Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ===***=== LÊ THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ACID CHLOROGENIC TỪ KIM NGÂN HOA PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG THUỐC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Chuyên ngành : Kiểm nghiệm thuốc - độc chất Mã số : 60 73 15 Người hướng dẫn khoa học: TS Đoàn Cao Sơn TS Trần Hồng Anh HÀ NỘI - 2010 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc xin chân thành cảm ơn TS Đoàn Cao Sơn TS Trần Hồng Anh, người thầy tận tình, trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: TS Trần Việt Hùng – Khoa Vật lý đo lường, ThS Lục Thị Vân – Khoa Kiểm nghiệm dạng bào chế, ThS Nguyễn Tuấn Anh – Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương, nhiệt tình quan tâm, giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng quản lý sau Đại học, thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà nội, bạn đồng nghiệp khoa Kiểm nghiệm dạng bào chế, khoa Kiểm nghiệm Đông dược, khoa Vật lý đo lường - Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương, cán Trung tâm Dược điển Dược thư Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi, động viên, giúp đỡ, san sẻ cơng việc góp ý kiến cho tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình bạn bè động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập trình thực luận văn Ds LÊ THỊ THU HIỀN MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TRONG LUẬN VĂN ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………… CHƯƠNG - TỔNG QUAN…………………………………………… 1.1 Chất chuẩn sử dụng chất chuẩn 1.1.1 Chất chuẩn đối chiếu hóa học 1.1.2 Các thông tin chuẩn acid chlorogenic 1.2 Tổng quan acid chlorogenic dược liệu Kim ngân hoa 1.2.1 Tổng quan acid chlorogenic 1.2.2 Tổng quan dược liệu Kim ngân hoa 1.3 Một số qui trình phân lập tinh chế acid chlorogenic nghiên cứu…………………………………………………… 1.4 Phương pháp phân lập tinh chế sắc ký cột………… 1.4.1 Phương pháp sắc ký cột silica gel………………………………… 1.4.2 Sắc ký loại trừ theo kích cỡ ứng dụng tinh chế acid chlorogenic……………………………………………………………… 12 1.5 Phương pháp định tính, định lượng xác định cấu trúc phân tử………………………………………………………………………… 15 1.5.1 Định tính xác định độ tinh khiết điểm chảy – MP 15 1.5.2 Định tính phổ hồng ngoại - IR ……………………… 1.5.3.Định tính, định lượng hợp chất đặc trưng dược liệu, sản phẩm trình chiết xuất, phân lập tinh chế từ dược liệu 16 sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)……………………………… 16 1.5.4 Phương pháp xác định cấu trúc phân tử………………………… 21 CHƯƠNG – NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………… 24 2.1 Nguyên liệu………………………………………………………… 24 2.2 Phương tiện nghiên cứu…………………………………………… 24 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ…………………………………………… 24 2.2.2 Hố chất, dung mơi………………………………………… 25 2.3 Nội dung nghiên cứu………………………………………… 26 2.4 Phương pháp nghiên cứu…………………………………… 26 2.4.1 Kiểm nghiệm dược liệu Kim ngân hoa dùng để nghiên cứu…… 26 2.4.2 Phương pháp chiết xuất acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa……………………………………………………………………… 27 2.4.3 Phân lập tinh chế acid chlorogenic phương pháp sắc ký cột………………………………………………………………………… 27 2.4.4 Các phương pháp định tính, định lượng xác định cấu trúc acid chlorogenic……………………………………………… 27 CHƯƠNG - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ……………………… 31 3.1 Kiểm nghiệm dược liệu Kim ngân hoa…………………………… 31 3.1.1 Định tính dược liệu Kim ngân hoa……………………………… 31 3.1.2 Định tính, định lượng acid chlorogenic dược liệu Kim ngân hoa………………………………………………………………… 33 3.2 Chiết xuất acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa…… 35 3.2.1 Lựa chọn dung môi chiết phương pháp chiết………………… 35 3.2.2 Tiến hành chiết xuất……………………………………………… 35 3.2.3 Định tính acid chlorogenic cao đặc cắn C1 phương pháp TLC………………………………………………… 36 3.2.4 Định lượng acid chlorogenic cắn C1……………………… 38 3.3.Qui trình phân lập acid chlorogenic sắc ký cột silica gel ………………………………………………………………… 40 3.3.1 Kỹ thuật phân lập………………………………………………… 40 3.3.2 Kết phân lập acid chlorogenic sắc ký cột silica gel…… 41 3.4 Tinh chế acid chlorogenic sắc ký cột Sephadex …………… 45 3.4.1 Kỹ thuật tinh chế…………………………………………… 45 3.4.2 Kết tinh chế acid chlorogenic sắc ký cột Sephadex G15……………………………………………………………………… 46 3.4.3 Kết tinh chế acid chlorogenic sắc ký cột Sephadex G10………………………………………………………………… 49 3.5 Định tính, xác định cấu trúc, định lượng xác định tạp chất liên quan acid chlorogenic tinh chế được………………………… 53 3.5.1 Đặc điểm hình thái………………………………………………… 53 3.5.2 Đo nhiệt độ nóng chảy để định tính xác định độ tinh khiết… 53 3.5.3 Định tính acid chlorogenic phương pháp sắc ký lớp mỏng…………………………………………………………………… 54 3.5.4 Định tính acid chlorogenic phương pháp đo phổ hồng ngoại……………………………………………………………………… 55 3.5.5 Định tính acid chlorogenic tinh chế phương pháp HPLC …………………………………………………………………… 56 3.5.6 Xác định cấu trúc acid chlorogenic tinh chế được………… 58 3.5.7 Định lượng acid chlorogenic tinh chế phương pháp HPLC…………………………………………………………………… 62 3.5.8 Xác định tạp chất liên quan acid chlorogenic tinh chế 66 3.6 Thẩm định phương pháp HPLC sử dụng để định lượng acid chlorogenic tinh chế được……………………………………………… 68 3.6.1 Xác định tính đặc hiệu…………………………………………… 69 3.6.2 Khoảng tuyến tính……………………………………………… 70 3.6.3 Độ lặp lại………………………………………………………… 71 3.6.4 Độ đúng…………………………………………………………… 71 3.6.5 Xác định LOD…………………………………………………… 73 3.6.6 Xác định LOQ…………………………………………………… 74 3.7 Xây dựng tiêu chuẩn dự thảo cho chất chuẩn phòng thí nghiệm 74 3.8 Sử dụng acid chlorogenic tinh chế làm chất chuẩn PTN để định tính, định lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Kim ngân hoa………………………………………………………………… 77 3.8.1 Định tính acid chlorogenic dược liệu Kim ngân hoa …… 77 3.8.2 Định lượng acid chlorogenic dược liệu Kim ngân hoa…… 80 3.8.3 Xác định độ ẩm dược liệu………………………………………… 82 CHƯƠNG – BÀN LUẬN VỀ KẾT QUẢ…………………………… 83 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………… 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………… 88 PHỤ LỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN 13 C NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Cacbon – 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy H NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy H-1H COSY 2D-NMR H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two – Dimensional NMR DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ESI-MS Phổ khối lượng phun điện tử Electron Spray Ionization Mass Spectrometry HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence HSQC Heteronuclear Singular Quantum Coherence IR Infrared Phổ hồng ngoại TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng HPLC High performance liquid chromatography Sác ký lỏng hiệu cao HSPL Hệ số pha loãng MS Mass spectrum PA Pure analysis ISO International organization for standardization IEC International electrotechnical commision C Chuẩn T Thử C+T Chuẩn + Thử DĐVN III Dược điển Việt Nam III RSD Relative standard deviation SD Standard deviation TB Trung bình UV Ultraviolet VIS Visible DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Trang Bảng 1.1 Hàm lượng acid chlorogenic số loại Bảng 1.2 Hàm lượng acid chlorogenic phân bố số phận Kim ngân Bảng 1.3 Khả tách lọc số loại gel Sephadex 13 Bảng 3.4 Kết định lượng acid chlorogenic dược liệu Kim ngân hoa đem nghiên cứu 34 Bảng 3.5 Kết chiết xuất mẻ dược liệu 36 Bảng 3.6 Giá trị Rf màu sắc vết sắc ký cao đặc cắn C1 37 Bảng 3.7 Hàm lượng acid chlorogenic cắn C1 thu sau giai đoạn chiết xuất 38 Bảng 3.8 Khối lượng cắn Si thu sau giai đoạn phân lập cắn C1 qua cột silica gel 42 Bảng 3.9 Hàm lượng acid chlorogenic cắn Si thu sau giai đoạn phân lập cắn C1 qua cột silica gel 43 Bảng 3.10 Khối lượng cắn Se1 thu sau tinh chế cắn Si qua cột Sephadex G15 48 Bảng 3.11 Kết định lượng acid chlorogenic cắn Se1 thu sau giai đoạn tinh chế cắn Si qua cột Sephadex G15 49 Bảng 3.12 Khối lượng cắn Se2 thu sau tinh chế cắn Se1 qua cột Sephadex G10 51 Bảng 3.13 Kết đo nhiệt độ nóng chảy acid chlorogenic tinh chế 53 Bảng 3.14 Kết phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) sản phẩm tinh chế 60 Bảng 3.15 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký định lượng acid chlorogenic tinh chế 64 Bảng 3.16 Kết định lượng acid chlorogenic tinh chế theo chuẩn 65 Bảng 3.17 Kết định lượng acid chlorogenic tinh chế theo chuẩn 66 Bảng 3.18 Kết xác định hàm lượng tạp chất liên quan acid chlorogenic tinh chế 68 Bảng 3.19 Kết xác định khoảng tuyến tính 70 Bảng 3.20 Kết khảo sát độ lặp lại 71 Bảng 3.21 Kết xác định độ 72 Bảng 3.22 Kết xác định LOD cho phép định lượng 73 Bảng 3.23 Giá trị Rf màu sắc vết sắc ký dịch chiết dược liệu Kim ngân hoa 78 Bảng 3.24 Kết định lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Kim ngân hoa 82 75 - Bản mỏng Silica gel GF254 - Pha động: butylacetat – acid formic – nước ( 70 : 25 : 25, lớp trên) - Phát hiện: cách: + Soi đèn tử ngoại bước sóng 366 nm: vết acid chlorogenic phát huỳnh quang màu xanh + Bằng ánh sáng thường: vết acid chlorogenic có màu nâu vàng Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch thử: Pha dung dịch chuẩn dung dịch thử có nồng độ acid chlorogenic methanol 1mg/ ml Tiến hành: - Chấm riêng biệt 10µl dung dịch chuẩn dung dịch thử - Tiến hành SKLM theo qui định DĐVN III - Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khơ ngồi khơng khí Kết quả: Quan sát vết mỏng, dung dịch thử phải cho vết tương ứng với vết dung dịch chuẩn màu sắc Rf • Sắc ký lỏng hiệu cao Trong mục định lượng, dung dịch thử cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu pic acid chlorogenic dung dịch chuẩn Định lượng: Hàm lượng acid chlorogenic nguyên trạng phải không 95,0% Phương pháp HPLC Điều kiện sắc ký - Pha động: Acetonitril – dung dịch acid phosphoric 0,4% (13 : 87) - Cột: Phenomenex RP 18, ( 5µm, 5mm x 250 mm ) - Tốc độ dòng : 1ml/phút - Thể tích tiêm: 20µl - Nồng độ dung dịch tiêm sắc ký khoảng 0,02 mg/ml - Detector phát hiện: 327 nm - Dung môi pha mẫu: dung dịch methanol 50% 76 - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch thử - Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 25 mg chất chuẩn acid chlorogenic vào bình định mức dung tích 50ml Thêm khoảng 35ml dung dịch methanol 50%, hòa tan thêm dung dịch methanol 50% vừa đủ đến vạch, trộn Hút xác 2,0ml dung dịch vào bình định mức dung tích 50 ml pha lỗng dung dịch methanol 50% vừa đủ đến vạch, trộn Lọc qua màng lọc 0,45µm - Dung dịch thử: Cân xác khoảng 25 mg acid chlorogenic tinh chế vào bình định mức dung tích 50ml Thêm khoảng 35ml dung dịch methanol 50%, hòa tan thêm dung dịch methanol 50% vừa đủ đến vạch, trộn Hút xác 2,0ml dung dịch vào bình định mức dung tích 50 ml pha lỗng dung dịch methanol 50% vừa đủ đến vạch, trộn Lọc qua màng lọc 0,45µm Cơng thức tính kết quả: Ghi lại diện tích pic thu sắc ký đồ dung dịch chuẩn dung dịch thử, dựa vào hàm lượng acid chlorogenic chuẩn, tính hàm lượng acid chlorogenic có dung dịch thử theo công thức sau: ST x mC C% = - x CC SC x mT Trong đó: ST, SC : diện tích pic tương ứng dung dịch thử dung dịch chuẩn mT, mC : lượng cân tương ứng mẫu thử mẫu chuẩn (g) CC : hàm lượng (%) acid chlorogenic chuẩn Tạp chất liên quan: Hàm lượng tạp chất không 0,5% tổng tạp không 2,0% Phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký tương tự phần định lượng 77 Mẫu thử : pha dung dịch methanol 50% có nồng độ khoảng 0,1 mg/ml Tiêm mẫu trắng, sau tiêm mẫu thử, mẫu tiêm lần sau pha xong Thời gian phân tích mẫu gấp lần thời gian lưu pic Ghi lại thời gian lưu diện tích pic tất pic tạp xuất sắc ký đồ Tính hàm lượng (%) tạp chất dựa vào diện tích pic tạp tổng diện tích pic có dung dịch mẫu thử (trừ pic có mẫu trắng) Cơng thức tính: Stạp % tạp = -∑ Spic (mẫu thử) -∑ Spic (mẫu trắng) 3.8 Sử dụng acid chlorogenic tinh chế làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để định tính, định lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Kim ngân hoa 3.8.1 Định tính acid chlorogenic mẫu dược liệu Kim ngân hoa 3.8.1.1 Định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng Điều kiện sắc ký: - Bản mỏng Silica gel GF254 - Pha động: butylacetat – acid formic – nước ( 70 : 25 : 25, lớp trên) - Phát hiện: cách: + Soi đèn tử ngoại bước sóng 366 nm: vết acid chlorogenic phát huỳnh quang màu xanh + Bằng ánh sáng thường: vết acid chlorogenic có màu nâu vàng Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch thử: Pha dung dịch chuẩn dung dịch thử có nồng độ acid chlorogenic methanol 1mg/ ml Tiến hành: - Chấm riêng biệt 10µl dung dịch chuẩn dung dịch thử 78 - Tiến hành SKLM theo qui định DĐVN III - Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khơ ngồi khơng khí Kết quả: thể bảng 3.23 hình 3.27 Bảng 3.23 Giá trị Rf màu sắc vết sắc ký dịch chiết dược liệu Kim ngân hoa Màu sắc STT vết Dịch Rf 0,18 chiết Ánh sáng thường Ánh sáng UV 366 nm Vàng nâu Xanh sáng (acid chlorogenic) (acid chlorogenic) Vàng nâu Xanh sáng Kim 0,43 ngân 0,57 hoa 0,65 Vàng nâu Xanh nhạt có viền đỏ Chuẩn 0,18 Vàng nâu Xanh sáng (acid chlorogenic) (acid chlorogenic) Xanh nhạt Kết quả: - Dung dịch chuẩn lên vết phát huỳnh quang màu xanh ánh sáng tử ngoại 366 nm, có màu nâu ánh sáng thường, có Rf = 0,18 - Dung dịch thử lên nhiều vết, có vết tương ứng với vết acid chlorogenic chuẩn phát huỳnh quang màu xanh ánh sáng tử ngoại 366nm, có màu nâu vàng ánh sáng thường, có Rf = 0,18 79 T C a) Ánh sáng thường T C b) Ánh sáng tử ngoại 366nm Hình 3.27 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid chlorogenic dịch chiết dược liệu Kim ngân hoa 3.8.1.2 Định tính phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Tiến hành: Dựa vào kết phần định lượng mục 3.8.2 Định lượng acid chlorogenic dược liệu Kim ngân hoa Kết quả: Trên sắc ký đồ thu phần định lượng: dung dịch thử cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu pic acid chlorogenic chuẩn (hình 3.28) 80 Hình 3.28 Sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử - định lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Kim ngân hoa 3.8.2 Định lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Kim ngân hoa Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng để xác định hàm lượng hoạt chất acid chlorogenic dược liệu Kim ngân hoa Điều kiện sắc ký - Pha động: Acetonitril – dung dịch acid phosphoric 0,4% (13 : 87) - Cột: Phenomenex RP 18, ( 5µm, 5mm x 250 mm ) - Tốc độ dòng : 1ml/phút - Thể tích tiêm: 20µl - Nồng độ dung dịch tiêm sắc ký khoảng 0,02 mg/ml - Detector phát hiện: 327 nm - Dung môi pha mẫu: dung dịch methanol 50% - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch thử - Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 25 mg chất chuẩn acid chlorogenic vào bình định mức dung tích 50ml Thêm khoảng 35ml dung dịch methanol 50%, hòa tan thêm dung dịch methanol 50% vừa đủ đến vạch, trộn Hút xác 2,0ml dung dịch vào bình định mức dung tích 50 ml pha loãng 81 dung dịch methanol 50% vừa đủ đến vạch, trộn Lọc qua màng lọc 0,45µm Dung dịch thử (DL): Cân xác khoảng 0,5g bột dược liệu nghiền mịn vào bình định mức dung tích 50ml Thêm khoảng 35ml dung dịch methanol 50%, lắc siêu âm 30 phút để hòa tan thêm dung dịch methanol 50% vừa đủ đến vạch, trộn Lọc qua giấy lọc bỏ dịch lọc đầu Hút xác 5,0ml dịch lọc vào bình định mức dung tích 50ml pha loãng dung dịch methanol 50% vừa đủ đến vạch, trộn Lọc qua màng lọc 0,45µm Tiến hành định lượng: Tiêm đồng thể tích dung dịch chuẩn dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, tiến hành sắc ký ghi lại sắc ký đồ Dựa vào diện tích chiều cao pic chlorogenic sắc ký đồ dung dịch chuẩn dung dịch thử, hàm lượng chất chuẩn, tính hàm lượng (%) acid chlorogenic bột dược liệu Công thức tính kết quả: ST x KT x mC x 100 C% = x CC SC x KC x mT x (100 – a) Trong đó: ST, SC : diện tích pic tương ứng dung dịch thử dung dịch chuẩn mT, mC : lượng cân tương ứng mẫu thử mẫu chuẩn (g) KT, KC : HSPL dung dịch thử dung dịch chuẩn : hàm lượng (%) acid chlorogenic chuẩn CC a : độ ẩm (%) dược liệu Kim ngân hoa (a = 8,58) 82 Bảng 3.24 Kết định lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Kim ngân hoa Dung dịch Lượng cân Thời gian lưu Diện tích pic Hàm lượng acid (g) (phút) (mAu) chlorogenic (%) Chuẩn 0,0259 6,725 8271,70 Thử 0,4795 6,686 3724,15 1,05 Thử 0,4702 6,665 3765,65 1,08 Thử 0,4670 6,740 3799,14 1,10 Thử 0,4798 6,743 3801,10 1,07 Thử 0,4787 6,741 3859,43 1,09 Thử 0,4903 6,701 3796,36 1,04 Trung bình 1,08 SD 0,02 RSD 2,00 Nhận xét: Hàm lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Kim ngân hoa xác định 1,08 ± 0,02 (%), tính theo dược liệu khô Các thông số thống kê cho thấy phương pháp định lượng có độ xác cao (RSD = 2,00%) 3.8.3 Xác định độ ẩm dược liệu Tiến hành: Thử theo DĐVNIII - Cân xác khoảng 1g bột dược liệu, sấy 85oC Kết quả: Lần 1: 8,52% Lần 2: 8,65% Lần 3: 8,58% Trung bình: 8,58% 83 CHƯƠNG BÀN LUẬN VỀ KẾT QUẢ Về nghiên cứu chiết xuất, phân lập tinh chế acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa (Flos Lonicerae Japonicae) Một qui trình chiết xuất nhóm chất có chứa acid chlorogenic xác lập, sử dụng dung môi chiết dung dịch ethanol 50%, không độc hại Phương pháp chiết ngâm lạnh đơn giản, tiết kiệm, có khả chiết lượng dược liệu lớn, đồng thời tránh nấm mốc trình chiết xuất [18], [26], [3], [13], [15] Qui trình loại tạp chất cao đặc Kim ngân hoa nghiên cứu ứng dụng làm giàu thành phần hoạt chất acid chlorogenic cao đặc Kim ngân hoa Dung môi dùng để loại tạp cao đặc dung mơi rẻ tiền, dễ kiếm độc hại Cắn thu sau giai đoạn chiết loại tạp có hàm lượng acid chlorogenic 19,66 ± 0,27(%) Với qui trình phân lập hoạt chất acid chlorogenic sắc ký cột silica gel đơn giản, dễ thực hiện, thu sản phẩm có chứa 74,36 ± 0,64 (%) acid chlorogenic Từ sản phẩm trình phân lập, qui trình tinh chế sắc ký cột xây dựng với chất nhồi cột Sephadex G15 Sephadex G10, loại sắc ký lọc gel, phân tách chất dựa nguyên tắc rây phân tử, chất có trọng lượng phân tử lớn tách trước, chất có trọng lượng phân tử nhỏ bị lưu giữ lại sau Qui trình tinh chế đơn giản, dễ thực hiện, bước tiến hành nhanh chóng, với dung mơi sử dụng nước không độc hại Mặc dù giá thành Sephadex cao đặc điểm quan trọng lưới rây phân tử Sephadex tái sử dụng nhiều lần mà khơng có biến đổi gì, chí sau 100 lần chạy [18] Qui trình tinh chế đưa hàm lượng hoạt chất lên đến 98,34 ± 0,66 (%) hiệu suất tinh chế đạt 55,72(%) Như vậy, qui trình chiết xuất, phân lập tinh chế acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa mà đưa cho hiệu suất ổn định, dung môi sử 84 dụng quy trình dung mơi sẵn có, rẻ tiền khơng độc hại Với khối lượng dược liệu đem chiết xuất 3,9878 kg, thu khối lượng sản phẩm acid chlorogenic 2266,7 mg, cho hiệu suất trình chiết xuất tinh chế 568,41 mg acid chlorogenic / kg dược liệu Về kiểm tra chất lượng sản phẩm acid chlorogenic tinh chế Acid chlorogenic tinh chế được định tính, kiểm tra độ tinh khiết, định lượng xác minh cấu trúc, đáp ứng yêu cầu chất chuẩn phòng thí nghiệm, sử dụng làm chất chuẩn để kiểm tra chất lượng thuốc dược liệu dùng làm thuốc Về xây dựng thẩm định phương pháp định lượng xác định tạp chất liên quan: phương pháp HPLC với detector UV mà xây dựng để định tính, định lượng acid chlorogenic tinh chế xác định tạp chất liên quan acid chlorogenic tinh chế được, xác định xác hàm lượng acid chlorogenic tinh chế 98,34 ± 0,66 (%) với RSD = 0,67% tổng lượng tạp chất liên quan 0,7(%) Đây phương pháp HPLC tiến hành đơn giản, từ việc pha mẫu, chuẩn bị dung môi pha động đến tiến hành sắc ký Qua thẩm định phương pháp mặt : Tính đặc hiệu, giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại cho thấy phương pháp xây dựng có độ xác cao Trong khoảng nồng độ khảo sát, diện tích pic nồng acid chlorogenic có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ Phương pháp đảm bảo độ độ đặc hiệu cao Sử dụng acid chlorogenic tinh chế đáp ứng yêu cầu chất lượng để thiết lập chất chuẩn đối chiếu để định tính định lượng acid chlorogenic dược liệu Chúng sử dụng acid chlorogenic để định tính, định lượng mẫu dược liệu Kim ngân hoa mua thị trường Kết mẫu dược liệu Kim ngân hoa đem kiểm nghiệm có chứa acid chlorogenic với hàm lượng 1,08 ± 0,02 (%) 85 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Qua thời gian nghiên cứu đề tài, sở tham khảo tài liệu liên quan đến việc chiết xuất, phân lập tinh chế acid chlorogenic, tài liệu có liên quan đến việc kiểm tra chất lượng dược liệu Kim ngân hoa hoạt chất acid chlorogenic, triển khai thực nghiệm đạt mục tiêu sau: Đưa qui trình chiết xuất, phân lập tinh chế acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa Đã định tính acid chlorogenic tinh chế Đã tiến hành xác định cấu trúc acid chlorogenic tinh chế phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân phương pháp phân tích khối phổ Kết thực nghiệm khẳng định công thức phân tử cấu trúc acid chlorogenic tinh chế phù hợp với lý thuyết Đã xây dựng phương pháp HPLC với detector UV để định tính, định lượng acid chlorogenic tinh chế xác định hàm lượng tạp chất liên quan acid chlorogenic tinh chế Đã tiến hành thẩm định phương pháp HPLC với detector UV để định lượng acid chlorogenic tinh chế tiêu chuẩn sau: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Kết phương pháp có độ lặp lại tốt, độ độ đặc hiệu cao Trong khoảng nồng độ khảo sát, diện tích pic nồng acid chlorogenic có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ Đã đưa tiêu chuẩn dự thảo sơ cho chất chuẩn phòng thí nghiệm acid chlorogenic Đã sử dụng acid chlorogenic tinh chế làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để định tính, định lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Kim ngân hoa mua thị trường 86 Như vậy, acid chlorogenic mà tinh chế giải vấn đề thiếu chất chuẩn kiểm tra, đánh giá chất lượng loại dược liệu chế phẩm có chứa acid chlorogenic Kết chúng tơi thu góp phần vào việc thực mục tiêu đề tài KC10: “Nghiên cứu chiết tách, tinh chế số hợp chất tự nhiên đặc trưng từ dược liệu để làm chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược liệu” KIẾN NGHỊ Áp dụng nâng cấp qui trình chiết xuất, phân lập tinh chế acid chlorogenic qui mô lớn Tiếp tục nghiên cứu hàm lượng tạp chất acid chlorogenic nhiều lô mẻ sản phẩm tinh chế khác nhau, từ xác định giới hạn hàm lượng tạp chất acid chlorogenic dùng làm chất chuẩn phòng thí nghiệm Sản phẩm acid chlorogenic tinh chế cần đánh giá theo qui trình thiết lập chất chuẩn chất đối chiếu Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương: tiến hành bước nghiên cứu để xây dựng protocol, sản xuất, đóng gói, đánh giá độ đồng nhất, kiểm tra chất lượng liên phòng thí nghiệm, xử lý thống kê kết thu tiến tới thiết lập chất chuẩn phòng thí nghiệm 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Trần Tử An (2002), Phương pháp chiết ứng dụng kiểm nghiệm thuốc độc chất, Tài liệu sau đại học, Trường đại học dược Hà Nội, tr 85-96 Trần Mạnh Bình (2003), Phân tích cấu trúc hợp chất hữu cơ, Tài liệu sau Đại học, Trường Đại học Dược Hà nội, tr 15-25 Bộ môn Dược liệu (1998), Bài giảng Dược liệu, tập 1, Trường Đại học Dược Hà nội, tr 304-309 Bộ mơn Hố phân tích (2006), Hố phân tích II, Trường Đại học Dược Hà nội, tr 189-203 Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất Y học, tr 394 - 395 Bộ Y tế, Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr 107-113, tr 216 Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, tr Nguyễn Văn Đàn, Ngô Ngọc Khuyến (1999), Hợp chất thiên nhiên dùng làm thuốc, Nhà xuất Y học, tr 33-35 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học thuốc, Nhà xuất Y học, tr 45-62 10 Đỗ Tất Lợi (1991), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, tr 91-94 11 Nguyễn Viết Thân (2007), Những thuốc vị thuốc thường dùng, Nhà xuất Y học, tr 368 - 372 12 Đỗ Thị Thanh Thuỷ (2008), Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn Emodin từ Đại hồng phục vụ cơng tác kiểm tra chất lượng thuốc, Luận văn Thạc sĩ dược học 13 Nguyễn Đình Triệu (1999), Các phương pháp vật lý ứng dụng hóa học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 88 14 Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt nam, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, tập 2, tr 106 – 110 15 Vụ Y tế, Vụ khoa học đào tạo (2006), Dược học cổ truyền, Nhà xuất Y học, tr 236-237 Tài liệu tiếng nước 16 Bin Zhang, Ruiyuan Yang, Yan Zhao, Chun-Zhao Liu, Journal of Chromatography B, “Separation of chlorogenic acid from honeysuckle crude extracts by macroporous resin”, http://www.elsevier.com/locate/chromb 17 British Pharmacopoeia 2007, Artichoke leaf 18 Clifford, M N (2003), “Method in polyphenol analysis – The analysis characterization of chlorogenic acid and other cinnamates”, Cambridge: Royal Society of Chemistry, pp 314 – 337 19 Clifford, M N (1999), “Chlorogenic acids and other cinnamates – nature, occurrence and dietary burden”, Journal of the Science of Food and Agriculture 79, pp 362 – 372 20 http://www.Caymanchem.com 21 http://www.en.wikipedia.org/wiki/chlorogenic 22.http://chemgroups.northwestern.edu/ohalloran/groupponly/pharmaciagelfiltrat ion.pdf 23 http:/www.library4science.com.eula.html 24 Kopsch et al - 10 /10/1989, ”Process for separating and producing chlorogenic acid”, United States Patent 25 Li-Yan Peng, Shuang-Xi Mei, Bei Jiang, Hong Zhou, Han-Dong Sun (2000), “Constituents from Lonicera japonica”, Fitoterapia 71, pp 713-715 26 Lie - Chwen Lin, Yuh – Chi Kuo, and Cheng – Jen Chou, Journal of natural products, “Immunomodulatory Principles of Dichrocephalabicolor” 27 Laurence Mondolot, Philippe la Fisca, Bruno Buatois, Emeline Talansier, Alexandre de Kochko, Claudine Campa, Laboratoire de Botanique, Phytochimie 89 et Mycologie, UMR 5175 CEFE- CNRS, Faculte’ de Pharmacie, Mondolot et al, “Caffeoylquinic Acid in Coffea canephora Leaves” 28 Michael Sefkow, Full paper, “First Efficient Synthesis of Chlorogenic acid” 29 Pharmacopoeia of the people’ s republic of China (2005), volume 1, page 62 30 Stephanie V E Prigent, Harry Gruppen, Antonie J W G Visser, Gerrit A van Koningsveld, Govardus A H De Jong, and Alfons G J Voragen, Copyright 2003 American Chemical Society, “Effects of Non-covalent Interactions with chlorogenic acid on the Heat denaturation and solubility of Globular Proteins” 31 Tricoit et al, US 2004/0067289 A1, “preparation and use of potato chlorogenic acid”, United States Patent 32 Taichi Ohmoto and Kyoko Yamaguchi, (1988), Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 36(2), pp 807-809 33 WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements-Part 2: Validation, World Health Organization, Geneva 34 Xueguang SHAO and Yadong ZHUANG, Department of Chemistry, University of Science and Technology of China, Hefei, Anhui, 230026, “Determination of Chlorogenic Acid in Plant Sample by Using Near-Infrared Spectrum with Wavelet Transform Preprocessing”, People’ s Republic of China ... xuất acid chlorogenic Do chúng tơi tiến hành nghiên cứu thêm tài liệu có liên quan tới Kim ngân hoa 6 1.2.2.Tổng quan dược liệu Kim ngân hoa Cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.) Kim ngân hoa. .. hàm lượng acid chlorogenic đáng ý phân bố phận bảng 1.2 [3] Theo nghiên cứu từ trước nghiên cứu gần đây, acid chlorogenic hợp chất giàu hoạt tính sinh học có hoa Kim ngân [26] Bảng 1.2 Hàm lượng. .. chế acid chlorogenic đạt tiêu chuẩn làm chất đối chiếu kiểm nghiệm thuốc dược liệu 2 Nội dung nghiên cứu cụ thể đề tài: • Nghiên cứu quy trình chiết xuất, phân lập tinh chế acid chlorogenic từ