Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn geniposid từ quả dành dành (fructus gardenia) phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc

Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HỘI   ỄN VIỆT H NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GENIPOSID TỪ QUẢ DÀNH DÀNH (Fructus Gardenia) PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG THUỐC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC ỘI   Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HỘI   ỄN VIỆT H NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GENIPOSID TỪ QUẢ DÀNH DÀNH (Fructus Gardenia) PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG THUỐC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC  ểm nghiệm thuốc – độc chất ố  Người hướng dẫn khoa học: ễn Văn Tựu ễn Tuấn Anh ỘI –  – – – – – – ỤC LỤC  ỜI CẢM ƠN ỤC LỤC ỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ỤC CÁC BẢNG ỤC CÁC HẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ  CHƯƠNG I TỔNG QUAN          ề chất đối chiếu (chất chuẩn) ổng quan dược liệu D 1.2.1 Đặc điểm thực vật vố ộ phận d ụng ổng quan nhóm hoạt chất   1.4.1 Đặc điểm vất ụng dược lý Geniposid ổng quan chiết xuất, phân lập vế Geniposid ề chiết xuất dược liệu ề chiết xuất, phân lập ế Geniposid ổng quan số phương pháp hoá lử dụng nghi ứu đề t ắc ký lớp mỏng (SKLM) ắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 1.6.3 Đo nhiệt độ nóng chảy 1.6.4 Phương pháp đo phổ hồng nại (IR) 1.6.5 Phương pháp phân tích khối phổ (MS) ổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1.6.7 Phương pháp sắc ký cột                   CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG  VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  ệu   Phương tiện nghiứu  ết bị, dụng cụ  ất, dung môi   ội dung nghiứu   Phương pháp nghiên cứu  CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VẾT QUẢ   ạo lập chất chuẩn Geniposid từ vị dược liệu D  ết xuất, phân lập v ế Geniposid từ vị dược liệu  ết xuất Iridoid glycosid từ dược liệu D  ập Geniposid từ hỗn hợp Iridoid glycosid  ế  3.1.2 Định tính Geniposid ế  3.1.2.1 Định tính Geniposid tinh chế SKLM  3.1.2.2 Xác định nhiệt độ nóng chảy Geniposid tinh chế 3.1.2.3 Đo phổ hồng ngoại Geniposid tinh chế  3.1.3 Xác định cấu trúc chất chiết  ết phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC  ết phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân  ựng vẩm định quy trỹ thuật để định tính, định lượng Geniposid tinh chế xác định giới hạn tạp cất li ủa Geniposid tinh chế HPLC với detector UV ựa chọn phương pháp  ẩm định phương pháp HPLC đ ựa chọn để định lượng  ợp hệ thống sắc ký  3.2.2.2 Tính đặc hiệu phương pháp         3.2.2.3 Đường chuẩn vảng tuyến tính  3.2.2.4 Độ lặp lại  3.2.2.5 Độ  ới hạn phát (LOD) với hạn định lượng (LOQ)  3.2.3 Định tính Geniposid tinh chế phương pháp HPLC đựn 3.2.4 Định lượng Geniposid tinh chế phương pháp HPLC đựng 3.2.5 Xác định giới hạn tạp chất liủa Geniposid ế  ử dụng Geniposid tinh chế lất chuẩn ph ệm để định tính, định lượng Geniposid vị dược liệu  3.3.1 Định tính  3.3.1.1 Định tính Geniposid vị dược liệu Dằng phương pháp SKLM theo DĐVN III 3.3.1.2 Định tính Geniposid vị dược liệu Dằng phương pháp HPLC với detector UV 3.3.2 Định lượng Geniposid vị dược liệu Dằng phương pháp HPLC với detector UV       CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN      ề qui trết xuất, phân lập vế đựng v ấu trúc Geniposid tinh chế ề định tính, định lượng Geniposid tinh chế được, xác định giới ạn tạp chất liủa Geniposid tinh chế HPLC ề việc sử dụng Geniposid tinh chế lất chuẩn ph ệm để định tính, định lượng Geniposid vị dược liệu  ẾT LUẬN VẾN NGHỊ    ẾT LUẬN  ẾN NGHỊ  ỆU THAM KHẢO  Ụ LỤC ỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT        DĐVN III  ĐT                PĐ       ẩn ẩn + Thử :Điện di mao quả ết hợp khối phổ  :Dược điển Việt Nam III  :Định tính  ắc ký khí khối phổ        :Dược điển Nhật ắc ký lỏng khối phổ ới hạn phát ới hạn định lượng    :Phân đoạn  ắc ký lớp mỏng ử    ỤC CÁC ẢNG ảng ảng  ảng 3.1 ết khảo sát độ lặp lại lần chiết  ảng 3.2 ết xác định hàm lượng Geniposid (%) cắn  ảng 3.3 ết khảo sát lượng than hoạt dùng để hấp phụ  ảng 3.4 Lượng cắn thu sau giải hấp phụ MeOH  ảng 3.5  ảng 3.6 ết khảo sát độ lặp lại dạt để hấp ụ cắn ần hỗn hợp dung môi rửa giải trột phân lập ảng 3.7 ết định lượng Geniposid đập  ảng 3.8 ết khảo sát độ lặp lại phân lập Geniposid tr ột  ị R ắc vết sắc ký định tính Geniposid ế trệ dung môi I v   ảng 3.12 ố liệu cộng hưởng từ hạt nhân hợp chất Geniposid ết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký định lượng Geniposid tinh chế ết khảo sát khoảng tuyến tính Geniposid ảng 3.13 ết khảo sát độ lặp lại  ản ết khảo sát độ phương pháp ết giá trị chiều cao vện tích pic dẩn xác định LOD ết xác định hàm lượng tạp chất  ết định tính Geniposid vị dược liệu D ằng SKLM ết xác định tính thích hợp hệ thống sắc ký định lượng Geniposid vị dược liệu D ết xác định hàm lượng Geniposid (%) dược liệu   ảng 3.9 ảng 3.10 ảng 3.11 ảng 3.15 ảng 3.16 ảng 3.17 ảng 3.18 ảng 3.19         ỤC CÁC H Ẽ, ĐỒ THỊ  ẽ   ột số h ảnh vị dược liệu D   ấu trúc hoá học Geniposid   Sơ đồ chung chiết xuất số thần D    SKĐ dược liệu trước vại ạp với cloroform    SKĐ định tính Geniposid dịch chiết methanol   SKĐ định tính Geniposid cại nước lọc   SKĐ định tính Geniposid cắn   SKĐ định tính Geniposid phân đoạn trột g  –  SKĐ định tính Geniposid phân đoạn tr ột g  – ốc thử   SKĐ định tính Geniposid phân đoạn tr ột g  –    SKĐ định tính Geniposid phân đoạn trột g  – ốc thử   SKĐ định tính Geniposid phân đoạn tr ột 10 g  –    SKĐ định tính Geniposid phân đoạn tr ột 10 g  – ốc thử     Sơ đồ chiết xuất Geniposid từ dược liệu D ắc ký đồ định tính Geniposid trệ dung môi I  ắc ký đồ định tính Geniposid trệ dung mơi II   ức cấu tạo Genip   ắc ký đồ xác định độ đặc hiệu phương pháp   Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ (mcg/ml) vện ủa pic Geniposid      SKĐ xác định LOD   SKĐ định tính Geniposid tinh ế   ồng phổ pic Geniposid mẫu chuẩn v ẫu thử   ết xác định độ tinh khiết pic Geniposid dung ịch chuẩn vử SKĐ xác định tạp chất liủa Geniposid tinh chế  ắc ký đồ định tính Geniposid vị dược liệu D ằng SKLM  ết định tính Geniposid vị dược liệu D ằng phương pháp HPLC          ảng   ết định tính Geniposid vị dược liệu Dằng SKLM  ốử ắ ứ ự ế ị     ị ử        ị ẩ   ứ ự ế ị                    ắ ị ẩ Tím đậ   ị ử    ồ       đậ 1.2 Định tính Geniposid vị dược liệu D  ằng phương pháp ới detector UV ến hành phần định lượng Geniposid vị dược liệu D ục  ết ả: ắc ký đồ dung dịch thử có pic có thời gian lưu (t  tương tự thời gian lưu pic Geniposid trắc ký đồ dung dịch chuẩn (t    ồng phổ UV –  ủa pic Geniposid thu từ dung dịch chuẩn v ịch ử, kết hệ số similarity l ết thể h      ếả địị dượệằng phương   ịẩ   ịử  ồổ  – ủ ẩ  ử 2 Định lượng Geniposid vị dược liệu Dằng phương pháp ới detector UV ến hành theo phương pháp Dược điển Nhật 14: ịch chuẩn: Cân ảng 10,0 mg Geniposid tinh chế (h lượng % đ lằng P ờ) cho   định mức dung tích 100 ml Hằng methanol vừa đủ đến vạch, lắc Lấy xác 15,0 ml dung dịch tr    định mức ằng methanol vừa đủ thể tích, lắc đều, lọc qua m  ọc 0,45 m dung dịch chuẩn để tiắc ký ịch thử: Cân xác khoảng 0,500 g bột dược liệu Dành dành (đ ền mịn, rây qua rây có kích thước mắt rây 0,250 mm đ xác định độ ẩm) cho v ống thủy tinh hụ, nút kín, thắc đều, lắc ới tốc độ 2000 vịch chiết v  định mức dung tích 10 ết tương tự thâm lần nữa, gộp ịch chiết methanol 50% v  định mức trổ sung dung mơi vừa đủ thể tích  ắc Lấy xác 5,0 ml dung dịch tr  định mức dung tích 20 ằng methanol vừa đủ thể ắc đều, lọc qua mọc 0,45  dung dịch thử để tiắc ký * Điều kiện sắc ký:  ột sắc ký Inertsil     Detector UV bước sóng 239   Pha động: Acetonitril  nước (12 : 88) (v/v)  ốc độ d  ể tích ti   ệt độ phân tích: Nhiệt độ phệm ến h ần lượt dung dịch chuẩn vịch thử vệ thống sắc ký, ghi lại ện tích pic thu trắc ký đồ dung dich chuẩn pic tương ứng trắc ký đồ ủa dung dịch mẫu thử (pic có cời gian lưu với pic geniposid) ết quả: Hàm lượng Geniposid có dược liệu (tính theo khơ kiệt) tính theo ức sau:                   ức 3)  Trong đó:  ện tích pic geniposid tương ứng dung dịử vịch ẩn (mAu.s  ối lượng mẫu thử (  ồng độ dung dịch chuẩn Geniposid (mg/ml)  : Độ pha loủa mẫu thử  : Độ ẩm mẫu thử (%) ểm tra tính thích hợp hệ thống sắc ký: ẩn bị dung dịch Geniposid chuẩn có nồng độ xác khoảng 75  ần dung dịch nệ thống sắc ký lỏng hiệu cao tiến hắc ký theo điều kiện đọn trết thời gian lưu, diện tích pic, hệ số bất đối ủa pic Genố đĩa lý thuyết cột tách Kết xác định ợp ủa hệ thống sắc ký thể bảng  ảng   ết xác định tính thích hợp hệ thống sắc ký định lượng ị dược liệu D   ời gian lưu ệ ệ ố ất đố ố đĩa lý                                         ế  ận xét: ết khảo sát cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện tích pic   0,23% nhỏ ầu JP 14 ( ị khác RSD ủa thời gian lưu (0,58%), ệ số bất đối (1,034   tốt so với yầu ề HPLC Điều khẳng định hệ thống HPLC mử dụng l ợp để định tính, định lượng Geniposid Dới điều kiện sắc ký  ết định lượng ẩn bị mẫu thử để tiệ thống sắc ký Từ giá trị diện tích pic trung b ủa dung dịch chuẩn v  ị diện tích pic dung dịch thử tương ứng tính hàm lượng % Geniposid có vị dược liệu Dức  ết ể bảng  ảng 3.1 ết xác định hm lượng Geniposid (%) dược liệu D  ị Lượ ẩ ời gian lưu    ệ   Hàm lượ   ử      ử      ử      ử      ử      ử      Hàm lượ     ận xét:  Hàm lượng Geniposid mẫu dược liệu Dành dành đem định lượng l  h theo dược liệu khô kiệt đạt y ầu Dược điển Nhật 14 (Không   hương pháp định lượng có độ xác cao (RSD = 1,63%)  CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN ề  ết xuất, phân lập vế đựng v ấu ủa Geniposid tinh chế ết xuất: ần tồn hỗn hợp gồm ều chất có cấu trúc Iridoid glycosid ử dụng ợp lý để loại bớt ạp chất (chất mất béo) mất lượng hoạt chất cần chiết xuất có dược liệu Việc sử dụng methanol để ết xuất ợp v ản ẩm thu l ộ ỗn hợp Iridoid glycoside Geniposid chiếm  ập: ạt sử dụng tr  ập với mục đích hấp phụ hỗn hợp Iridoid glycosid đồng thời lưu giữ thần khác chất màu đ ết khỏi dược liệu Việc sử dụng cột Silica gel để phâ ập với thần dung ửải có độ phân cực tăng dần đ  Geniposỏi hỗn hợp  Đồng thời phương pháp phân lập nại hiệu suất chiết tốt với hàm lượng Geniposid cao (khoảng 93%) ế:    ế phương pháp ngâm lạnh aceton đ đưa , đ nâng cao hàm lượng  ừ 93% lên đến 98% ạng tinh thể ắng ằng kết thực nghiệm đ  đưa quy trết xuất, ập vế Geniposid từ Dợp ới quy mô phệể nâng cấp cao sản xuất chất chuẩn   ề xác minh cấu trúc Geniposid tinh chế ệc xác định phổ NMR vổ MS đẳng định công thức phân tử v ấu ủa Geniposid tinh chế phợp với lý thuyết Đồng thời kếả nũng  ần khẳng định chất tinh chế l, đ thu phổ Geniposid lộ phổ chất chuẩn ết hợp với phương pháp có độ tin cậy cao (đo nhiệt độ nóng chảy, phổ  ấy chất tinh chế Geniposid có độ tinh khiết  ề định tính, định lượng Geniposid tinh chế được, xác định giới hạn tạp ất liủa Geniposid tinh chế HPLC Phương pháp HPLC mà đưa phù hợp với điều kiện ph  ệ nướcất lới sở phệm có trang bị hệ thống ương pháp tiến h đơn giản từ việc pha mẫu, chuẩn bị dung môi pha động tới tiến hắc ký Các dụng cụ, hóa chất dung mơi dễ    ũng đ ến h ẩm định phương pháp mặt: độ đặc hiệu, ợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu, độ lặp lại cao đảm bảo độ Trong khoảng nồng độ khảo sát, có tương quan tuyến tặt chẽ nồng độ vện tích pic ới phương pháp HPLC đ xây dựng vẩm định này, đến hành định tính định lượng Geniposid tinh chế Chúng đ định hàm lượng Geniposid tinh chế l đạt yầu cột chất chuẩn đối ếu dược liệu Sản phẩm nể dất đối chiếu để kiểm tra ất lượng dược liệu chế phẩm có chứa Geniposid ề việc sử dụng Geniposid tinh chế lất chuẩn phệm để định tính, định lượng Geniposid vị dược liệu D ản phẩm đề tài đ sử dụng l ất chuẩn ph  ệm để định tính, định lượng Geniposid vị dược liệu D   DĐVN III dược điển Nhật 14 ằng phương pháp SKLM, HPLết ậy ết đề tài đ đóng góp cho nội dung nghiứu đề tấp ộ “Nghiên cứu phát triển liệu chuẩn số dược liệu thường dục  ụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu vốc đông dược”, đề t đ nghiệm thu thức theo bi ản số 420/BB –    đồng thời đ đăng tạp chí Kiểm nghiệm thuốc số 3/2009 (Viện Kiểm ệm Trung ương): “Nghiên cứu chiết xuất Geniposid từ dược liệu Chi tử d ẩn troểm tra chất lượng thuốc” ố 1/2009 “Phân tích thành phần ọc Đại ho ử, Chỉ thực vần bằng phương pháp sắc ký lỏng ệu cao” ết nghiứu nĩa thực tiễn công tác kiểm nghiệm thuốc ểm nghiệm dược liệu v ốc đông dược nói ri  ẾT LUẬN VẾN NGHỊ ẾT LUẬN  ời gian nghi ứu đề tài, đ  kết theo nội ứu sau:  Đ đưa qui trết xuất vế Geniposid từ vị dược liệu D , đ ến hành định tính Geniposid tinh chế đồng thời đ ến ấu trúc Geniposid tinh chế phương pháp ổ cộng hưởng từ hạt nhân phương pháp phân tích khối phổ Kết ực nghiệm đ ẳng định công ức phân tử cấu trúc ế lợp với lý thuyết  Đ ựa chọn v  ựng phương pháp HPLC để định tính, định lượng xác định tạp chất li  ủa Geniposid tinh chế Với phương pháp đ định hm lượng Geniposid tinh chế ới hạn tổng tạp chất liủa Geniposế l Chúng đ ến hẩm định phương pháp HPLC với detector UV để định lượng Geniposid với nội dung: tính xác, tính ến tính, tính đúng, tính đặc hiệu Phương pháp xây dựng có độ xác, độ độ đặc hiệu cao Trong khoảng nồng độ khảo sát, Geniposid có mối tương ến tính chặt chẽ nồng độ vện tích pic  Đử dụng Geniposid tinh chế lất chuẩn phệm để định tính, định lượng Geniposid vị dược liệu D  ết ẫu dược liệu D nh kiểm tra có chứa Geniposid với h  lượng đạt 6,58 % tính theo dược liệu khơ kiệt  ẾỊ Chúng đưa số kiến ị sau: ần có nghiứu thêm để sản xuất chất chuẩn Geniposid quy mô ớn đồng thời tiẩn hóa chất chuẩn Geniposid  Ứng dụng chuẩn Geniposid Dược điển Việt Nam vẩn sở để đánh giá chất lượng vị D ế phẩm có chứa D   ứu tạo lập Genipin từ Geniposid để lốc ếp tục nghiứu chiết xuất, phân lập   ừ dược ệu ẩn để đánh giá ất lượng dược liệu ục vụ công tác kiểất lượng thuốc đông dược  ỆU THAM KHẢO  ệu tiếng Việt:  ần Tử An (2002), Phương pháp chiết ứng dụng kiểm nghiệm ốc độc chấtệu sau đại học, Trường Đại học Dược Hội  Đỗ Huy Bích, ũ Ngọc Lộ, Phạm Kim ễn Thượng Dong c ộự (2003), ốc Động vật lốc Việt nam tập 1,  ất khoa học kỹ thuật, trang 599 –   ễn Kim Bích vộng (2006), Phân tích xác định đặc điểm ọc đặc trưng dược liệu phục vụ cơng tác tiẩn hóa, ện Dược liệu – ộ Y tế, trang 13 –   ần Mạnh B ấu trúc hợp chất hữu cơ ệu sau đại học, Trường Đại học Dược Hội  ộ môn Dược cổ truyền (2005), Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hội  ộ môn Dược liệu   ảng dược liệu tập 1, Trường Đại học Dược Hội    ộ môn        ập I ường Đại học Dược Hội  ộ môn   ường Đại học Dược ội  ộ Y tế (1994), ược điển Việt nam II, tập 3ất Y học  ộ Y ế (2002), Dược điển Việt nam IIIất Y học     ăn Chi (1997), ừ điển thuốc Việt nam,  ất Y ọc    ễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), ương pháp nghiên cứu ọc thuốcất Y học –   ễn Bá Hoạt  ững vấn đề đ vột số tồn sau ội nghị dược liệu to ốc lần thứ nhất  ệu Hội nghị dược liệu ốc lần thứ hai, Bộ Y tế, ất ọc vỹ thuật, tr  –   ạm Thanh Kỳ (1/2003), Chuyên đề dược liệu I ộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hội  Đỗ Tất Lợi (1999), ững thuốc vị thuốc Việt nam, ất ọc, trang     ỳnh Như (2001), Phương pháp phân tích sắc ký lỏng ệu cao (HPLC)ện kiểm nghiệm ốc Trung ương  ộ y tế  ễn Viết Thân, Hồ Trung Chiến, Hoàng Văn Dong  ” ứu đánh giá thực trạng chất lượng dược liệu t ị trường Việt Nam ện nay” ội nghị dược liệu toốc lần thứ hai ”Phát triển dược liệu đến năm 2015 v ầm nhìn 2020”ất  ọc vỹ thuậ   –   ễn Văn Tựu  ”Tình hình chất lượng dược liệu vốc đông dược  ững năm qua định hướng năm tới”, ội nghị dược liệu toốc lần thứ hai ”Phát triển dược liệu đến năm 2015 v ầm nhìn 2020”ất ọc vỹ thuật, tr  –   ện Dược liệu   ứu thuốc từ thảo dược  ất ọc vỹ thuật   –  –     ện Kiểm nghiệm ốc Trung ương  Đảm bảo chất lượng thuốc ột số phương pháp phân tích dụng cụ  ện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2006), ủ tục Thiết lập vệu ẩn chất chuẩn, ống chuẩn độ   Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng, Trần Thị Mỹ Linh, Phạm Hệt  Các phương pháp sắc ký ất ọc vỹ thuật ệu tiếng Anh:     “Genipin, a natural cross linking reagent”,               “Iridoid glycosides from Gardeniae Fructus for treatment of ankle sprain”,                    ”Preparative isolation and purification of        Chromatography”       “Hair dyeing by iridoid glycoside and aglycons thereof”,            “Colorimetric determination of amino acids using genipin from Gardenia jasminoides”,    –                    “Study on the Constituents                ”                                  “Isolation         e of Gardenia Jasminoides”,     Pharmacopoeia of the people’s republic of China          ”     Vietnamese Paederia scandens”,               “Identification and               itional Chinese medicines”,           “Isolation and purification of iridoid glycosides               column switch technology”,            “Gardenia herbal active constituents  separation procedures”,               ... H NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GENIPOSID TỪ QUẢ DÀNH DÀNH (Fructus Gardenia) PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG THUỐC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC  ểm nghiệm thuốc – độc chất. .. ảnh hưởng đến công tác ứu vểm tra chất lượng thuốc thảo dược, việc tạo lập chất ẩn lần thiết ột số chất chuẩn chưa thiết lập lột hoạt chất có vị dược... rong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu gặp nhiều khó khăn ếu chất chuẩn với vai trạt chất chất đặc trưng cho dược liệu Chất ẩn dùng cho dược liệu ện thường nhập từ