Nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược

372 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết quả xác định tên khoa học của 30 dược liệu nghiên cứu Phụ lục 2: Một số thuốc thử đã dùng để phát hiện các nhóm chất và cách pha Phụ lục 3: Quy trình thiết

Tổng quan về tình hình nghiên cứu xây dựng dữ liệu chuẩn của các dược liệu

Để tiến hành nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu, vấn đề đầu tiên có tính chất quyết định là phải đảm bảo tính đúng của dược liệu, có nghĩa là dược liệu đó phải được định danh đúng tên, đúng loài, đúng bộ phận dùng [24] Cần tiêu chuẩn hóa và ghi lại các đặc điểm về hình thái bên ngoài, vi phẫu, bột, các đặc điểm hóa học đặc trưng để thể hiện tính đúng đó Tập hợp những đặc điểm thể hiện tính đúng của dược liệu được coi là dữ liệu chuẩn của dược liệu Dữ liệu chuẩn có thể góp phần làm căn cứ để định tính, phòng chống giả mạo, nhẫm lẫn, tiêu chuẩn hóa, kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu và chế phẩm của chúng

Do đó, việc nghiên cứu xây dựng dữ liệu chuẩn của dược liệu đã và đang được chú ý nhiều không chỉ ở nước ta mà còn ở các nước trên thế giới

Trước kia, trong các chuyên luận dược liệu, để định tính dược liệu, dược điển các nước chỉ đưa ra yêu cầu về đặc điểm hình thái bên ngoài, vi phẫu, bột của dược liệu và một số phản ứng hóa học đặc trưng bằng phản ứng trong ống nghiệm hoặc bằng kỹ thuật TLC Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật,việc sử dụng kỹ thuật số để chụp lại ảnh của dược liệu hay đặc điểm vi phẫu, bột dược liệu dưới kính hiển vi làm dữ liệu chuẩn về mặt thực vật của dược liệu đã trở nên phổ biến Để ghi lại các đặc điểm đặc trưng của dược liệu, người ta sử dụng kỹ thuật điểm chỉ dấu vân tay (fingeprint) như dấu vân tay hóa học, dấu vân tay ADN bằng các phương pháp phân tích hiện đại như phương pháp sắc ký, điện di, quang phổ, nhiễu xạ tia X, phân tích gen [33,36,41,42,67,73,99] hoăc kết hợp nhiều phương pháp khác nhau.Trong những phương pháp trên, sắc ký như TLC, HPTLC, HPLC, GC hoặc sắc ký kết hợp phương pháp đo phổ như LC-MS, GC-MS, FTIR, HPLC-DAD là phương pháp hay được sử dụng nhất để định tính và kiểm tra chất lượng dược liệu [44,45,46,53,58,115] Các dấu vân tay sắc ký là các sắc ký đồ chỉ ra các đặc trưng hóa học đa thành phần của dược liệu Vì vậy, trong những năm gần đây, bên cạnh TLC,dược điển các nước như USP, BP, CP, JP đã có nhiều chuyên luận dược liệu và chế phẩm đông dược áp dụng phương pháp HPLC, GC hay HPTLC trong định tính, định lượng hoạt chất hay nhóm chất đặc trưng của dược liệu

Trên thế giới, đã có nhiều tác giả tiến hành thu thập mẫu dược liệu và nghiên cứu về các mặt thực vật học, hóa học và đưa ra các dữ liệu dưới dạng atlas Ở Đức và Ấn Độ, việc nghiên cứu thiết lập dữ liệu chuẩn của dược liệu nhằm tiêu chuẩn hóa và kiểm tra chất lượng dược liệu và các thuốc từ dược liệu đã sớm được quan tâm Tính đến năm 2002, cuốn sách “Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals” của Max Wichtl đã được xuất bản 4 lần bằng tiếng Đức, trong đó đưa ra các ảnh chụp về đặc điểm hình thái và sắc ký đồ TLC [102] Năm 1996, 2 tác giả người Đức là H.Wagner và S Bladl đã cho ra mắt lần thứ nhất Atlas TLC của 170 dược liệu và đến năm 2001 xuất bản lần 2 với 230 dược liệu [93]

Năm 2002, Pulok K Mukhejee, khoa Công nghệ Dược phẩm, trường Đại học Jadavpur, Kolkata, Ấn Độ đã nghiên cứu đưa ra các hình ảnh về đặc điểm hình thái và sắc ký đồ TLC của các chất đặc trưng của 25 vị dược liệu ở Ấn Độ [78] Trung Quốc là một nước đóng góp nhiều công trình khoa học nghiên cứu về dược liệu, đặc biệt về lĩnh vực phân tích đặc điểm hóa học, đặc điểm di truyền, thiết lập dấu vân tay hóa học, dấu vân tay ADN coi đó là phương tiện hữu hiệu để so sánh, phân loại, định tính và đánh giá chất lượng dược liệu [33,71,105,106]

Năm 2005, Hồng Kông Trung Quốc đã xuất bản tập 1 bản tiêu chuẩn của

8 dược liệu trồng tại Hồng Kông, tiếp đó 7/2008 tập 2 ra đời với 24 chuyên luận dược liệu Các chuyên luận này bao gồm những hình ảnh về hình thái bên ngoài, vi phẫu, sắc ký đồ của HPLC phân tích các chất đặc trưng đại diện cho các dược liệu trong tiêu chuẩn [38] Ở nước ta, việc nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu cũng đã được Bộ Y tế quan tâm, chỉ đạo nhiều, đặc biệt trong mấy năm gần đây, đã có không ít các đề tài nghiên cứu về vấn đề này đã công bố hoặc đang trong giai đoạn thực hiện

Năm 2002, Nguyễn Viết Thân đã cho ra mắt tập 1 quyển “Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi”, trong đó có ảnh màu chụp cây thuốc, vị thuốc, vi phẫu, bột của 100 dược liệu [20] Năm 2005, Trịnh Văn Quỳ và cộng sự đã công bố các dữ liệu chuẩn bao gồm ảnh chụp vị thuốc,vi phẫu, bột và sắc ký đồ TLC của 25 dược liệu và sắc ký đồ HPLC, GC-MS của 11 dược liệu [16] Tiếp theo, Nguyễn Kim Bích và cộng sự đã phân tích dấu vân tay TLC của 20 dược liệu [4], Nguyễn Thị Bích Thu đã phân tích dấu vân tay HPLC của 10 dược liệu [22] Ngoài ra, người ta còn nghiên cứu xây dựng chỉ thị dấu vân tay ADN của một số dược liệu và coi đó là một đặc trưng của dược liệu cần kiểm tra khi định tính [17].

Tổng quan về một số phương pháp liên quan

Phương pháp cảm quan

Là phương pháp dùng các giác quan để kiểm tra về hình dáng, màu sắc, đặc điểm vết bẻ ngang, mùi vị, dùng thước để xác định kích thước của dược liệu Đây là phương pháp đơn giản và nhanh nhất để định tính, đánh giá sơ bộ về mặt chất lượng dược liệu Tuy nhiên, khi mẫu dược liệu thay thế hoặc giả mạo có đặc điểm bên ngoài rất giống mẫu dược liệu thật thì cần thiết phải áp dụng các phương pháp khác [1].

Phương pháp sử dụng kính hiển vi

Là phương pháp sử dụng kính hiển vi để nhận biết các đặc điểm của các mô, tế bào, hoặc các chất chứa trong tế bào, ở các lát cắt, bột, các mô đã được làm rã ra hoặc các tiêu bản bề mặt của dược liệu Phương pháp thông dụng nhất là phương pháp soi vi phẫu và soi bột

2.2.2.1 Phương pháp cắt, nhuộm và soi vi phẫu

Cắt dược liệu thành những lát mỏng theo chiều ngang hoặc dọc bằng lưỡi dao cạo, ống cắt vi phẫu cầm tay hay máy cắt vi phẫu, đem soi ngay lát cắt hoặc xử lý lần lượt với cloramin T 5%, cloral hydrat, dung dịch acid acetic 1%, nước cất rồi nhuộm với dung dịch xanh methylen và dung dịch đỏ carmin, sau đó soi dưới kính hiển vi

2.2.2.2 Phương pháp soi bột dược liệu

Nghiền dược liệu thành bột mịn, cho một lượng nhỏ bột vào một giọt dung dịch soi như nước cất, glycerin, cloral hydrat trên lam kính, khuấy kỹ và cẩn thận bằng kim mũi mác, đậy lam kính, di nhẹ rồi quan sát dưới kính hiển vi

Một số phương pháp sắc ký

2.2.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

TLC là một phương pháp tách mà trong đó pha tĩnh là một chất rắn thích hợp (có thể là silicagel, silicagel đã silan hóa, nhôm oxyd, cellulose ) được trải thành một lớp mỏng,mịn và đồng nhất trên bề mặt phiến kính, kim loại hay nhựa; pha động là một chất lỏng gồm một hay nhiều dung môi phối hợp với nhau Dung dịch chuẩn và dung dịch thử được chấm riêng biệt trên cùng một đường thẳng trên bản mỏng Sắc ký được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh mà trên đó đã đặt các chất cần tách Các thành phần trong hỗn hợp phân tích di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động với các tốc độ khác nhau nên được tách và phân bố khác nhau trên pha tĩnh Kết quả thu được sắc ký đồ trên lớp mỏng, ở đó các thành phần của hỗn hợp cần tách phân bố rải rác dọc theo đường đi của dung môi động Tùy thuộc bản chất chất phân tích, ta có thể nhận biết các thành phần được tách ra trên bản mỏng bằng ánh sáng thường (nếu chất phân tích có màu), soi huỳnh quang ở các bước sóng 254 nm, 366 nm, phun thuốc thử hiện màu hoặc dùng thiết bị densitometer để đo cường độ ánh sáng phản xạ hoặc truyền qua trong vùng UV-VIS

Khi phân tích, cần so sánh sắc ký đồ của dung dịch thử với sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Để định tính, sắc ký đồ của dung dịch thử phải có những vết chính giống với những vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn về các đặc trưng sắc ký như màu sắc, giá trị Rf

Rf là hệ số di chuyển và là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích Giá trị Rf được tính bằng tỷ lệ dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: b

Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm của vết (cm) b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết (cm)

Rf có giá trị từ 0 đến 1 và nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như chất làm pha tĩnh, độ dày và độ hoạt hóa của lớp mỏng, dung môi động, tạp chất, nhiệt độ phân tích, lượng mẫu phân tích Vì vậy, để so sánh thường phải triển khai song song với dung dịch chuẩn [2,55]

Hiện nay, mặc dù đã có nhiều kỹ thuật sắc ký hiện đại hơn nhưng TLC vẫn là một phương tiện có hiệu quả trong phân tích các thuốc thảo dược từ việc nghiên cứu sàng lọc ban đầu cho đến bán định lượng và định lượng vì đây là một kỹ thuật đơn giản và rẻ tiền nhất, có thể áp dụng được với hầu hết các hợp chất tự nhiên Do đó, TLC là kỹ thuật chủ yếu được WHO và dược điển các nước áp dụng trong kiểm tra chất lượng dược liệu và chế phẩm của chúng [2,77,103]

Tuy nhiên TLC có độ nhậy và độ phân giải chưa cao, hiện nay người ta đã cải tiến TLC thành HPTLC Sự khác nhau cơ bản giữa TLC thông thường và HPTLC là cỡ hạt và lỗ xốp của chất hấp phụ Với HPTLC, chất hấp phụ có cỡ hạt nhỏ (2 - 10àm) và bản mỏng cú độ dày nhỏ hơn (khoảng 100 - 200 àm) trong khi TLC thông thường dùng chất hấp phụ có cỡ hạt và khoảng phân bố lớn hơn (5 - 25àm), độ dày của bản mỏng thường ≥ 250àm Nhờ cỡ hạt nhỏ, lớp chất hấp phụ mỏng kết hợp với việc sử dụng công nghệ tinh xảo và tự động nên HPTLC có khả năng phân giải, độ nhậy cao, lượng mẫu và dung môi ít, khoảng di chuyển của dung môi ngắn (5 – 6 cm), thời gian phân tích nhanh Các chất hấp phụ thường được dùng trong các bản mỏng hiệu năng cao tráng sẵn hiện nay là silicagel và C18 với độ dày 100 àm Để định tớnh, định lượng cỏc thành phần phân tích được tách ra, người ta quét bản mỏng qua thiết bị scanner, một hệ thống phát hiện quang phổ với phổ hấp thụ UV-VIS, kích thích huỳnh quang và phổ phát xạ của các thành phần được tách ra trên bản mỏng Nhờ đó, có thể phát hiện đồng thời nhiều thành phần ở nhiểu bước sóng khác nhau và lựa chọn được bước sóng mà ở đó cho tín hiệu pic cao nhất, giúp cho việc định tính, định lượng chất phân tích [55]

HPTLC thích hợp cho việc phân tích định tính, định lượng thành phần trong dược liệu và thuốc từ dược liệu, vì vậy, hiện nay, kỹ thuật này đã được đưa vào DĐTQ 2005 để định tính, định lượng nhiều hoạt chất, chất đặc trưng trong dược liệu và một số chế phẩm đông dược như định lượng berberin trong hoàng liên, acid hyodeoxycholic trong bột mật lợn, oxymatrine trong Quảng đậu căn

2.2.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là phương pháp tách mà trong đó pha động là chất lỏng, pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc là chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Cơ chế của quá trình sắc ký lỏng là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ

Trong HPLC, mẫu phân tích được tiêm qua buồng tiêm và được đi vào cột nhờ pha động, các thành phần trong mẫu phân tích được tách ra trên pha tĩnh chứa trong cột rồi đi qua detector để phát hiện và cho các tín hiệu được ghi trên sắc đồ

Pha tĩnh hay dùng nhất trong HPLC là pha tĩnh mà trong đó các nhóm silanol trên bề mặt hạt silicagel (chất mang) đã được liên kết với các nhóm hóa học khác nhau tạo nên các hợp chất siloxan có độ phân cực khác nhau tùy theo nhóm liên kết: ⎢ ⎢

- Si-O-Si -R ⎢ ⎢ Khi R là các nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl và pha động phân cực, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC)

Khi R là nhóm khá phân cực như alkylamin hay alkylnitril pha động là dung môi ít phân cực, ta có sắc ký pha thuận (NP-HPLC) Hiện nay, kỹ thuật RP-HPLC được sử dụng rộng rãi vì tách tốt được nhiều hợp chất khác nhau Cột thụng dụng là cột ODS (RP18), C8 với cỡ hạt 5 hay 10àm Để cải thiện khả năng tách, tiết kiệm dung môi và thời gian, gần đây người ta đã đưa sắc ký lỏng nhanh (UFLC) vào ứng dụng rộng rãi Trong UFLC, kích thước hạt chất mang nhỏ (thường từ 1,7 – 2,2 àm) và cú thể sử dụng cột ngắn hơn (5-10cm)

Có nhiều loại detector khác nhau như detector tử ngoại – khả kiến (UV-VIS),tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), khúc xạ (RI), điện hóa trong đó detector chuỗi diode (DAD) cho phép thay đổi bước sóng theo chương trình đã đặt trong một quá trình sắc ký và đồng thời đo phổ của chất phân tích ở nhiều bước sóng cùng lúc, cho phép so sánh phổ để định tính Để định tính một chất người ta so sánh thời gian lưu của pic chất đó trên sắc ký đồ của dung dịch thử với thời gian lưu của pic chất chuẩn trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Đồng thời ta cũng sử dụng thời gian lưu tương đối (RRT) của một pic để xác định pic đó, thời gian lưu tương đối của một pic được tính toán dựa trên thời gian lưu của pic được chọn để đánh dấu theo công thức sau:

Thời gian lưu của pic so sánh

RRT = - Thời gian lưu của pic đánh dấu Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết trên cột (N) Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức: Để đặc trưng cho mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký người ta thường sử dụng độ phân giải R giữa 2 píc cạnh nhau Độ phân giải giữa 2 píc (píc số 1 và số 2) được tính theo công thức sau: tR: Thời gian lưu ω b : Độ rộng đáy píc

Khi: R = 0,75 hai píc không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều

R = 1,0 hai píc tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%

R = 1,5 hai píc tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3% [2,15,31,76,82] Để xây dựng một dấu vân tay của dược liệu bằng phương pháp HPLC, ta chọn các điều kiện chiết mẫu, điều kiện sắc ký như cột, pha động, loại detector phát hiện thích hợp với các thành phần hóa học của dược liệu đó Tiến hành sắc ký với nhiều lần mẫu thử và mẫu chuẩn đối chiếu để xem xét độ lặp lại, độ tinh khiết và ổn định của các pic được rửa giải ra trên sắc ký đồ Sau đó tiến hành chọn lựa các pic đặc trưng cho dược liệu, các pic này phải đảm bảo các yêu cầu sau:

− Pic phải xuất hiện ổn định

− Độ lặp lại tương đối (RSD) của thời gian lưu phải nhỏ hơn 1%

− Pic có độ tinh khiết cao (≥ 95,0%)

− Diện tích pic phải tương đối lớn (thông thường phải >1% tổng diện tích các pic chính)

− Độ phân giải với các pic cạnh không nhỏ hơn 1,0

Tổng quan về một số nhóm hợp chất chính thường gặp

Terpenoid

Terpen là hydrocarbon mà phân tử của nó được cấu tạo bởi nhiều đơn vị isopren C5H8 Terpenoid là terpen bị biến đổi về mặt hóa học, trong đó, nhóm methyl bị thay đổi vị trí hoặc mất đi, hay có thêm nguyên tử oxy Một số tác giả dùng thuật ngữ "terpen" với nghĩa rộng hơn, bao gồm cả terpenoid Giống như terpen, dựa vào số đơn vị isopren, terpenoid được chia thành monoterpenoid (gồm 2 đơn vị isopren, C10), sesquiterpenoid (gồm 3 đơn vị isopren, C15), diterpenoid (có 4 đơn vị isopren, C20), sesterterpenoid (có 5 đơn vị isopren, C25), triterpenoid (có 6 đơn vị isopren, C30), tetraterpenoid hay carotenoid (có

8 đơn vị isopren, C40) và polyterpenoid gồm một số lớn đơn vị isopren

Các terpenoid còn được xếp thành nhóm theo tính chất bay hơi, ví dụ tinh dầu là những mono và sesquiterpen dễ bay hơi, sau đó đến nhóm diterpen ít bay hơi và nhóm không bay hơi Ở đây chỉ đề cập đến một số terpenoid hay gặp trong cây thuốc

2.3.1.1 Momoterpen và sesquiterpen (Tinh dầu)

Tinh dầu là hỗn hợp nhiều thành phần, thường có mùi thơm, không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, dễ bay hơi ở nhiệt độ thường và có thể điều chế được từ thảo mộc bằng phương pháp cất kéo hơi nước Ngoài các thành phần monoterpen, sesquiterpen, tinh dầu còn có các thành phần bay hơi khác như các dẫn chất nhân thơm và các dẫn chất có nitơ và lưu huỳnh

Các dẫn chất monoterpen như menthol có trong tinh dầu bạc hà, cineol và α-terpineol có trong tinh dầu tràm, geraniol, citronelal trong tinh dầu sả Một số đại diện của dẫn chất sesquiterpen là β-Zingiberen, ar-curcumenen, β- farnesen trong tinh dầu gừng

Dẫn chất nhân thơm của tinh dầu như aldehyd cinamic trong tinh dầu quế, eugenol trong tinh dầu hương nhu và tinh dầu đinh hương, anethol trong tinh dầu hồi

Monoterpenoid glycosid gồm những glycosid mà bộ khung của phần aglycon được cấu tạo từ 2 đơn vị isopren Trong cây, các monoterpenoid glycosid được gặp nhiều nhất là nhóm Iridoid, cho đến nay, người ta đã biết đến trên 600 chất Khung cơ bản gồm một vòng cyclopentan nối với một vòng hydropyran Iridoid gồm các nhóm:

- Iridoid có aglycon đủ 10 carbon: Geniposid, gardenosid, gardosid trong quả dành dành (Gardenia jasminoides Ellis.), loganin trong lá kim ngân

- Iridoid không đủ 10 carbon: Rehmaniosid, catalpol trong sinh địa (Rehmania glutinosa (Gaertn.) Libosch

- Iridoid trên 10 carbon: Plumericrin trong vỏ cây đại (Plumeria rubra L var acutifolia (Poir) Bailay)

Diterpenoid glycosid gồm những glycosid mà bộ khung của phần aglycon được cấu tạo bởi 4 đơn vị isopren Một số hợp chất thuộc loại này như steviosid và những glycosid khác trong cỏ ngọt (Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley., darutosid trong hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.)…

Ngoài dạng glycosid, diterpen còn có thể tồn tại dạng tự do như tanshinon I,IIA,IIB, miltiron, salviol và các diterpen khác có trong đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.)

Triterpenoid được chia thành 4 nhóm chính: triterpen (true triterpen), steroid, saponin và glycosid tim Các triterpen thường có vị đắng nên còn được xếp vào nhóm chất đắng, chúng tồn tại trong cây dưới dạng tự do (ví dụ acid isoferulic, cimigenol và một số triterpen khác có trong thân rễ thăng ma (Cimicifuga foetida L.) hoặc glycosid (ví dụ chandravadana, momordicosid K và

L có trong cây mướp đắng (Momordica charantia L.)

Các hợp chất sterol và triterpen đều bắt nguồn từ một nguồn gốc sinh nguyên là squalen Từ squalen trong cây cỏ, hình thành nhiều hợp chất sterol khác Trước đây, sterol chủ yếu được xem như là những hormon của động vật nhưng gần đây, số lượng các chất này được tìm thấy trong thực vật ngày càng nhiều Một số chất điển hình như phytosterol, β-sitosterol, stigmasterol Cả 2 kiểu glycosid tim đều do β-sitosterol tạo ra

Saponin là nhóm glycosid gọi là saponosid Phân tử saponin gồm có phần aglycon thường gọi là sapogenin và phần đường Tùy theo cấu trúc hóa học của phần sapogenin mà saponin được chia thành 2 nhóm chính: saponin triterpen và saponin steroid Phần lớn saponin có trong cây thuộc loại saponin triterpen Phần đường có thể được nối qua nhóm OH ở vị trí C3 của phần aglycon

(monodesmosidic saponins), một số ít trường hợp phần đường gắn qua 2 nhóm

OH hoặc qua một nhóm OH và một nhóm carboxyl của aglycon (bisdesmosidic saponins) a Saponin triterpen

Sapogenin của saponin triterpen là các triterpenoid, có 30 carbon, rất khác nhau về cấu trúc hóa học, phân loại chủ yếu dựa vào số lượng vòng hydrocarbon nên được chia làm 2 nhóm lớn là saponin triterpenoid pentacyclic (có 5 vòng) và saponin triterpenoid tetracyclic (có 4 vòng) Nhóm pentacyclic lại được chia thành 4 nhóm nhỏ gồm olean, ursan, lupan và hopan, trong đó, nhóm olean chiếm phần lớn trong số các saponin triterpennoid trong tự nhiên Phần aglycon của nhóm olean phổ biến là dẫn chất của 3-β hydroxy olean 12–ene, gọi là β- amirin, ví dụ acid oleanolic, hederagenin Nhóm saponin triterpenoid tetracyclic được chia thành 5 nhóm gồm damaran, cycloartan, lanostan, cucubitan và β-onoserin Đại diện nhóm damaran là các saponin của nhân sâm (Panax Ginseng C.A Mey) như các ginsenosid Các dẫn chất cycloartan phân lập được từ một số loài thuộc họ Moraceae và các loài Astragalus họ Fabaceae và nhiều họ khác, chúng có tác dụng hạ cholesterol, hạ huyết áp, cường tim và lợi tiểu Nhóm β-onoserin là các dẫn chất trung gian đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp các steroid và triterpenoid b Saponin steroid

Sapogenin của nhóm này có cấu trúc khung steroid đặc trưng (gồm 4 vòng A, B, C, D), có 27 carbon Ngoài khung steroid còn có 2 dị vòng E và F Saponin steroid được chia thành 5 nhóm:

− Nhóm spirostan: Saponin nhóm này thường tồn tại ở 2 dạng đồng phân C25R

(iso) và C25S (neo) Các sapogenin thuộc nhóm này là diosgenin có chủ yếu trong các loài Dioscorea và hecogenin có chủ yếu trong các loài Agave

− Nhóm furostan: Có cấu trúc tương tự nhóm spirostan chỉ khác là vòng F mở, có 2 mạch đường (bidesmosid) ví dụ chất sarsaparillosid và avenacosid A

− Nhóm aminofurostan: Vòng F mở như nhóm furostan nhưng có nhóm -NH2 ở vị trí C-3, chất điển hình là jurubin có trong Solanum paniculatum

− Nhóm Spirosolan: Saponin thuộc nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy ở vòng F được thay thế bằng nhóm NH và có dạng isomer ở C-22 Ví dụ solasonin có trong cây cà lá xẻ Solanum laciniatum

− Nhóm solanidan: Điển hình là solanin phân lập được từ mầm khoai tây, hai vòng E và F có chung một nguyên tử carbon và nitơ

Các saponin thuộc nhóm aminofurostan, spirosolan và solanidan đều chứa nitơ, mang tính alcaloid, dưới dạng glucosid nên được gọi là glucoalcaloid.

Alcaloid

Alcaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật, thường có hoạt tính sinh học mạnh và cho phản ừng hóa học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alcaloid

Alcaloid có phổ biến trong thực vật, hiện nay đã biết khoảng trên 6 000 alcaloid từ hơn 5000 loài, hầu hết ở thực vật bậc cao, chiếm khoảng 15 – 20% tổng số các loài cây, tập trung ở các họ: như Trúc đào (Apocynaceae), Thuốc phiện (Papaveraceae), họ Đậu (Fabaceae) Rất ít trường hợp cây chỉ có một alcaloid duy nhất mà thường là hỗn hợp nhiều alcaloid, trong đó alcaloid có hàm lượng cao gọi là alcaloid chính, còn những alcaloid khác có hàm lượng thấp hơn gọi là alcaloid phụ Hàm lượng alcaloid phụ thuốc vào nhiều yếu tố như khí hậu, ánh sáng, chất đất, phân bón, giống cây, bộ phận thu hái, thời kỳ thu hái Trong cây, alcaloid ít khi ở trạng thái tự do (alcaloid base) mà thường ở dạng muối của các acid hữu cơ như citrat, tartrat, oxalat, malat, acetat (đôi khi ở dạng muối của acid vô cơ) tan trong dịch tế bào Ở một số cây alcaloid kết hợp với tanin hoặc acid đặc biệt khác Có một số ít trường hợp alcaloid kết hợp với đường tạo ra dạng glycoalcaloid như solasonin, solamacgin trong cây cà lá xẻ (Solanum lacinitaum)

Tùy theo cấu trúc của nhân, người ta phân loại alcaloid thành 3 nhóm chính: a/ Alcaloid không có nhân dị vòng: Những alcaloid thuộc loại này có nitơ nằm ở ngoài mạch thẳng, ví dụ hordenin trong mầm mạch nha, ephedrin trong ma hoàng b/ Alcaloid có nhân dị vòng: Được chia thành nhiều nhóm, sau đây là một số nhóm chính:

− Dẫn xuất nhân pyrrol hoặc pyrrolidin

− Dẫn xuất nhân pyridin hoặc piperidin: ví dụ nicotin trong thuốc lá, arecolin trong hạt cau

− Dẫn xuất nhân tropan (= Piperidin+ N- methyl pyrrolidin): Scopolamin trong cà độc dược

− Dẫn xuất nhân quinolin: Quinin, quinidin, cinchonin trong vỏ canhkina

− Dẫn xuất nhân isoquinolin: berberin trong hoàng liên, papaverin trong thuốc phiện

− Dẫn xuất nhân quinolizidin: spactein trong Sarothamnus scoparius

− Dẫn xuất nhân indol: Alcaloid của mã tiền, cựa khỏa mạch

− Dẫn xuất nhân imidazol: Pilocarpin trong Pilocarpus jaborandi

− Dẫn xuất nhân purin: Cafein, theophylin, theobromin trong chè, cà phê

− Dẫn xuất nhân quinazolin: α và β-dichroin trong thường sơn

− Dẫn xuất nhân acridin: Rutacridon trong Ruta graveolens

− Dẫn xuất nhân pyrrolizidin: Indicin trong cây Heliotropium indicum L

Trong các nhóm alcaloid có nhân dị vòng, 2 nhóm isoquinolin và indol có nhiều alcaloid được sử dụng trong điều trị bệnh và chúng được phân thành nhiều phân nhóm khác nhau

Dẫn xuất isoquinolin được phân thành 9 phân nhóm cấu trúc: Cấu trúc tetrahydroisoquinolin, benzylisoquinolin, ptalidisoquinolin, protoberrberin, protopin, aporphin, morphinan, benzophenanthridin và emetin

Nhóm indol gồm 6 phân nhóm cấu trúc: cấu trúc indolalkylamin, physostigmin, β-carbolin, ergolin, strychnin và các alcaloid nhân indol có cấu trúc phức tạp c/ Alcaloid có cấu trúc khác: Alcaloid có cấu trúc steroid thường tập trung ở họ Cà (Solanaceae) như solasodin, solanidin trong một số loài Solanum, họ Hành (Liliaceae), họ Trúc đào (Apocynaceae) Một số alcaloid có cấu trúc terpen, ví dụ aconitin trong ô đầu có cấu trúc diterpen.

Hợp chất phenol

Gần đây, hợp chất phenol được quan tâm đặc biệt vì chúng có khả năng ức chế chất sinh ung thư và chất gây đột biến, ngoài ra, hợp chất polyphenol còn có tác dụng chống oxy hóa, giảm đau

Hợp chất phenol bao gồm các hợp chất có ít nhất một vòng thơm và một hay nhiều nhóm thế hydroxyl tự do hoặc kết hợp với nhiều nhóm chức khác như ether, ester, glycosid Các hợp chất phenol tan trong nước vì phần lớn ở dạng glycosid Ở đây chỉ đề cập đến một số hợp chất hay gặp

Là nhóm hợp chất phenol lớn nhất thường gặp ở thực vật, cho đến nay đã có khoảng 4000 chất đã được xác định cấu trúc Khung cơ bản của flavonoid gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon

Dựa vào vị trí gốc aryl (vòng B) và mức độ oxy hóa của mạch 3C để phân loại flavonoid thành Euflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3, neoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4 Người ta còn phân biệt biflavonoid là những flavonoid dimer, triflavonoid cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignan

- Euflavonoid gồm các nhóm anthocyanidin, flavan, flavan 3-ol, flavan 4- ol, flavan 3,4-diol, flavanon, 3-hydroxy flavanon, flavon, flavonol, dihydrochalcon, chalcon, auron

+ Anthocyanidin là sắc tố phổ biến trong thực vật, có màu sắc thay đổi theo pH môi trường

+ Flavan 3-ol: Có nhiều dẫn chất khác nhau tùy theo nhóm thế ở 2 vòng A,B Ví dụ catechin và dẫn chất có trong lá trà Các dẫn chất flavan 3–ol có thể ở dạng ester, glycosid hay ở dạng dimer, trimer, tetramer, pentamer, gọi là proanthocyanidin (tanin ngưng tụ), ví dụ các chất theasinensnin A, B, C, D, F, G có trong một loại trà Camellia sinensis CV viridis

− Flavon: Các dẫn chất flavon rất phổ biến trong thực vật, kết tinh không màu đến vàng nhạt

− Flavanon: Hesperidin, naringin là những flavanon hay gặp trong một số cây thuộc Citrus

− Flavonol: Cũng là những dẫn chất rất phổ biến trong thực vật, ví dụ quercetin, kaemferol, myricetin là những chất hay gặp

− Chalcon: Là những chất có màu vàng đến vàng cam, chuyển thành màu đỏ cam hay đỏ ở môi trường kiềm, có chủ yếu trong một số hoa thuộc họ Cúc

Coumarin là những dẫn chất benzo-α-pyron, có cấu trúc C6 – C3 Chúng có thể được phân loại thành các nhóm sau: a Coumarin đơn giản hay còn gọi là coumarin không ngưng tụ (non-condensed coumarins): thường có các nhóm OH hoặc OCH3 được thế ở vị trí C-6 và C-

7, có khi được thế ở vị trí C-5 và C-8, ví dụ umbelliferon ở radix Angelicae, radix Heraclei scopoletin trong radix Scopoliae b Furanocoumarin: Các chất thuộc nhóm này có thêm một vòng furan được gắn ở vị trí C-6 và C-7 ( kiểu psoralen) hoặc C-7 và C-8 (kiểu angelicin), ví dụ angelicin ở radix Angelicae, psoralen ở herba Rutae c Pyranocoumarin: Các chất thuộc loại này có thêm vòng pyran được gắn ở vị trí C-6 và C-7 (xanthiletin), ví dụ xanthiletin hoặc C-7 và C-8 (seselin), ví dụ visnadin, samidin ở fructus Ammi majoris

Ngoài ra, còn một số nhóm khác như Dimeric coumarin, C- phenylcoumarin

Lignan là các hợp chất được tạo thành do sự oxy hóa của một cặp gồm 2 đơn vị p-hydroxyphenylpropen, thường được nối với nhau bởi một cầu oxy Chúng thường đươc tìm thấy trong quả, tâm gỗ và rễ của cây Có hàng trăm loại lignan, phân bố rộng rãi trong khoảng 70 họ thực vật Chúng khác nhau ở bậc oxy hóa, tạo vòng hoặc dẫn xuất Một số lignan hay được nhắc đến như phyllanthin, hypophyllanthin trong diệp hạ châu đắng (Phyllathus amarus Schum et Thonn.), silymarin như silybin, silychristin, silidianin có trong quả cúc gai (Silybum marianum Gaertn.) có tác dụng bảo vệ gan

Các acid phenolic: bao gồm 2 nhóm: dẫn xuất của acid benzoic và dẫn xuất của acid cinnamic a Dẫn xuất của acid benzoic: Là dẫn xuất hydroxyl của acid benzoic, tồn tại chủ yếu ở dạng tự do, đôi khi ở dạng ester hay glycosid Một số chất đại diện như acid salicylic (dạng ester), acid gallic, procatechic (dạng tự do và dạng ester) b Dẫn xuất của acid cinnamic: Hầu hết các acid như p-coumaric, acid caffeic, acid ferulic rất phổ biến trong cây; một số acid khác như o- coumaric, o- ferulic ít gặp hơn

Những hợp chất anthranoid nằm trong nhóm lớn hydroxyquinon, sắc tố tìm thấy chủ yếu trong trong ngành nấm, địa y, thực vật bậc cao Căn cứ vào số vòng thơm đính vào nhân quinon mà người ta xếp thành benzoquinon, naphtoquinon, anthraquinon và naphtacenquinon Ở đây chỉ đề cập đến nhóm anthraquinon hay anthranoid

Anthranoid được phân thành 2 nhóm: nhóm phẩm nhuộm và nhóm nhuận tẩy, trong đó nhóm nhuận tẩy được quan tâm nhiều Những dẫn chất thuộc nhóm nhuận tẩy thường có 2 nhóm OH đính ở vị trí 1, 8 và ở vị trí 3 thường là nhóm -CH3, -CH2OH, CHO hoặc -COOH nên còn được gọi là oxymethyl- anthraquinon Người ta hay gặp các dẫn chất có cùng cấu trúc , chí khác nhau ở mức độ oxy hóa ở C3 Ví dụ trong đại hoàng, chút chít, thảo quyết minh đều có mặt cả 3 chất chrysophanol, aloe emodin, rhein Những dẫn chất anthranoid khi ở trong cây có thể tồn tại dưới dạng oxy hóa (anthraquinon) hoặc dạng khử (anthron, anthranol) Trong cây, anthranoid tồn tại ở dạng aglycon và dạng glycosid, mạch đường thường nối vào vị trí 1, 8 hoặc 6, ví dụ frangulin A có trong vỏ cây Rhamnus frangula L Dây nối glycosid chủ yếu loại O-glycosid, đôi khi có loại C-glycosid như barbaloin với liên kết C-C ở vị trí 10, hoặc vừa O-glycosid vừa C-glycosid như aloinosid, cả 2 chất này đều có trong lô hội Ngoài ra, một số dẫn chất anthranoid còn ở dạng dimer, ví dụ hypericin có trong cây Hypericum perforatum, rheidin A, B, C có trong đại hoàng Rheum palmatum L

Tổng quan về thành phần hóa học và một số phương pháp kiểm tra chất lượng của 30 dược liệu nghiên cứu

Thân rễ của cây Bạch truật (Atractylodes macrocephala Koidz.), họ Cúc (Asteraceae) Thân rễ Bạch truật chứa các thành phần: tinh dầu 1,4% (thành phần chính của tinh dầu gồm atractylon, acetoxy atractylon, hydroxyatractylon, atractylat kali), sesquiterpen (eudemol), dẫn chất lacton (atractynolid I, II, III), juniper camphor [3,5,14,26]

DĐVN III [2] và DĐTQ 2005 [77] cũng như nhiều tác giả khác đã áp dụng phương pháp TLC để định tính tinh dầu trong dược liệu bạch truật

Gần đây, một sô tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC, GC-MS, FTIR và phân tích ADN [33,53,87,114] để kiểm tra chất lượng Bạch truật

Rễ của cây Bạch thược (Paeonia lactiflora Pall.), họ Hoàng liên (Ranunculaceae) Rễ Bạch thược chứa 3,3 - 5,7 % paeoniflorin, oxypaeoniflorin, albiflorin, benzoylpaeoniflorin, paeonosid, paeonolid, lactiflorin, acid benzoic, acid galic, methyl galat, d-catechin, triterpen (acid oleanolic, hederagenin), flavonoid, naringenin, acid 3β, 23 – dihydroxy-30-norolean-12,20(29)-dien-28- oic, ít tinh dầu [5,13,14,26]

Có thể định tính Bạch thược bằng TLC, HPLC, ADN, FTIR [2,33,53,77,114] DĐTQ 2005 quy định hàm lượng paeoniflorin trong bạch thược không dưới 1,6%

Thân rễ của cây Bán hạ (Pinellia ternata (Thunb.) Breit.), họ Ráy (Araceae) Thân rễ Bán hạ có acid amin, một chất alcaloid, alcol, chất cay, phytosterol, ít tinh dầu, dầu béo, chất nhày [14]

Bán hạ có thể được định tính bằng TLC [2,77] hoặc HPLC [105]

Rễ củ của cây Cát sâm, còn gọi là Sâm nam (Millettia speciosa Champ.), họ Đậu (Fabaceae) Theo một số tài liệu, rễ Cát sâm chứa alcaloid, saponin [14,26,90]

Chưa thấy tài liệu về định tính, định lượng thành phần hóa học trong Cát sâm

Quả non của cây Cam chua (Citrus auratium L.) và giống cây trồng của nó hoặc cây Cam ngọt (Citrus sinensis Osbeck.) họ Cam (Rutaceae) Trong Chỉ thực có các alcaloid (Synephrin, tyramin ), glycosid, saponin, flavonoid (hesperidin, naringin ) [14,26,41]

DĐVN III [2] và DĐTQ 2005 [77] quy định định tính Chỉ thực bằng TLC, dùng synephrin làm chất đối chiếu DĐTQ 2005 còn định lượng synephrin bằng HPLC Một số tác gỉa cũng đã nghiên cứu định tính, định lượng các thành phần alcaloid, flavonoid trong Chỉ thực bằng HPLC và HPLC-MS [41,113]

Dược liệu là quả cây Cúc gai (Silybum marianum (L.) Gaerth.), họ Cúc (Asteraceae) Từ quả cây Cúc gai, người ta đã phân lập được các flavonolignan như sylibin, silychristin, isosilybin, silydianin, dehydrosilybin silandrin gọi chung là silymarin, các flavonoid quercetin và quercitrin [10,51,79,86,89]

Một số dược điển như dược điển Mỹ [89], DĐTQ 2005 [77] quy định xác định hàm lượng silymarin trong quả Cúc gai bằng HPLC Ngoài ra, silymarin cũng còn được xác định bằng phương pháp điện di mao quản [79]

2.4.7 Cây Cứt lợn (cây Hoa ngũ sắc)

Dược liệu là phần trên mặt đất của cây Cứt lợn, còn gọi là cây Hoa ngũ sắc (Ageratum conyzoides L.), họ Cúc (Asteraceae) Thành phần hóa học của cây Hoa ngũ sắc gồm tinh dầu, flavonoid, alcaloid nhóm pyrolizidin, carotenoid, saponin [18,26,92] Tinh dầu cây hoa ngũ sắc có 51 thành phần, trong đó có 13 chất monoterpen hydrocarbon (5,0%), 7 chất monoterpen có oxy (1,4%),16 chất sesquiterpen hydrocarbon (4,3%), 4 chất sesquiterpen có oxy (0,8%), 6 chất chromen (85,2%) Các chất chromen bao gồm 7–methoxy-2,2’- dimethylchromen (precocen I) và ageratochromene (precocen II) Hàm lượng precocen I cao khoảng 80% Sự có mặt của một số thành phần chính này có thể là cơ sở để định tính tinh dầu cây Hoa ngũ sắc [92]

Diệp hạ châu còn gọi là Chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Dược liệu là toàn cây trên mặt đất Theo một số tài liệu, chó đẻ răng cưa có chứa flavonoid (kaemferol, rutin, quercetin), triterpen (stigmasterol, stigmasterol -3- 0- β- glucosid, β- sitosterol ), tanin (acid egalic, acid galic, acid 3,3’,4-tri-o-methyl egalic), phenol, acid hữu cơ (acid ferulic, acid succinic), lignan (phylanthin) [5,8,14,19,26]

Một số tài liệu nghiên cứu gần đây cho rằng trong cây Diệp hạ châu không thấy có alcaloid [8] và không phát hiện thấy phyllanthin và hypophyllanthin [28] Để định tính dược liệu Diệp hạ châu, có thể dùng phương pháp TLC [2] hoặc HPLC [28, 94]

Dược liệu là quả chín của cây Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis.), họ Cà phê (Rubiaceae) Thành phần hóa học của quả Dành dành (còn gọi là Chi tử) gồm có các iridoid glycosid (gardosid, shanzhisid, geniposid, acid geniposidic, genipingentiobiosid, scandosid methyl ester, desacetylasperulosid methyl ester, gardenosid, 5β- hydroxygeniposid, 10–acetylgeniposid), các acid hữu cơ (acid picrocrocinic ) các sắc tố (α- crocin, α- crocetin), tanin, tinh dầu pectin [1,14,26,51,52,57]

DĐVN III [2], DĐTQ 2005 [77] và dược điển Nhật XIV [51] quy định định tính bằng TLC, dùng geniposid làm chuẩn so sánh DĐTQ 2005 còn quy định hàm lượng gardenossid trong dành dành phải ít nhất 1,8% Một số tác giả cũng đã đưa ra phương pháp định tính Dành dành bằng HPLC [108] và GC

Diệp hạ châu đắng còn được gọi là Chó đẻ thân xanh (Phyllanthus amarus Schum et Thonn ), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Dược liệu là toàn cây trên mặt đất Thành phần hóa học của Diệp hạ châu đắng gồm các lignan (phyllanthin, hypophyllanthin), flavonoid, alcaloid (epibubbialin, niruroidin, isobubialin ), tanin, polyphenol, acid hữu cơ, 1,6-digalloyl glucopyranosid, corilagin, geraniin, chất khoáng, kim loại nặng [5,8,14,23,26,43] Để định tính Diệp hạ châu đắng, hiện nay người ta thường dựa vào việc phân tích các thành phần chính như lignan hoặc alcaloid bằng phương pháp TLC hoặc HPLC [28,43]

Dược liệu là quả chín của cây Hồi (Illicium verum Hook.f.), họ Hồi (Illiciaceae) Thành phần hóa học của Đại hồi chủ yếu là tinh dầu (8 - 9%) hoặc hơn Thành phần của tinh dầu có 6 thành phần chính là linalol, estragol, terpincol, cis- anethol (< 0,5%), anisaldehyd và nhiều nhất là trans anethol (85 – 90%) và một số thành phần khác như 1,4- cineol, β- bisabolen, α- pinen, terpineol và có thể có safrol Ngoài tinh dầu, Đại hồi còn chứa các thành phần khác như catechin, protocatechin, dầu béo, các chất vô cơ [1,5,14,26,58]

Nhiều dược điển đã quy định định tính Đại hồi bằng TLC, nhưng sử dụng chất đối chiếu khác nhau như Dược điển châu Âu 2002 [40] dùng anethol và dầu oliu; BP 2005 [31] dùng anethol; DĐVN III [2] dùng tinh dầu hồi chuẩn Một số nghiên cứu mới đây đã phối hợp phương pháp TLC với HPLC-MS để định tính Đại hồi dựa vào thành phần sesquiterpen lacton [58] hoặc định tính nhanh bằng kính hiển vi huỳnh quang và GC [54] hay phối hợp HPLC với GC để phân tích thành phần tinh dầu Đại hồi [100]

Tổng quan về hesperidin, emodin và geniposid

Hesperidin

Tên khoa học: (2S)-7-[[6-O-Deoxy-α-L-mannopyranosyl]-β-D- glucopyranosyl]oxy]-2,3-dihydro-5-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)- 4H-1-benzopyran-4-one

Hesperidin (I) là một flavonoid có trong một số cây thuộc chi Citrus như cam, chanh, quít, bưởi Khi thủy phân cho aglycon là hesperetin

Hesperidin là tinh thể hình kim nhỏ; nóng chảy ở 258 - 262°C; [α]D 20 - 76° (c = 2 trong pyridin) Không tan trong nước lạnh, trong aceton, benzen, ether, cloroform, tan ít trong nước nóng, ethanol nóng, tan trong formamid, dimethylformamid nóng, tan nhiều trong pyridin Phổ hấp thụ tử ngoại có cực đại hấp thụ ở 284 nm và 328 nm (trong ethanol, methanol)

Hesperidin có tác dụng antioxidant, giảm tính thấm và tăng sức bền mao mạch… Hiện nay, trên thị trường có nhiều thuốc được điều chế từ các flavonoid chiết từ vỏ quả các loài Citrus có tác dụng làm tăng sức bền mao mạch, dùng để phòng và điều trị bệnh tim mạch, ví dụ thuốc Daflon chứa hesperidin

Geniposid

Tên khoa học: Genipin-1-glucosid Geniposid (II) là hợp chất monoterpenoid glycosid thuộc nhóm iridoid có trong quả dành dành

Geniposid là bột kết tinh màu trắng, dễ tan trong nước, ethanol, methanol, khó tan trong ether, cloroform Khi thủy phân geniposid cho aglycon là genipin, một chất mới được dùng để thay thế glutaradehyd trong vai trò tác nhân liên kết với gelatin làm nguyên liệu băng bó vết thương, kết dính sinh học.

Emodin

Tên khoa học: 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinon Emodin là bột kết tinh hoặc tinh thể hình kim màu đỏ cam, điểm nóng chảy: 256 - 257°C Tan trong ethanol, dung dịch kiềm, khó tan trong ether ethylic và cloroform, thực tế không tan trong nước Dung dịch trong ethanol có cực đại hấp thụ tử ngoại ở 222, 252, 265, 289, 437 nm

Emodin là hợp chất anthraquinon ở dạng tự do hoặc ở dạng glycosid, có trong thân rễ đại hoàng, cốt khí muồng, cốt khí củ, chút chít và các cây khác thuộc họ Rau răm (Polygonaceae)

Hesperidin (I) Geniposid (II) Emodin (III)

Tổng quan về phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế một số hợp chất liên quan

Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế flavonoid và

+ Các flavonoid nói chung có độ tan rất khác nhau trong nước và dung môi hữu cơ nên không ấn định một phương pháp chung để chiết xuất các flavonoid nhưng có thể dựa vào nguyên tắc sau:

Flavonoid glycosid là hợp chất phân cực, thường dễ tan trong các dung môi phân cực Vì vậy, thông thường, để chiết các flavonoid glycosid, phải loại các tạp chất thân dầu bằng dung môi hữu cơ không phân cực như ether dầu sau đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hay ethanol ở các nồng độ thấp (70%, 80%, 90% ) Độ tan của các flavonoid trong các dung môi trên tăng lên khi làm nóng vì vậy, thường dùng phương pháp chiết nóng trong dụng cụ Soxhlet

Các flavonoid aglycon dễ tan trong dung môi kém phân cực, nên thường được chiết bằng các dung môi kém phân cực như benzen, cloroform… Thông thường để phân lập flavonoid dùng các phương pháp:

− Dùng chì acetat để kết tủa flavonoid, loại chì khỏi tủa bằng cách sục dihydrosulfid

− Dùng than hoạt để hấp phụ flavonoid

− Tách phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau và không hòa lẫn nhau hoặc bằng các dung dịch kiềm có độ kiềm khác nhau, sau đó kết tinh các flavonoid bằng cách acid hóa các dung dịch kiềm

− Tách bằng sắc ký cột

− Có thể tinh chế flavonoid bằng cách:

− Tách qua cột sắc ký nhiều lần với chất hấp phụ là polyamid, cellulose, silica gel

− Kết tinh lại trong ethanol, methanol hoặc hỗn hợp ethanol - aceton, ethanol - ethyl acetat [1,9,25]

Theo một số công trình nghiên cứu đã công bố [7,50], người ta đã chiết xuất hesperidin như sau: Loại tạp bằng ether dầu hỏa, chiết bằng ethanol 70%, loại tạp trong dịch chiết ethanol bằng than hoạt Cất thu hồi ethanol, hòa tan cắn trong nước nóng, acid hóa dịch chiết đến pH = 5-6, thu được tủa trắng, lọc lấy tủa, hòa tan lại trong ethanol nóng, thêm than hoạt để tinh chế, kết tinh lại heperidin từ dung dịch ethanol loãng thu được hesperidin

2.6.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế anthranoid và emodin

+ Tính chất của dẫn chất anthraquinon là dễ thăng hoa, dạng glycosid tan được trong nước, dạng aglycon tan được trong dung môi hữu cơ Căn cứ vào vị trí nhóm OH và sự có mặt hay không nhóm COOH mà anthraquinon có độ tan khác nhau trong các loại kiềm khác nhau

Vì vậy, muốn chiết dạng glycosid, dùng ethanol, methanol hoặc hỗn hợp ethanol - nước Muốn chiết phần aglycon, thủy phân dịch chiết glycosid bằng acid, sau đó chiết bằng ether hoặc cloroform

+ Để tách các dẫn chất anthraquinon, có thể sử dụng độ hòa tan khác nhau trong môi trường kiềm khác nhau nhưng việc tách không triệt để mà thường còn lẫn một ít chất khác Thông thường hay dùng sắc ký cột, chất hấp phụ là silica gel, kieselghur, bột cellulose Để triển khai, nếu để tách các glycosid thì dùng ethanol, methanol với nồng độ khác nhau, khi tách các aglycon, dùng các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần, ví dụ cloroform tăng dần lượng ethanol từ 1-5% Hứng riêng các phân đoạn, theo dõi thành phần trong từng phân đoạn bằng TLC [1,7]

+ Tinh chế bằng sắc ký cột nhiều lần

Do emodin là một aglycon nên có thể dựa theo nguyên tắc trên để chiết xuất, phân lập và tinh chế.

Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế iridoid glycosid và

- Các iridoid glycosid thường dễ tan trong nước, cồn loãng Thường dùng cồn 50% làm dung môi chiết xuất Ngoài ra, butanol cũng được dùng để hạn chế tạp

- Tùy theo mỗi loại iridoid glycosid mà có phương pháp phân lập và tinh chế khác nhau phù hợp Thông thường, dùng phương pháp sắc ký cột, sắc ký chế hóa hoặc kết tinh phân đoạn trong các dung môi thích hợp

Geniposid là một iridoid glycosid đã được một số tác giả [59,91] chiết xuất từ quả dành dành bằng methanol sau khi đã loại chất béo và tinh dầu với cloroform Cô dịch chiết methanol dưới áp suất giảm rồi cho qua cột hấp phụ bằng than hoạt, loại đường bằng nước và ethanol 10% Giải hấp phụ bằng methanol, sau đó cho dịch chiết methanol qua cột sắc ký để tách các glycosid, rửa giải bằng methanol Tiến hành sắc ký cột lần 2 với silica gel, dung môi là methanol - cloroform, kết tinh lại trong aceton

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế nghiên cứu

- Thu thập, định danh dược liệu, khảo sát các mẫu dược liệu về mặt cảm quan, đặc điểm vi phẫu, bột, xác định đặc điểm sắc ký,từ đó đưa ra dấu vân tay sắc ký của mỗi dược liệu và quy trình xây dựng bộ dữ liệu chuẩn nói chung

- Khảo sát, lựa chọn quy trình chiết xuất, tinh chế 3 hợp chất emodin, hesperidin, geniposid từ các dược liệu nghiên cứu để làm chất đối chiếu dùng trong nghiên cứu của đề tài.

Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiên cứu

Chọn mẫu

Mẫu nghiên cứu để xây dựng dữ liệu chuẩn là các dược liệu dễ nhầm lẫn, nhiều loài, thường được sử dụng thay thế hoặc dược liệu có tần suất sử dụng cao trong các bài thuốc.

Cỡ mẫu

Mỗi dược liệu khảo sát gồm 1- 4 mẫu dược liệu chuẩn (thông thường một số mẫu dược liệu Trung Quốc do Viện Kiểm nghiệm Trung Quốc cung cấp chỉ có 1 mẫu); 1 mẫu dược liệu so sánh có cùng tên gọi hoặc cùng chi khác loài được mua trên thị trường hoặc được thu hái và đã được xác định tên khoa học.

Đối tượng nghiên cứu

Các dược liệu được chọn làm đối tượng nghiên cứu xây dựng dữ liệu chuẩn gồm 30 dược liệu ở bảng 3.2.3.1

Bảng 3.2.3.1 Danh sách 30 dược liệu nghiên cứu

Stt Tên d ượ c li ệ u Stt Tên d ượ c li ệ u Stt Tên d ượ c li ệ u

1 Bạch thược 11 Đại hoàng 21 Mã tiền

2 Bạch truật 12 Đại hồi 22 Mẫu đơn bì

3 Bán hạ 13 Đan sâm 23 Mộc thông

4 Cát sâm 14 Địa cốt bì 24 Nghệ vàng

5 Chỉ thực 15 Đương quy 25 Ngưu tất

6 Diệp hạ châu 16 Hạ khô thảo 26 Quế

7 Cây cứt lợn (Cây hoa ngũ sắc)

8 Cúc gai 18 Hương phụ (củ gấu) 28 Sa nhân

9 Dành dành 19 Kê huyết đằng 29 Thăng ma

10 Diệp hạ châu đắng 20 Kim ngân hoa 30 Trần bì

Các mẫu dược liệu nghiên cứu đều có nguồn gốc rõ ràng, đã được xác định đúng tên khoa học và đúng bộ phận dùng, trong đó có 6 dược liệu có nguồn gốc từ Trung Quốc do Viện Kiểm nghiệm thuốc và các sản phẩm sinh học Trung Quốc cung cấp là bán hạ bắc, đan sâm, địa cốt bì, đương quy, mẫu đơn bì và thăng ma Các dược liệu còn lại có nguồn gốc trong nước.Tổng số mẫu là 60, số lượng mỗi mẫu ≥ 500 g

− Các mẫu dược liệu chuẩn dùng để khảo sát được ký hiệu là T (T1, T2, T3 )

− Các mẫu dược liệu so sánh được ký hiệu là S (S1, S2 )

− Nguyên liệu để chiết xuất 3 hợp chất emodin, hesperidin và geniposid là Đại hoàng, Trần bì và quả Dành dành

Các chất chuẩn đối chiếu hoặc chất đánh dấu

chất được sử dụng trong đề tài được ghi trong bảng 3.2.4.1

Bảng 3.2.4.1 Danh sách các chất chuẩn đối chiếu hoặc chất đánh dấu dùng trong đề tài

3 Acid oleanolic Viện Dược liệu

Phương pháp nghiên cứu

Chỉ tiêu nghiên cứu

3.3.1.1 D ượ c li ệ u nghiên c ứ u a Mẫu dược liệu chuẩn: Các mẫu dược liệu chuẩn phải được xác định đúng tên khoa học, đúng bộ phận dùng Số lượng mẫu là 1- 4 đối với mỗi dược liệu và được lấy tại các thời điểm thu hái hoặc nơi thu hái khác nhau Các mẫu sau khi thu hái đã được xử lý, bảo quản theo đúng quy định để đảm bảo chất lượng b Mẫu dược liệu so sánh: Là dược liệu có cùng tên gọi, dược liệu được dùng thay thế (bắc, nam) được mua trên thị trường hoặc cũng đã được xác định đúng tên, đúng bộ phận dùng

3.3.1.2.Phân tích các đặ c đ i ể m c ấ u t ạ o bên ngoài và bên trong

- Phân tích các dược liệu nghiên cứu về đặc điểm bên ngoài (hình thái, màu sắc, mùi vị), các đặc điểm cấu tạo bên trong (vi phẫu, bột)

3.3.1.3 Chi ế t và tinh ch ế các ch ấ t chu ẩ n

Khảo sát, lựa chọn điều kiện để chiết xuất, tinh chế 3 chất emodin, hesperidin, geniposid từ Đại hoàng, Trần bì, Dành dành Định tính, định lượng và kiểm tra xác định cấu trúc, độ tinh khiết và một số thông số hóa lý cơ bản của chất chiết được Các chất chiết được có độ tinh khiết đạt yêu cầu để làm chất đối chiếu dùng trong đề tài

3.3.1.4 Phân tích các thành ph ầ n hóa h ọ c c ủ a các d ượ c li ệ u nghiên c ứ u b ằ ng các k ỹ thu ậ t s ắ c ký nh ư HPTLC, HPLC, GC-MS

Khảo sát các điều kiện chiết tách, phân tích và tiến hành phân tích trên các dược liệu chuẩn, so sánh với dược liệu so sánh hoặc chất chuẩn hoặc chất đánh dấu (nếu có), đánh giá, xử lý số liệu và đưa ra các sắc ký đồ đặc trưng của dược liệu chuẩn.

Phương pháp nghiên cứu

Tiến hành phân tích và xây dựng dữ liệu chuẩn của dược liệu bao gồm các bước được tóm tắt trong hình 3.3.2.1 dưới đây:

Hình 3.3.2.1 Sơ đồ các bước nghiên cứu xây dựng dữ liệu chuẩn của dược liệu

3.3.2.1 Phương pháp thu thập, xác định tên khoa học của các mẫu dược liệu

Thu thập mẫu dược liệu tươi, xác định tên khoa học theo các bộ thực vật chí hiện có và các tài liệu khác về cây thuốc, được thực hiện bởi các nhà thực vật học, khoa Tài nguyên cây thuốc Viện Dược liệu và bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội Sau đó phơi hoặc sấy khô ở nhiệt độ không quá 60°C

3.3.2.2 Phương pháp phân tích các đặc điểm bên ngoài, vi phẫu, bột

Tiến hành theo phương pháp của DĐVN III, phụ lục 9.8

Thu thập dược liệu Định danh

Vi học TLC HPLC GC

(dược liệu có tinh dầu)

Phân tích Ảnh vi phẫu, bột

Tập hợp, lựa chọn đặc điểm đặc trưng

3.3.2.3 Phương pháp bảo quản, lưu giữ cơ sở dữ liệu: a/ Bảo quản, lưu giữ các dữ liệu dạng văn bản, hình ảnh trong đĩa CD b/ Bảo quản, lưu giữ các mẫu dược liệu chuẩn (hiện vật):

Các mẫu dược liệu chuẩn trước, trong và sau quá trình nghiên cứu được sấy hoặc phơi khô, đóng trong túi polyethylen, hàn kín, mỗi mẫu dược liệu được chia thành 2 lô bảo quản trong 2 điều kiện khác nhau:

- Lô 1: Để trong bình thủy tinh nút mài, đậy kín

- Lô 2: Để trong bình hút ẩm kín có silica gel làm chất hút ẩm

Cả 2 loại bình đều được bảo quản trong cùng một phòng thí nghiệm của Khoa kiểm nghiệm đông dược- Dược liệu, viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương với điều kiện nhiệt độ 25°C ± 5°C, độ ẩm ≤ 75% Định kỳ 3 tháng một lần theo dõi, đưa ra nhận xét chất lượng của dược liệu về mặt cảm quan (màu sắc, mùi, vị, có hiện tượng ẩm mốc, mối mọt hay không)

3.3.2.4 Phương pháp phân tích các thành phần hóa học của dược liệu bằng các kỹ thuật sắc ký TLC, HPLC, GC-MS

Tiến hành khảo sát, lựa chọn các điều kiện phân tích thích hợp đối với từng dược liệu như phương pháp xử lý mẫu, điều kiện sắc ký (pha tĩnh, pha động, phát hiện), đánh giá kết quả… Sau đây là những phương pháp đã được áp dụng a Ph ươ ng pháp TLC

- Chu ẩ n b ị dung d ị ch phân tích Để phân tích dược liệu, thường dùng dịch chiết methanol vì methanol là dung môi có thể chiết được hầu hết các nhóm hợp chất trong dược liệu Tuy nhiên, trong trong một số trường hợp, có thể dùng các dung môi khác có độ phân cực khác nhau nhằm làm giàu hoạt chất cần phân tích và loại bớt tạp chất kèm theo gây cản trở quá trình tách sắc ký và phát hiện nhóm chất

Qua tham khảo tài liệu, tùy theo từng dược liệu để lựa chọn nhóm chất cần phân tích đặc trưng cho dược liệu đó, từ đó có phương pháp chiết thích hợp đối với từng nhóm chất Đối với dược liệu chưa được công bố về thành phần hóa học, chúng tôi dùng dịch chiết methanol hoặc tiến hành sàng lọc qua các dung môi có độ phân cực tăng dần, sau đó phân tích từng dịch chiết phân đoạn, lựa chọn phân đọan có có sắc ký đồ rõ nhất Dưới đây là một số phương pháp chiết đã áp dụng để chiết một số nhóm chất cần phân tích:

Lấy 1- 2 g bột dược liệu, thêm 10 ml methanol, đun sôi hồi lưu trên cách thủy khỏang 10 phút hoặc lắc siêu âm 30 phút, lọc Dùng dịch lọc làm dung dịch phân tích sắc ký

+ Chiết tinh dầu và các thành phần kém phân cực như terpenoid dạng genin, coumarin và anthranoid dạng aglycon tự do: y Lấy 1-2 g bột dược liệu, thêm 10 ml n-hexan (hoặc ether ethylic, ethanol tuyệt đối) ngâm 2 giờ hoặc lắc siêu âm 30 phút, lọc Dùng dịch lọc làm dung dịch thử chấm sắc ký lớp mỏng y Phương pháp cất kéo hơi nước: Tiến hành theo phương pháp định lượng tinh dầu trong dược liệu ghi trong DĐVN III (phụ lục 9.2) Phương pháp này áp dụng để định tính thành phần tinh dầu trong dược liệu

Lấy 2 - 5g bột dược liệu, làm ẩm bằng amoniac đặc, để yên 30 phút, lắc siêu âm 30 phút với cloroform, lọc Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn Hòa cắn trong 1 ml ethanol được dung dịch chấm sắc ký

+ Chiết flavonoid và các acid phenolic: y Chiết dược liệu bằng methanol như trên sau đó cô dịch chiết methanol trên cách thủy đến cạn Hòa cắn trong 10 ml nước rồi lắc với 10 ml ethyl acetat Gạn lấy dịch chiết ethyl acetat, cô trên cách thủy đến cạn Hòa cắn thu được trong 1 - 2 ml ethanol 96% làm dung dịch chấm sắc ký y Lấy 1- 2 g bột dược liệu, thêm 20 ml nước, đun hồi lưu trên cách thủy khoảng 30 phút, lọc Lắc dịch lọc với 10 ml ethyl acetat Gạn lấy dịch chiết ethyl acetat, cô trên cách thủy đến cạn Hòa cắn thu được trong 1 - 2 ml ethanol 96% làm dung dịch chấm sắc ký, lượng chấm 10 - 30 àl

+ Chiết saponin: y Lấy 2 g bột dược liệu, thêm 20 ml ethanol 90%, đun sôi hồi lưu 10 phút hoặc lắc siêu âm 30 phút, lọc Cô dịch lọc trên cách thủy còn khoảng 2 ml được dung dịch chấm sắc ký, lượng chấm 20 - 40 àl y Lấy dịch lọc sau khi đã được chiết bằng ethanol như trên, cô trên cách thủy đến cạn Hòa cắn trong 10 ml nước rồi lắc với 10 ml n- butanol đã bão hòa nước Gạn lấy dịch chiết butanol, cô trên cách thủy đến cạn Hòa cắn thu được trong 1- 2 ml ethanol 90% được dung dịch chấm sắc ký, lượng chấm 20 - 40 àl

Dùng dịch chiết methanol như đã nêu ở phần trên Phương pháp được dùng để chiết dược liệu đại hoàng

+ Chiết các triterpen: y Dùng dịch chiết methanol như đã nêu ở phần trên Phương pháp này đã được dùng để chiết các triterpen trong rễ thăng ma

+ Chiết các lignan: y Chiết dược liệu bằng methanol, bốc hơi dịch chiết methanol trên cách thủy đến cạn Hòa cắn trong 1- 2 ml ethanol được dung dịch chấm sắc ký y Lấy 1- 3g bột dược liệu, thêm 20 ml cloroform, đun sôi hồi lưu trên cách thủy 1 giờ, để nguội, lọc Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn Hòa cắn trong 1- 2 ml ethanol tuyệt đối để chấm sắc ký

Phương pháp đã được áp dụng để chiết lignan trong chó đẻ răng cưa và diệp hạ châu đắng

+ Chiết các aglycon sau khi thủy phân: y Chiết bột dược liệu bằng methanol như trên Bốc hơi dịch chiết methanol trên cách thủy đến cạn Thêm vào cắn 15 ml dung dịch acid sulfuric (hoặc acid hydrocloric) 10%, đun sôi hồi lưu 30 - 2 giờ tùy bản chất từng loại glycosid, để nguội, lắc với 20 ml ether ethylic (hoặc cloroform) Gạn lấy dịch chiết ether, làm khan bằng natri sulfat khan, cô trên cách thủy đến cạn Hòa cắn trong 1 ml cloroform (hoặc ethanol tuyệt đối) được dung dịch phân tích sắc ký Phương pháp này được áp dụng để chiết acid oleanolic trong ngưu tất và các genin như emodin, chrysophanol… trong đại hoàng

Dược liệu được chiết bằng methanol như trên, cô bốc hơi dung môi Hòa cắn thu được trong khoảng 10 ml nước rồi lắc lần lượt với các dung môi từ kém phân cực (n-hexan, ether ethylic, cloroform) đến phân cực (ethyl acetat, butanol…) Gạn riêng các phần dịch chiết, bốc hơi dung môi, hòa từng phần cắn thu được trong ethanol hoặc methanol được dung dịch phân tích

Ngoài ra, trong đề tài này còn áp dụng một số phương pháp chiết khác sẽ được nêu cụ thể trong phần kết quả nghiên cứu

Dùng bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck) loại cho TLC thông thường và cho HPTLC được hoạt hóa ở 100 - 105°C trong 30 phút trước khi dùng

- L ự a ch ọ n dung môi độ ng

Thu thập, xác định tên khoa học mẫu dược liệu chuẩn

Tiến hành thu hái, xác định và kiểm chứng tên khoa học của các mẫu dược liệu nghiên cứu theo phương pháp đã ghi trong mục 3.3.2.1 Kết quả cụ thể về nơi thu hái và xác định tên khoa học của các mẫu dược liệu đã được ghi trong phụ lục 1

− 24/30 dược liệu thu hái được xác định có tên khoa học phù hợp với tên đã ghi trong DĐVN III

− 03 dược liệu được xác định có tên khoa học (loài) khác với tên ghi trong DĐVN III, đó là dành dành, kê huyết đằng và sa nhân

− 03 dược liệu thu hái đã được xác định tên khoa học chưa được ghi trong DĐVN III: cúc gai, cây cứt lợn và diệp hạ châu đắng, trong đó cúc gai đã được ghi trong USP 30 và CP 2005 Cả 3 dược liệu này hiện đang được dùng phổ biến.

Theo dõi,bảo quản và lưu giữ các mẫu dược liệu nghiên cứu 48

Các mẫu dược liệu sau khi được thu hái, xác định tên khoa học được lấy một phần để phân tích, phần còn lại được lưu mẫu, bảo quản và định kỳ theo dõi chất lượng của dược liệu về mặt cảm quan (màu sắc, mùi, vị, có hiện tượng ẩm mốc, mối mọt hay không) theo điều kiện đã nêu ở mục 3.3.2.3

Kết quả: Qua theo dõi chất lượng về mặt cảm quan cho thấy:

− Sau 3 tháng và 6 tháng, tất cả các dược liệu được bảo quản trong 2 lô có điều kiện bảo quản khác nhau đều không có biến đổi về cảm quan

− Sau 9 tháng, ở lô 1 (để trong bình thủy tinh nút mài có 4 dược liệu là Bạch truật, Đại hoàng, Cát sâm và Đương quy di thực đã có hiện tượng mọt; 26 dươc liệu còn lại ở lô 1 và tất cả các dược liệu ở lô 2 (để trong bình hút ẩm) đều không thay đổi về cảm quan

− Sau 12 tháng, ở lô 1, có 1 mẫu dược liệu Hương phụ bị mọt; 25 dược liệu khác của lô 1 và tất cả dược liệu ở lô 2 đều giữ nguyên về hình thức cảm quan

Từ kết quả theo dõi về mặt cảm quan, chúng tôi có nhận xét rằng:

− Ở điều kiện nhiệt độ 20 - 30°C, độ ẩm không quá 70%, tất cả các mẫu của 30 dược liệu nghiên cứu đều không thay đôi chất lượng về mặt cảm quan trong thời gian 6 tháng sau khi thu hái

− Với một số dược liệu có nhiều tinh bột như Bạch truật, Đại hoàng, Cát sâm, Đương quy và Hương phụ cần bảo quản trong bình kín có thêm chất hút ẩm

− Yếu tố độ ẩm ảnh hưởng nhiều đến chất lượng dược liệu Trong điều kiện nhiệt độ 20 - 30°C, độ ẩm tương đối càng thấp, về mặt cảm quan, chất lượng của các dược liệu nghiên cứu càng ít bị thay đổi.

Phân tích các đặc điểm vi học và thành phần hóa học của các dược liệu ………………………………………………… 49 1 Bạch thược 50 2 Bạch truật 59

Chiết tách, tinh chế emodin từ thân rễ đại hoàng

4.4.1.1 Chiết tách, tinh chế emodin

Qua tham khảo tài liệu [1,7] về tính chất của hợp chất anthraquinon và emodin và khảo sát một số phương pháp bằng thực nghiệm, đã lựa chọn được phương pháp chiết và tinh chế như sau:

− Dược liệu đại hoàng, sấy khô ở 60°C, tán thành bột mịn vừa

− Thêm MeOH, đun sôi hồi lưu 2 giờ, lọc lấy dịch chiết MeOH

− Cô dịch chiết MeOH trong chân không, thu cắn

− Thủy phân cắn bằng HCl 10% trong 2 giờ

− Chiết aglycon tự do bằng cloroform

− Cô dịch chiết cloroform trong chân không thu cắn

− Chiết cắn 3 lần bằng ether ethylic

− Gộp và cô dịch chiết ether trong chân không, thu cắn

− Hòa cắn trong ethanol tuyệt đối,

− Cô dịch chiết EtOH trong chân không thu cắn Quá trình này được tiến hành

− Hòa cắn trong một lượng vừa đủ EtOH, chuyển lên cột silica gel

− Rửa giải lần lượt với:

+ 200 ml hỗn hợp n- hexan - ethyl acetat (98:2)

+ 200 ml hỗn hợp n- hexan - ethyl acetat (95:5)

+ 200 ml hỗn hợp n- hexan - ethyl acetat (93:7)

+ 200 ml hỗn hợp n- hexan - ethyl acetat (90:10)

− Theo dõi thành phần các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng Điều kiện sắc ký

+ Bản mỏng Silicagel GF254 của Merck

+ Dung dịch thử: Hòa tan cắn trong ethanol tuyệt đối để được dung dịch có nồng độ khoảng 1 mg/ml

+ Dung dịch đối chiếu: Hòa tan emodin chuẩn Trong Quốc trong ethanol tuyệt đối để được dung dịch có nồng độ khoảng 1 mg/ml

+ Hệ dung môi khai triển:

Hệ 1: Toluen - ether dầu - ethyl acetat - acid formic - nước (3:1:1,5:0,1:0,5)

Hệ 2: Ether dầu - ethyl acetat - acid formic (75:25:1)

+ Phát hiện: Soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366nm hoặc hơ trong hơi amoniac

Kết quả cho thấy ở phân đoạn n-hexan - EA (90:10), sắc ký đồ cho 1 vết có màu và Rf trùng với vết emodin chuẩn

− Hứng lấy phân đoạn n-Hexan - EA (90:10), cô chân không, thu cắn emodin thô

− Tinh chế: Hòa cắn emodin thô trong aceton, thêm đồng lượng nước, để lạnh

− Hòa tủa trong EtOH, thêm đồng lượng nước, để lạnh 48 giờ được tủa emodin

− Sấy khô ở 50 - 60°C thu được emodin tinh khiết

Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế emodin được tóm tắt trong sơ đồ ở phụ lục 5

4.4.1.2 Xác đị nh c ấ u trúc emodin chi ế t đượ c

Kết quả xác định cấu trúc emodin được thể hiện trong phụ lục 7.2 Emodin tinh khiết sau khi làm khô được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ khối và cộng hưởng từ hạt nhân tại viện Hóa học cho kết quả như sau: a K ế t qu ả c ủ a ph ươ ng pháp MS

Phổ MS của chất khảo sát được ghi trên thiết bị 5989B-HP-MS bằng phương pháp đưa mẫu trực tiếp (DIP) Trên phổ thấy rõ pic phân tử đồng thời là pic cơ bản có giá trị M + (m/z) = 270 amu ứng đúng với công thức phân tử của Emodin là C15H10O5

Tra thư viện phổ Wiley 275.1 thấy được phổ của mẫu đo trùng với phổ emodin trong thư viện tới 93% và cấu trúc được ghi nhân theo danh pháp chuẩn là: 9,8-Anthracenedione-1,3,8-trihydroxy-6-methyl b K ế t qu ả c ủ a ph ươ ng pháp NMR

Bộ phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon một chiều (1D- 13 C-NMR) cho thấy phân tử mẫu khảo sát gồm 15 cacbon trong đó có 1 nhóm –CH3, 4 nhóm – CH- và 10 –C- Đây là một cấu trúc đơn giản nên các pic đều mang tính đặc trưng 2 pic ở 189,690 và 181,368ppm rất đặc trưng cho 2 nhóm –C=O 4 pic – CH- đều có độ dịch chuyển hóa học (107,910; 108,747; 120,453 và 124,109) đặc trưng cho –CH= nhân thơm Pic –CH3 có δ!,490ppm rất dễ nhận ra là –

CH3 gắn vào nhân thơm, 3 nhóm –C- có độ dịch chuyển 161,393; 164,425 và 165,543 là các cacbon bậc 4 của nhân thơm liên kết với –OH

Tóm lại phổ 1D- 13 C-NMR là hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của Emodin

Mẫu có phổ 1 H-NMR bao gồm 5 pic, 4 pic của –CH= nhân thơm đều là vach rộng hoặc tách vạch với giá trị J rất nhỏ (≈ 2Hz) chứng tỏ các nhóm –CH đều cách nhau 1 cacbon bậc 4

Phổ HSQC cho phép nhân dạng 2 pic –OH ở 10,072 và 12,000 ppm, đây là 2 – OH có khả năng lập cầu hydro với oxy của ceton

Nhóm OH còn lại bị trải rộng chi nhân ra được qua gờ nổi trên đường nền ở khoảng 11,4ppm Nhóm –CH3 là một vạch đơn ở δ=2.406ppm

Phổ HMBC có vai trò đặc biệt quan trọng cho phép phân biệt 1-OH (δ,072ppm) và 8-OH (δ,000ppm) Cũng nhờ phổ HMBC sự phân định vị trí –C=O (9) và –C=O (10) trở nên rõ ràng vì –C=O (10) có tương quan với – CH= (5) và –CH= (4) Qua phổ HMBC vị trí thế của 3 nhóm –OH và nhóm –

Qua bộ phổ NMR, mẫu nghiên cứu đã được khẳng định là Emodin và bảng số liệu chi tiết đã được xây dựng

Bộ phổ mô phỏng ACD-NMR được xây dựng với mục đích kiểm tra đã cho kết quả hoàn toàn phù hợp

Từ kết quả phân tích của các phổ trên, chất chiết được khẳng định là emodin với công thức cụ thể là:

Công thức cấu tạo của emodin

Tên khoa học: 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinon

Bộ phổ mô phỏng ACD-NMR được xây dựng với mục đích kiểm tra đã cho kết quả hoàn toàn phù hợp

4.4.1.3 Đị nh tính, th ử tinh khi ế t ch ấ t phân l ậ p đượ c b ằ ng các ph ươ ng pháp khác a Đ o nhi ệ t độ nóng ch ả y :

Chất phân lập được sấy khô ở 60°C đến khối lượng không đổi, để trong bình hút ẩm có silica gel trong 24 h, nghiền mịn rồi đem xác định nhiệt độ nóng chảy Kết quả điểm chảy đo được là khoảng 256 - 257°C, phù hợp với nhiệt độ nóng chảy của emodin theo lý thuyết là 256 - 257°C [72] b Đ o ph ổ h ồ ng ngo ạ i

Xác định phổ hồng ngoại của chất chiết được, song song xác định phổ hồng ngoại của emodin chuẩn Trung Quốc theo phụ lục 3.2, DĐVN III Kết quả

H 3 C phổ hồng ngoại của mẫu thử phù hợp với phổ hồng ngoại của emodin chuẩn (phụ lục 7.2) c.Ph ươ ng pháp s ắ c ký l ớ p m ỏ ng

Tiến hành phương pháp sắc ký lớp mỏng theo DĐVN III, phụ lục 4.4 với điều kiện sắc ký đã được ghi trong mục 4.4.1.1, đối chiếu với emodin chuẩn

Kết quả: trên sắc ký đồ ở cả 2 hệ dung môi, mẫu thử đều cho 1 vết có cùng màu sắc và Rf với vết của mẫu đối chiếu emodin d Ph ươ ng pháp s ắ c ký l ỏ ng hi ệ u n ă ng cao

Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao theo DĐVN III, phụ lục 4.3 với điều kiện sắc ký đã được ghi trong phần dự thảo tiêu chuẩn (phụ lục

9), đối chiếu với emodin chuẩn Trung Quốc

Kết quả: Sắc ký đồ của dung dịch thử cho pic có thời gian lưu tương ứng với pic emodin trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn emodin và tại thời gian lưu của pic emodin, phổ UV thu được của thử và của chuẩn trùng khớp nhau

4.4.1.4 Định lượng emodin chiết được bằng phương pháp HPLC

Tiến hành định lượng emodin phân lập được bằng phương pháp HPLC với điều kiện ghi trong dự thảo tiêu chuẩn (phụ lục 9)

Kết quả: Hàm lượng của emodin chiết được tính theo nguyên trạng là 95,0%

Nhận xét: Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng chất phân lập được là emodin với hàm lượng khá cao 95,0% (tính theo nguyên trạng), đạt yêu cầu của một chất chuẩn đối chiếu dùng trong phân tích dược liệu Phương pháp chiết khá đơn giản, sử dụng các dung môi rẻ tiền, ít độc, dễ kiếm Hiệu suất chiết thu được khá tốt (khoảng 0,5%), có thể ứng dụng trong quy mô lớn hơn Chất emodin đã phân lập được có thể dùng làm chuẩn để kiểm tra chất lượng đại hoàng và một số dược liệu khác chứa emodin.

Chiết tách và tinh chế hesperidin từ trần bì

Qua tham khảo một số tài liệu [7,50] về chiết, tinh chế hợp chất flavonoid, hesperidin và bằng nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi đã chọn được quy trình chiết hesperidin từ Trần bì gồm các bước sau:

− Loại tạp (tinh dầu và chất béo): Dược liệu được phơi khô, tán nhỏ, ngâm lạnh với ether dầu trong khoảng 4 giờ sau đó cho vào bộ dụng cụ chiết Soxhlet, chiết nóng trong 16 giờ Loại bỏ dịch chiết ether dầu Làm khô bã

− Chiết xuất: Thêm EtOH 70% vào dược liệu đã được loại tạp, đun sôi hồi lưu trong cách thủy, lọc lấy dịch chiết

− Cô dịch chiết EtOH trên cách thủy để bốc hơi bớt cồn, để nguội, cho vào tủ lạnh để ở nhiệt độ khoảng 5°C cho kết tinh

− Lọc qua phễu lọc xốp lấy tủa

− Hòa tủa trong MeOH nóng, lọc

− Cô dịch MeOH trên cách thủy đến gần cạn, thêm 2 thể tích ước, để ở 5 0 C cho kết tinh, lọc lấy cắn

− Tinh chế: Thêm EtOH 30% vào cắn, đun trên cách thủy cho tan, để nguội, cho vào tủ lạnh ở khoảng 5°C cho kết tinh

− Lọc qua phễu xốp lấy tinh thể

− Hòa tủa thu được trong formamid nóng, acid hóa bằng acid acetic, thêm nước để trong tủ lạnh cho kết tinh lại

− Lọc qua phễu lọc xốp được tinh thể hesperidin tinh khiết

− Sấy khô hesperidin ở 60°C trong 24 giờ

Trong quá trình phân lập và tinh chế, kiểm tra cắn thu được bằng TLC theo DĐVN III, phụ lục 4.4, điều kiện sắc ký như sau:

+ Dung dịch chuẩn: Hòa tan hesperidin chuẩn trong methanol để được dung dịch có nồng độ khoảng 0,4mg/ml

+Dung dịch thử: Hòa tan cắn trong methanol để được dung dịch có nồng độ khoảng 0,4 mg/ml

+ Bản mỏng Silicagel GF254 của Merck

+ Hệ dung môi khai triển:

Hệ 1: Ethyl acetat – methanol – nước (100:17:13)

Hệ 2: n-butanol – acid acetic – nước (4:1:5)

Hệ 3: Ethyl acetat – acid formic – acid acetic – nước (10:1:1:1)

+ Phát hiện: - Soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm

- Phun thuốc thử AlCl3 5% trong ethanol rồi soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366nm

Sau khi chiết và tinh chế như trên thu được tinh thể hesperidin màu trắng với hiệu suất chiết khoảng 1,2% so với dược liệu khô

Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế hesperidin được tóm tắt trong sơ đồ ở phụ lục 4

4.4.2.2 Xác định cấu trúc của chất chiết được

Kết quả phân tích cấu trúc của hesperidin được thể hiện trong phụ lục 7.1 a K ế t qu ả c ủ a ph ươ ng pháp s ắ c ký l ỏ ng kh ố i ph ổ (LC-MS)

Phổ ghi theo phương pháp -MS cho giá trị pic M-H = 609,3 và phổ ghi theo phương pháp +MS cho giá trị M+H = 610,9

Như vậy phân tử của mẫu có khối lượng là M = 610, tương ứng với công thức phân tử là C28H34O15, phù hợp với công thức phân tử của Hesperidin b K ế t qu ả c ủ a ph ươ ng pháp c ộ ng h ưở ng t ừ h ạ t nhân (NMR )

- Bộ phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon một chiều cho thấy phân tử mẫu khảo sát có chứa 28 cacbon bao gồm 2 nhóm –CH3, 2 nhóm –CH2–, 16 nhóm – CH– và 8 nhóm –C–

- Bộ phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon một chiều đã cung cấp một số thông tin cấu trúc rõ rệt:

+ Pic cacbon bậc 4 ở 197,003 ppm là rất đặc trưng cho cấu trúc ceton (=C=O)

+ Vùng cacbon bậc 4 gồm 6 pic có độ dịch chuyển hóa học từ 130 đến

165 ppm đặc trưng cho nhân thơm cùng với 3 pic CH ở vùng 112 đến 117ppm cũng đặc trưng cho nhân thơm cho thấy phân tử mẫu có chứa 2 nhân thơm Tập hợp 8 nhóm –CH- có độ dịch chuyển hóa học từ 68 đến 76ppm cùng với 2 pic – CH- ở 100,595 và 99,454ppm là dấu hiệu chắc chắn về sự tồn tại trong cấu trúc mẫu 2 phân tử đường Dấu hiệu trên cùng với sự tồn tại của pic –CH2-OH ở 66,028ppm và pic –CH3 ở 17,820ppm cho phép nhận ra 2 đường có trong cấu trúc gồm 1 phân tử đường glucose và 1 phân tử đường ramnose

Như vậy mọi dấu hiệu thể hiện ở bộ phổ 1D- 13 C-NMR đều phù hợp với cấu trúc của phân tử hesperidin gồm một khung flavon được thế bởi hai phân tử đường

+ Phổ 1 H-NMR và phổ HSQC:

Những đặc điểm của một khung flavon có sự thế của 2 phân tử đường cũng thể hiện rất rõ ở phổ 1 H-NMR Vùng pic từ -6,0 đến 7,0ppm là vòng của – CH- nhân thơm Các pic –CH- từ -3,1 đến -5,0ppm là pic –CH- của 2 phân tử đường Trong vùng này có sự chen lấn của pic –O-CH3 (δ = 3,773ppm), pic của một proton trong nhóm –CH2- của vòng B thuộc khung flavon và đặc biệt là nhiều nhóm –OH của đường Pic có cường độ rất lớn ở 3,3ppm là pic của dung môi DMSO Ở phổ 1 H-NMR cũng dễ nhận ra doublet ở 1,083ppm là pic của

Từ những kết quả của bộ phổ 13 C-1D-NMR và 1 H-NMR phối hợp với phổ HSQC có thể dễ dàng nhận ra các pic của 8 nhóm OH trong đó 2 pic đơn ở 12ppm và 9,076ppm là 2 nhóm OH thế ở nhân thơm, còn 6 pic OH còn lại đều là doublet OH của 2 phân tử đường

Như vậy kết quả phân tích bộ phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT 90, DEPT120 và HSQC đã cho những nhận xét sơ bộ về sự phù hợp của mẫu đo với cấu trúc của phân tử hesperidin

+ Phổ HMBC Để kiểm tra lại sự chính xác của việc quy kết độ dịch chuyển hóa học cho các vị trí trong cấu trúc phân tử, phổ HMBC đã được sử dụng Đặc biệt, với mẫu được khảo sát, phổ HMBC có vai trò rất quan trọng cho việc xác định vị trí liên kết của 2 phân tử đường, vị trí của từng nhóm OH trong tương quan với độ dịch chuyển hóa học, vị trí của nhóm thế -O-CH 3

Bằng kết quả phân tích phổ HMBC, liên kết phân tử (7-1) glucose (6- 1)ramnose, 4’-OCH3, 3’-OH, 5-OH đã được khẳng định

Từ kết quả phân tích của các phổ trên, chất chiết được khẳng định là hesperidin với công thức cụ thể là:

Công thức cấu tạo của hesperidin

Tên khoa học: (2S)-7-[[6-O-Deoxy-α-L-mannopyranosyl]-β-D- glucopyranosyl]oxy] - 2,3- dihydro- 5 -hydroxy-2- (3- hydroxy-4- methoxyphenyl)-4H -1 - benzopyran -4-one

Sự kiểm tra bằng phổ mô phỏng cho kết quả phù hợp

4.4.2.3 Định tính, thử tinh khiết chất phân lập được bằng các phương pháp khác a Đ o nhi ệ t độ nóng ch ả y

Chất phân lập được sấy khô ở 60°C đến khối lượng không đổi, để trong bình hút ẩm có silica gel trong 24 h, nghiền mịn rồi đem xác định nhiệt độ nóng chảy Kết quả điểm chảy đo được là khoảng 258°C, phù hợp với nhiệt độ nóng chảy của hesperidin theo lý thuyết là 258 - 262°C [72] b Đ o ph ổ h ồ ng ngo ạ i

Xác định phổ hồng ngoại của chất chiết được, song song xác định phổ hồng ngoại của hesperidin chuẩn Trung Quốc theo phụ lục 3.2, DĐVN III Kết quả phổ hồng ngoại của mẫu thử phù hợp với phổ hồng ngoại của hesperidin chuẩn (phụ lục 7.1) c Ph ươ ng pháp s ắ c ký l ớ p m ỏ ng

Tiến hành phương pháp sắc ký lớp mỏng theo DĐVN III, phụ lục 4.4 với điều kiện sắc ký đã được ghi trong mục 4.4.2.1, đối chiếu với chuẩn hesperidin

Kết quả: trên sắc ký đồ ở cả 3 hệ dung môi, mẫu thử đều cho 1 vết có cùng màu sắc và Rf với vết của mẫu đối chiếu hesperidin d Ph ươ ng pháp s ắ c ký l ỏ ng hi ệ u n ă ng cao (HPLC)

Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao theo DĐVN III, phụ lục 4.3 với điều kiện sắc ký đã được ghi trong phần dự thảo tiêu chuẩn (phụ lục

9), đối chiếu với chuẩn hesperidin

Kết quả: Sắc ký đồ của dung dịch thử cho 1 pic chính có thời gian lưu tương ứng với pic hesperidin trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hesperidin và tại thời gian lưu của pic hesperidin, phổ UV thu được của thử và của chuẩn trùng khớp nhau

4.4.2.4 Định lượng hesperidin chiết được bằng phương pháp HPLC

Tiến hành định lượng hesperidin phân lập được bằng phương pháp HPLC với điều kiện ghi trong dự thảo tiêu chuẩn (phụ lục 9)

Kết quả: Hàm lượng của hesperidin chiết được tính theo nguyên trạng là 95,0%

Chiết tách và tinh chế geniposid từ quả dành dành

Qua tham khảo một số tài liệu [1,25] về tính chất, cách chiết hợp chất iridoid glycosid cũng như tham khảo một số cách chiết genipin, aglycon của geniposid trong một số tài liệu [59,91] và bằng nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi đã chọn được quy trình chiết geniposid từ quả dành dành gồm các bước sau:

− Loại tạp (chất béo, nhựa, chất màu): Dược liệu được phơi khô, tán nhỏ Lấy

35 g bột dành dành, loại tạp bằng cloroform 3 lần, mỗi lần dùng 100 ml và lắc siêu âm 30 phút Gạn bỏ lớp cloroform Làm khô bột dược liệu trên cách thủy

− Chiết xuất: Thêm 100 ml MeOH vào bột dược liệu đã được loại tạp, lắc siêu âm 30 phút Lọc lấy dịch chiết MeOH Chiết bã như trên thêm 2 lần nữa Gộp dịch chiết MeOH

− Cô dịch chiết MeOH trên cách thủy đến vừa cạn

− Thêm vào cắn 200 ml nước, đun nóng trên cách thủy cho tan, thêm 8g than hoạt đun nóng tiếp trên cách thủy 20 phút, lọc để riêng than hoạt

− Lớp nước lọc được đun tiếp trên cách thủy lần 2 với 2 g than hoạt trong 20 phút để than hoạt hấp phụ hết geniposid còn lại, lọc lấy than hoạt

− Gộp than hoạt chứa geniposid của 2 lần trên

− Giải hấp phụ bằng cách khuấy với MeOH 3 lần, mỗi lần 60 ml, lọc

− Gộp dịch chiết MeOH, cô trên cách thủy đến cạn, thu được 1,2 g cắn

− Trộn đều 1,2 g cắn với 1 g silica gel (cỡ hạt 0,063 -0,2 mm), nghiền mịn

− Cho hỗn hợp bột vào cột sắc ký đă được chuẩn bị sẵn như đã nêu ở mục 3.4

− Rửa giải lần lượt với:

20 ml hỗn hợp dung môi CHCl3 - MeOH (95 : 5)

30 ml hỗn hợp dung môi CHCl3 - MeOH (90 : 10)

40 ml hỗn hợp dung môi CHCl3 - MeOH (80 : 20)

50 ml hỗn hợp dung môi CHCl3 - MeOH (70 : 30)

− Hứng riêng từng phân đoạn vào các ống nghiệm đã được đánh số thứ tự, mỗi ống 10 ml Kiểm tra thành phần mỗi ống bằng sắc ký lớp mỏng.3 Đ i ề u ki ệ n s ắ c ký

+ Dung dịch chuẩn: Hòa tan geniposid chuẩn Trung Quốc trong ethanol để được dung dịch có nồng độ khoảng 3mg/ml

+ Dung dịch thử: Hòa tan cắn trong ethanol để được dung dịch có nồng độ khoảng 3 mg/ml

+ Bản mỏng Silicagel GF254 của Merck

+ Hệ dung môi khai triển:

Hệ 1: Cloroform – methanol – nước - acid acetic (70:30:4:1)

Hệ 2: Ethyl acetat – aceton - acid formic - nước (5:5:1:1)

+ Thuốc thử phát hiện: Dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol, sấy ở 110°C cho đến khi hiện rõ vết

Gộp chung các ống nghiệm có thành phần giống nhau Những ống ở các phân đoạn 6,7 ứng với thành phần rửa giải là CHCl3 - MeOH (80:20) chỉ cho 1 vết có màu sắc và Rf giống geniposid chuẩn được gộp chung và để riêng Các ống ở phân đoạn khác có chứa geniposid nhưng lẫn các chất khác lại được tiếp tục cho tách tiếp với các cột silica gel mới cho đến khi thu được phân đoạn chỉ có 1 vết giống geniposid chuẩn

- Gộp các ống chứa dịch chiết chỉ có vết giống geniposid, cô trên cách thủy đến vừa cạn, thu được 1 g cắn geniposid thô

- Tinh chế: 1 g cắn, thêm 100 ml aceton vào 1 g cắn, đun nóng nhẹ cho tan, lọc nóng Cô dịch chiết aceton trên cách thủy còn khoảng 25 ml, để nguội rồi cho vào tủ lạnh để ở nhiệt độ khoảng 10°C trong 24 giờ cho kết tinh

- Lọc qua phễu xốp G3, lấy tủa, rửa bằng aceton, sấy ở 70°C trong 8 giờ, thu được 0,75g geniposid tinh khiết

K ế t qu ả : Sau khi chiết và tinh chế như trên thu được bột tinh thể geniposid màu trắng với hiệu suất chiết khoảng 2,14% so với dược liệu khô

Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế geniposid được tóm tắt trong sơ đồ ở phụ lục 6

4.4.3.2 Xác định cấu trúc của chất chiết được

Kết quả xác định cấu trúc của geniposid được thể hiện trong phụ lục 7.3 a K ế t qu ả c ủ a ph ươ ng pháp s ắ c ký l ỏ ng kh ố i ph ổ (LC-MS) Để xác định chính xác pic phân tử của mẫu này bằng thiết bị LC-MS, trong quá trình bắn phá mẫu bằng phương pháp ESI, tác nhân Na + đã được sử dụng Kết quả đã ghi được 1 phổ (phụ lục 7) chỉ chứa pic ion phân tử có giá trị [M+Na] + có m/z = 411amu Như vậy số khối m/z = 411 – 23 = 388 amu Do z 1 nên khối lượng phân tử của mẫu đo là M = 388 amu tương ứng với công thức phân tử là C17H24O10, phù hợp chính xác với công thức phân tử của Geniposide b K ế t qu ả c ủ a ph ươ ng pháp c ộ ng h ưở ng t ừ h ạ t nhân (NMR) + Phổ 13 C-NMR; DEPT-90; DEPT-135

Bộ phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon một chiều (1D- 13 C-NMR) cho thấy phân tử mẫu khảo sát gồm 17 cacbon trong đó có 1 nhóm –CH3, 3 nhóm –

CH2-, 10 nhóm –CH- và 3 nhóm –C- Đặc trưng nổi bật của hệ tín hiệu 13 C- NMR trong mẫu này là sự có mặt một phân tử đường 4 pic –CH- từ 69 đến 77ppm là pic của các –CH- trong vòng –CH- anomeric sẽ là 1 trong 2 pic –CH- có δ = 110,953 hoặc 98,621ppm Nhóm –CH2- ở δ`,999 ppm rất đặc trưng cho –Ch2-OH (6’) của đường Như vậy đây là phân tử đường glucose Trong 11 cacbon còn lại, nhóm –CH2- có δY,361ppm là –CH2-OH, -CH2- còn lại nằm trong khung phân tử Nhóm -CH3 duy nhất ở δQ,045ppm rất đặng trưng cho O-CH3 3 cacbon bậc 4 cũng rất dễ nhận dạng: -C- có δ = 166,941ppm đặc trưng cho cacbon acid, còn 2 pic còn lại (144,083ppm và 110,953ppm (hoặc 98,621ppm)) là những cacbon bậc 4 chứa nối đôi Hai pic –CH- ở 151,590 và 125,519ppm chắc chắn là của dạng –CH=

Như vậy, toàn bộ những đặc trưng nêu trên đều phù hợp với cấu trúc phân tử của Geniposide

Căn cứ vào cường độ pic được ghi trong phổ 1 H-NMR có thể nhận ra sự có mặt của toàn bộ 25 proton trong phân tử mẫu Pic có cường độ 3 đơn vị (3,365) duy nhất là của nhóm –OCH 3 Việc có mặt đủ trên phổ toàn bộ 25 prtoton chứng tỏ sự xuất hiện đầy đủ của 5 nhóm –OH Từ tương quan rút ra trong phổ HSQC xác định dễ dàng 5 pic –OH, với 3 vạch đôi của 3 nhóm –CH-

OH ở 5,035, 4,966 và 4,934ppm Hai nhóm OH vạch 3 còn lại ở 4,719 và 4,467ppm là của 2 nhóm –CH2-OH Các nhóm chứa hydro còn lại đều thể hiện rõ ràng mối tương quan C-H và nhờ đó chỉ định được đúng vị trí của các prôtn trong 3 nhóm –CH2- đều là các proton tương đương

Kết quả của bộ phổ 1 H-NMR và HSQC một lần nữa khẳng định mẫu khảo sát là phân tử geniposide

Phổ HMBC đã giúp cho việc xác định vị trí thế của đường, gốc acid, nhóm –CH 2 -OH ngoài đường và của nhóm –O-CH3 Kết quả phân tích phổ

HMBC cho thấy đường liên kết với khung phân tử ở vị trí 1’-1, -CH3 được gắn với oxy của gốc acid, gốc acid được thế vào khung phân tử ở vị trí 8

Qua kết quả phân tích các phổ NMR, các số liệu phổ chi tiết đã được xây dựng và được đưa ra là chính xác và hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của phân tử Geniposide (genipin-1-glucoside) sau đây:

Công thức cấu tạo của geniposid

Sự kiểm tra bằng phổ mô phỏng 1 H-NMR và 13 C-NMR cho kết quả phù hợp

4.4.3.3 Định tính, thử tinh khiết chất phân lập được bằng các phương pháp khác a Đ o nhi ệ t độ nóng ch ả y

Chất phân lập được sấy khô ở 60°C đến khối lượng không đổi, để trong bình hút ẩm có silica gel trong 24 h, nghiền mịn rồi đem xác định nhiệt độ nóng chảy Kết quả điểm chảy đo được là khoảng 164°C, phù hợp với nhiệt độ nóng chảy của geniposid theo lý thuyết là 163°C – 164°C b Đ o ph ổ h ồ ng ngo ạ i

Xác định phổ hồng ngoại của chất chiết được, song song xác định phổ hồng ngoại của geniposid chuẩn Trung Quốc theo phụ lục 3.2, DĐVN III Kết quả phổ hồng ngoại của mẫu thử phù hợp với phổ hồng ngoại của geniposid chuẩn (phụ lục 7) c Ph ươ ng pháp s ắ c ký l ớ p m ỏ ng

Tiến hành phương pháp sắc ký lớp mỏng theo DĐVN III, phụ lục 4.4 với điều kiện sắc ký đã được ghi trong mục 4.4.3.1, đối chiếu với chuẩn geniposid

Kết quả: trên sắc ký đồ ở cả 2 hệ dung môi, mẫu thử đều cho 1 vết có cùng màu sắc và Rf với vết của mẫu đối chiếu geniposid d Ph ươ ng pháp s ắ c ký l ỏ ng hi ệ u n ă ng cao

Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao theo DĐVN III, phụ lục 4.3 với điều kiện sắc ký đã được ghi trong phần dự thảo tiêu chuẩn (phụ lục

9), đối chiếu với chuẩn geniposid