [44,98]

2.4.30 Trần bì

Dược liệu là vỏ quả chín của cây Quít (Citrus reticulata Blanco.), họ Cam

(Rutaceae) Trong vỏ Quít có tinh dầu (chủ yếu là d-limonen 91% và các terpen, caren, linalool, anthranilat methyl), flavonoid (hesperidin, neohesperidin, tangeretin ) [14,26]

CP 2005 quy định định tính Trần bì bằng TLC, đối chiếu với hesperidin, định lượng hesperidin bằng HPLC [77] DĐVN III yêu cầu định lượng hesperidin bằng phương pháp đo quang [2] Tác giả Xia J và cộng sự đã nghiên cứu định lượng hesperidin trong trần bì bằng HPLC với detector điện hóa [104]

2.5 Tổng quan về hesperidin, emodin và geniposid

2.5.1 Hesperidin [7,50,72]

Công thức phân tử: (C28H34O15)

Khối lượng phân tử: 610,56

Tên khoa học: (2S)-7-[[6-O-Deoxy-α-L-mannopyranosyl]-β-D-

glucopyranosyl]oxy]-2,3-dihydro-5-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one

Hesperidin (I) là một flavonoid có trong một số cây thuộc chi Citrus như

cam, chanh, quít, bưởi Khi thủy phân cho aglycon là hesperetin

Hesperidin là tinh thể hình kim nhỏ; nóng chảy ở 258 - 262°C; [α]D20 - 76° (c = 2 trong pyridin) Không tan trong nước lạnh, trong aceton, benzen, ether, cloroform, tan ít trong nước nóng, ethanol nóng, tan trong formamid, dimethylformamid nóng, tan nhiều trong pyridin Phổ hấp thụ tử ngoại có cực đại hấp thụ ở 284 nm và 328 nm (trong ethanol, methanol)

Hesperidin có tác dụng antioxidant, giảm tính thấm và tăng sức bền mao mạch… Hiện nay, trên thị trường có nhiều thuốc được điều chế từ các flavonoid

chiết từ vỏ quả các loài Citrus có tác dụng làm tăng sức bền mao mạch, dùng để

phòng và điều trị bệnh tim mạch, ví dụ thuốc Daflon chứa hesperidin

2.5.2 Geniposid [1,59,91]

Công thức phân tử: C17H24O10

Khối lượng phân tử: 388,38

Tên khoa học: Genipin-1-glucosid

Geniposid (II) là hợp chất monoterpenoid glycosid thuộc nhóm iridoid có trong quả dành dành

Geniposid là bột kết tinh màu trắng, dễ tan trong nước, ethanol, methanol, khó tan trong ether, cloroform Khi thủy phân geniposid cho aglycon là genipin, một chất mới được dùng để thay thế glutaradehyd trong vai trò tác nhân liên kết với gelatin làm nguyên liệu băng bó vết thương, kết dính sinh học

2.5.3 Emodin [1,72]

Công thức phân tử:C15H10O5

Khối lượng phân tử: 270,24

Tên khoa học: 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinon

Emodin là bột kết tinh hoặc tinh thể hình kim màu đỏ cam, điểm nóng chảy: 256 - 257°C Tan trong ethanol, dung dịch kiềm, khó tan trong ether ethylic và cloroform, thực tế không tan trong nước Dung dịch trong ethanol có cực đại hấp thụ tử ngoại ở 222, 252, 265, 289, 437 nm

Emodin là hợp chất anthraquinon ở dạng tự do hoặc ở dạng glycosid, có trong thân rễ đại hoàng, cốt khí muồng, cốt khí củ, chút chít và các cây khác

thuộc họ Rau răm (Polygonaceae)

H 3 C

2.6 Tổng quan về phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế một số hợp chất liên quan

Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi chỉ đề cập đến phương pháp chiết, phân lập và tinh chế một số hợp chất có liên quan đến các chất cần phân lập như hesperidin (flavonoid glycosid), emodin (Anthranoid) và geniposid (Iridoid

glycosid)

2.6.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế flavonoid và hesperidin

+ Các flavonoid nói chung có độ tan rất khác nhau trong nước và dung môi hữu cơ nên không ấn định một phương pháp chung để chiết xuất các flavonoid nhưng có thể dựa vào nguyên tắc sau:

Flavonoid glycosid là hợp chất phân cực, thường dễ tan trong các dung môi phân cực Vì vậy, thông thường, để chiết các flavonoid glycosid, phải loại các tạp chất thân dầu bằng dung môi hữu cơ không phân cực như ether dầu sau

đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hay ethanol ở các nồng độ thấp (70%, 80%, 90% ) Độ tan của các flavonoid trong các dung môi trên tăng lên khi làm nóng vì vậy, thường dùng phương pháp chiết nóng trong dụng cụ Soxhlet

Các flavonoid aglycon dễ tan trong dung môi kém phân cực, nên thường được chiết bằng các dung môi kém phân cực như benzen, cloroform… Thông thường để phân lập flavonoid dùng các phương pháp:

− Dùng chì acetat để kết tủa flavonoid, loại chì khỏi tủa bằng cách sục dihydrosulfid

− Dùng than hoạt để hấp phụ flavonoid

− Tách phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau và không hòa lẫn nhau hoặc bằng các dung dịch kiềm có độ kiềm khác nhau, sau đó kết tinh các flavonoid bằng cách acid hóa các dung dịch kiềm

2.6.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế anthranoid và emodin

+ Tính chất của dẫn chất anthraquinon là dễ thăng hoa, dạng glycosid tan được trong nước, dạng aglycon tan được trong dung môi hữu cơ Căn cứ vào vị trí nhóm OH và sự có mặt hay không nhóm COOH mà anthraquinon có độ tan khác nhau trong các loại kiềm khác nhau

Vì vậy, muốn chiết dạng glycosid, dùng ethanol, methanol hoặc hỗn hợp ethanol - nước Muốn chiết phần aglycon, thủy phân dịch chiết glycosid bằng acid, sau đó chiết bằng ether hoặc cloroform

+ Để tách các dẫn chất anthraquinon, có thể sử dụng độ hòa tan khác nhau trong môi trường kiềm khác nhau nhưng việc tách không triệt để mà thường còn lẫn một ít chất khác Thông thường hay dùng sắc ký cột, chất hấp phụ là silica gel, kieselghur, bột cellulose Để triển khai, nếu để tách các glycosid thì dùng ethanol, methanol với nồng độ khác nhau, khi tách các aglycon, dùng các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần, ví dụ cloroform tăng dần lượng ethanol từ 1-5% Hứng riêng các phân đoạn, theo dõi thành phần trong từng phân đoạn bằng TLC [1,7]

+ Tinh chế bằng sắc ký cột nhiều lần

Do emodin là một aglycon nên có thể dựa theo nguyên tắc trên để chiết

xuất, phân lập và tinh chế

2.6.3 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế iridoid glycosid và geniposid

- Các iridoid glycosid thường dễ tan trong nước, cồn loãng Thường dùng

cồn 50% làm dung môi chiết xuất Ngoài ra, butanol cũng được dùng để hạn chế tạp

- Tùy theo mỗi loại iridoid glycosid mà có phương pháp phân lập và tinh chế khác nhau phù hợp Thông thường, dùng phương pháp sắc ký cột, sắc ký chế hóa hoặc kết tinh phân đoạn trong các dung môi thích hợp

Geniposid là một iridoid glycosid đã được một số tác giả [59,91] chiết xuất từ quả dành dành bằng methanol sau khi đã loại chất béo và tinh dầu với cloroform Cô dịch chiết methanol dưới áp suất giảm rồi cho qua cột hấp phụ bằng than hoạt, loại đường bằng nước và ethanol 10% Giải hấp phụ bằng methanol, sau đó cho dịch chiết methanol qua cột sắc ký để tách các glycosid, rửa giải bằng methanol Tiến hành sắc ký cột lần 2 với silica gel, dung môi là methanol - cloroform, kết tinh lại trong aceton