Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn geniposid từ quả dành dành (fructus gardenia) phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc

ử định tính, tạp chất và định lượng bằng phương pháp sắc ký.Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật... ử tinh khiết Dùng SKLM để kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất thể

Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Ộ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HỘI

       

ỄN VIỆT H

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GENIPOSID

TỪ QUẢ DÀNH DÀNH (Fructus Gardenia)

PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG THUỐC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

ỘI  

Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Ộ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HỘI

       

ỄN VIỆT H

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GENIPOSID

TỪ QUẢ DÀNH DÀNH (Fructus Gardenia)

PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

–

 ổng quan về chiết xuất, phân lập vế Geniposid 

ề chiết xuất, phân lập ế Geniposid 

 ổng quan của một số phương pháp hoá lử dụng trong nghi

ứu đề t



CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 ạo lập chất chuẩn Geniposid từ vị dược liệu D 

ết xuất, phân lập vế Geniposid từ vị dược liệu





ết xuất Iridoid glycosid từ dược liệu D 

ập Geniposid từ hỗn hợp các Iridoid glycosid 

3.1.2.3 Đo phổ hồng ngoại của Geniposid tinh chế được 

ết quả của phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC 

ết quả của phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân





 ựng vẩm định quy trỹ thuật để định tính, định

lượng Geniposid tinh chế được và xác định giới hạn tạp cất li

ủa Geniposid tinh chế được bằng HPLC với detector UV

3.2.2.3 Đường chuẩn vảng tuyến tính 

ới hạn phát hiện (LOD) với hạn định lượng (LOQ) 

3.2.3 Định tính Geniposid tinh chế được bằng phương pháp

 ử dụng Geniposid tinh chế được lất chuẩn ph

ệm để định tính, định lượng Geniposid trong vị dược liệu





3.3.1.1 Định tính Geniposid trong vị dược liệu Dằng

phương pháp SKLM theo DĐVN III



3.3.1.2 Định tính Geniposid trong vị dược liệu Dằng

phương pháp HPLC với detector UV



3.3.2 Định lượng Geniposid trong vị dược liệu Dằng

phương pháp HPLC với detector UV



 ề qui trết xuất, phân lập vế đựng v

ấu trúc của Geniposid tinh chế được



 ề định tính, định lượng Geniposid tinh chế được, xác định giới

ạn tạp chất liủa Geniposid tinh chế được bằng HPLC



 ề việc sử dụng Geniposid tinh chế được lất chuẩn ph

ệm để định tính, định lượng Geniposid trong vị dược liệu

ỤC CÁC ẢNG

ảng 3.2 ết quả xác định hàm lượng Geniposid (%) trong cắn 1 

ảng 3.3 ết quả khảo sát lượng than hoạt dùng để hấp phụ 

ảng 3.4 Lượng cắn thu được sau khi giải hấp phụ bằng MeOH 

ảng 3.5 ết quả khảo sát độ lặp lại khi dạt để hấp

ụ cắn 1



ảng 3.6 ần hỗn hợp dung môi rửa giải trột phân lập 

ảng 3.8 ết quả khảo sát độ lặp lại khi phân lập Geniposid trột

ảng 3.10 ố liệu cộng hưởng từ hạt nhân của hợp chất Geniposid 

ảng 3.11 ết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi

định lượng Geniposid tinh chế được



ảng 3.12 ết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Geniposid 

ảng 3.15 ết quả các giá trị chiều cao vện tích pic của dẩn

ảng 3.18 ết quả xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi

định lượng Geniposid trong vị dược liệu D



ảng 3.19 ết quả xác định hàm lượng Geniposid (%) trong dược liệu





ỤC CÁC H Ẽ, ĐỒ THỊ

 Sơ đồ chung chiết xuất một số thần chính trong D

 SKĐ định tính Geniposid trong dịch chiết methanol 

 Sơ đồ chiết xuất Geniposid từ dược liệu D 

 ắc ký đồ định tính Geniposid trệ dung môi I 

 ắc ký đồ định tính Geniposid trệ dung môi II 

 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (mcg/ml) vện

ủa pic Geniposid



 SKĐ xác định LOD 

 ồng phổ pic Geniposid của mẫu chuẩn vẫu thử 

 ết quả xác định độ tinh khiết của pic Geniposid trong dung

ĐẶT VẤN ĐỀ

 ững năm gần đây, việc sử dụng thuốc ừ dược liệu có xu hướng tăng trên phạm vi toầu Ở Mỹ, số đơn thuốc có sử dụng hoạt chất từ dược thảo

ếm 25% tổng số đơn thuốc pha chế tại cửa hàng, hàng năm Trung Quốc sử dụng

ảng 700.000 tấn dược liệu vản xuất khoảng 6.266 mặt h ị buôn bándược liệu ở Ấn Độ hàng năm đạt hơn 60 tỷ Rupi [1

ệt Nam lột trong những nước có nền y học dân tộc phát triển lâu đời, có

ền thống sử dụng các thuốc có nguồn gốc dược liệu ững năm gần đây

ệc sản xuất, kinh doanh các mặt h ốc có nguồn gốc từ dược liệu tăng l

 ừng Theo thống kủa Cục Quản lý Dược – ộ Y tế, tính đến tháng 5năm 2007, cả nước đơn 3000 mặt hốc có nguồn gốc dược liệu đ được

ộ Y tế cấp số đăng ký, chiếm gần 1/3 tổng số thuốc ản xuất trong nước đ được

ấp số đăng ký [1] Do đó nhu cầu về dược liệu rất lớn, hàng năm nước ta tiụ

ừ 30 ấn dược liệu các loại [] Dược liệu dốc được cung cấp

ừ nguồn thu hái ự nhiồng trọt vập khẩu Nồn gốc dược liệu phức tạp,

ố lượng lại lớn khó kiểm soát dẫn đến tạng dược liệu giả mạo,

ầm lẫn, kém chất lượng vẫn được tự do lưu thông trên thị trường gây ảnh hưởng

 ốt đến độ an to ệu lực v ất lượng của các chế phẩm từ dược ệu

rong khi đó công tác kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu gặp nhiều khó khăn

ếu chất chuẩn với vai trạt chất hoặc chất đặc trưng cho dược liệu Chất

ẩn dùng cho dược liệu ện nay thường được nhập từ Trung Quốc với giá thtương đối cao v ồn hàng thường không ổn định, ảnh hưởng đến công tác

ứu vểm tra chất lượng thuốc thảo dược, do đó việc tạo lập chất

ẩn lần thiết ột trong số những chất chuẩn hiện nay chúng ta chưa thiết lậpđược lột hoạt chất chính có trong vị dược liệu D 



ất phát từ nhu cầu thực tiễn  chúng tôi đực hiện đề tài : “Nghiên

ứu thiết lập chất chuẩn  ừ quả D   ục vụ

ểm tra chất lượng tốc” với các mục ti

 ết xuất vế  ừ dược liệu quả D

 Định tính và định lượng  ế được;

 Ứụng trong kiểm ất lượng dược liệu vốc Đông dược

Đề tột phần của đề t: “Nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn

ủa một số dược liệu thường dục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượngdược liệu vốc đông dược” của Khoa kiểm nghiệm Đông dược – Dược liệu –

ện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

ẦN I TỔNG 

ề chất đối chiếu (chất chuẩn):  

ất đối chiếu lất đồng nhất đ được xác định là đúng để d

ử đ được qui định về hoá học, vật lý, sinh học Trong các phép thử đó

  ất của chất đối chiếu được s  ới các tính chất của chất cần thử

ất đối chiếu phải có độ tinh khiết phợp với mục đích sử dụng Chất đối chiếuđược dử sau:

 Định tính bằng phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại

Định lượng bằng phương pháp quang ổ tử ngoại v ả kiến, quang

ổ huỳnh quang

ử định tính, tạp chất và định lượng bằng phương pháp sắc ký.Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật

ẩn độ thể tích, phân tích trọng lượng

ử sinh học

ột số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyận ri

ệu mập được, hiện nay vẫn chưa có nhiều nghi

ứu đi v ĩnh vực điều chế chất chuẩn, nhất l  ất chuẩn được chiết xuất,

ập từ dược liệu

ện tại 10 chất từ dược liệu đang được phân lập lất chuẩn quốc gia gồm:

       

  Phyllanthin, Silybin trong đề  ấp nhà nước, m ố

10 “Nghiên cứu chiết tách, tinh chế ột số hợp chất tự nhiên đặctrưng từ dược liệu để lất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược liệu”

ổng quan về dược liệu D

ị dược liệu Dọi lử) (tọc: Fructus Gardenia) l

ả chín phơi hay sấy khô của cây D  ọ C



1.2.1 Đặc điểm thực vật vố: 

* Đặc điểm thực vật:

ỏ, cao 1  ốt quanh năm, phân nhánh nhiều C

ẵn, có khía r ọc Lá mọc đối hay mọc v      

ốc thót lại, đầu tặc hơi nhọn, mặt trục sẫm đến nâu đen, nhẵn bóng,

ặt dưới rất nhạt vổi rống lá rất ngắn, lá kọn, bao quanh

ấy thân v

ọc đơn độc ở đầu cắng hoặc trắng nất thơm, cuống

ạnh, đồm 6 thọn, ống đọc, tr

 đầu, ống trẵn; nhị 6, chỉ nhị ngắn, bao phấn tầu 2 ô, noất nhiều

ả hứng, có đồn tại ở đỉnh vạnh lồi có cánh, khi chín 

ịt quả mạt dẹt, nhiều

  ả: tháng 8  

ố:

ảng 270 loế giới, phân bố rộng r ở v

ệt đới vận nhiệt đới châu Á v Ở Việt Nam có khoảng 21 l

ồn gốc ở Trung Quốc vật Bản Ở Việt Nam cây

ố phổ biến ở khắp các tỉnh đồng bằng và trung du nhưng tập trung tại các tỉnh

ải Dương, Hưng Yên, Thái B Định, Ninh Bệ An v

ĩnh Dành dành ưa ẩm, ưa sáng và có thể chịu bóng, thường mọc ở đất ẩm, gần

ồn nước như bờ ao, bờ kạch, hay bờ suối thụi lớn, đôi khi gốc ngập

ước Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, có khả năng tái sinh sau khi bị

ặt

ồn D ở Việt Nam tương đối phong phú Lượng dược liệu khaithác hàng năm từ 30  ấn

ừng nửa giờ, rồi mới lấy ra phơi khô Nếu bóc vỏ trước khi phơi sấy, ta được chi

ử nhân Quả h ứng hay h    4,5 cm, đường kính 1    ặtngoài màu vàng cam đến nâu đỏ, có khi xám nâu đến đỏ xám, hơi bóng, có 5  đường gờ chạy dọc theo quả Đầu quả c đài tồn tại Vỏ quả mỏng Nhiều hạt

ếp sít nhau thột khối hầu hay hứng Hạt mỏng hầu dẹt, mặtngoài màu vàng cam đến vử dụng, có thể phơi 

ống để thanh nhiệt, sao qua dùng chín để tả hỏa hoặc sao đen để cầm máu

ần hóa học: 

     , gardosid, shanzhisid,…)trong đó  ần chính

 ữu cơ (acid picrocrocinic,…)

 ắc tố :    

ưởng của cây, sự h được phânchia thành hai giai đoạn:

 Giai đoạn 1 (1 ần lễ sau khi cây ra hoa): trọng lượng quả và hàm lượng

ả tăng, không thấy xuất hiện crocin

 Giai đoạn 2 (8ần lễ sau khi cây ra hoa): hàm lượng geniposid trong quả thayđổi trong khi đó crocin lại tích lũy và tăng lên cho đến khi quả chín ho

ụng kích thích mật vạ bilirubin huyết tương (phần tan trong nước),

ụng an thần, gây ngủ, chống co giật, hạ nhiệt, hạ huyết áp

ịch chiết nước nóng ử ử lượng thấp thu được khi tách phânđoạn có tác dụng kích thích tái tạo tế bội mạc lế bào đóng vai tr

ọng làm đông máu, do đó có tác dụng cầm máu m  ự tổn thương và sự

ậm tái sinh tế b ội mạc sẽ gây n ững triệu chứng bệnh lý như xơ vữađộng mạch

ụng kháng khuẩn, trị giun ần đây có nhiều nghi

ứu khẳng định tác dụng giảm đau, chống ủa các iridoid glycoside chiết xuất

ừ quả dành dành được so sánh với các thuốc chống vi

ị thuốc Dành dành được dọc cổ truyền để chữa viấp tính

ữa khái huyết, tiểu tiện ra máu đaốt, chống vi

ổng quan về nhóm hoạt chất Iridoid  

ồm những glycosid mộ khung của phần aglyconđược cấu tạo từ 2 đơn vị isopren Trong cây, các monoterpenoid glycosid được gặp

ều nhất l, cho đến nay, người ta đết đến trất Khung

cơ bản gồm một v ối với một v ồm các

ất ễ tan trong nước, cồn loường dung cồn50% để chiết xuất Dưới tác dụng của enzyme có sẵn trong cây, iridoid  ị

ến đổi th  ản phẩm màu đen Ngoài enzyme, iridoid  ũng dễ bị

ủằng acid Dưới tác dụng của kiềm NaOH, Ba(OH)ị

ắt

Để định tính nhóm hoạt chất này, người ta thường dùng phương pháp sắc ký

ấy hay SKLM Phần lớn các hợp chất iridoid có nhóm mang m –

ể hiện băng hấp thu ử ngoại ở 233ới log khoảng 3,8

ự nhiợp chất iridoid hay gặp trong các ọ thực vật: Rubiaceae(lá mơ lô        ứ),

  đề), Verbenaceae (cỏ roi ngựa), Cornaceae (sơn thù du),Valerinaceae, Gentianaceae (long đởm), Caprifoliaceae (kim ngân), Oleaceae,

ền), Scrophulariaceae (sinh địa, huyền sâm)…

ễ tan trong nước, et

+ Năng suất quay cực: +7,5ịch nước)

ụng dược lý của Geniposid 

ụng kích thích tái tạo tế bội mạc l ế bào đóng vai

ọng làm đông máu, do đó có tác dụng cầm máu mự tổn thương

ự chậm tái sinh tế bội mạc sẽ gây nững triệu chứng bệnh lý như xơ

ữa động mạch Chính vậy, Geniposid được dệu để tổng hợp

ất thuốc dùng trong điều trị các bệnh lý về tim mạch vệnh mạch v

ổng quan về chiết xuất, phân lập vế 

ề chiết xuất dược liệu: 

ết xuất dược liệu có vai trất quan trọng trước hết là để lấy được các chất

có trong dược liệu dưới dạng cần thiết (dung dịch, bột) to ần hoặc tinh khiếthơn cho mục đích nghiứu hoặc điều trị Phương pháp chiết xuất dược liệu bao

ồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và phương pháp chiết

 Căn cứ v ất lệc: chiết ở áp suất thường (áp suất khí quyển),

ết ở áp suất giảm (áp suất chân không) hay chiết ở áp suất cao (chế độ l

ệc có áp lực)

 Căn cứ v ạng thái l ệc của 2 pha: phương pháp ngâm hay ngấm

ệt

 ựa vững biện pháp kỹ thuật đặc biệt: siỏng, tạo d

ết với sự hỗ trợ của vi sóng, chiết dung môi dưới áp suất cao hay

ết chất lỏng tới hạn

ầu của một kỹ thuật chiết xuất tố

 Không đưa tạp chất vản phẩm (dư lượng dung môi, các tạp chất của quá

ết xuất)

 ện với môi trường (không gây ô nhiễm môi trường)

 ế v

ề chiết xuất, phân lập vế 

        thường dễ tan trongnước, cồn lo ường dùng nước hoặc cồn 50% l   ết xuất, sử

ụng kết hợp các phương pháp: cô đặc, lọc, kết tinh, sắc ký, chiết dung môi Ngo

ũng được dùng để hạn chế tạp

ỗi loại iridoid glycosid mà có phương pháp phân lập vế

ợp Thông thường, dùng phương pháp sắc ký cột, sắc ký chế hóa

ặc kết tinh phân đoạn trong các dung môi thích hợp

ứu ở ngoài nước:

ần đâất nhiều những bố kết quả những công tr

ứu về quy trết xuất các thần hóa ọc chính của D

ạt chất Iridoid glycosid nói ri ả Shau ộng sự [đắt một số công trứu về chiết xuất, phân lập vế một số

ủa các tác giả khác Theo ệu  ừ quả D dành đ

ập được 9 hợp chất monoterpenoid mới (Gardenamid A, 6α6’’ 

  ộng sự

ợp chất terpenoid mới được phân lập: gardenat A, 2

β

 Ở nghiứu  ả nập được 14

ừ lá cây    Hara trong đó có geniposid.

ả ộng sựột trong 10 hợp chất được phân lập từ

ả cây    ảo tệu [ả đ

ập được 6 iridoid glycosid từ quả Dằng phương pháp sắc ký lỏng hiệunăng cao hai chiều với ký thuật pha đảo chạy đẳng dới kỹ thuật nừ 10g

ược liệu đ  ập được geniposid (280mg), gardenosid (41,9mg), shanzhisid

β

ới độ tinh khiết tr

ắc ký phân bố ly tâm (Centrifugal Partition Chromatography –  ột

ững phương pháp được các tác giả [ử dụng để phân lập Geniposid từ

ịch chiết methanol 80% của quả D  ết quả l ừ 500mg dịch chiết đ

ập được 56,2mg Geniposid với độ tinh khiết trết bị chính dùng để

   ế Geniposid l ắc ký lỏng ngược d 

ĩnh lất lỏng lớp trủa hỗn hợp dung môi ethyl acetat –

 – nước (3:2:5) sau khi đằng pha, cớp dưới là pha động Pha

ĩnh được cho vột (cell) thường được cấu tạo ruột gà để tăng diện tích tiếp xúc.Pha động (luôn mới) được thừ từ vạy dọc theo pha tĩnh dưới tác dụng của

ực ly tâm theo cơ chế tách phân bố (tăng hiệu suất chiết)

 ảo t ệu khác   ả Vaandering Brenda đ đưa  

ập Geniposid từ quả Dành dành theo các bước sau:

 ền dược liệu thột thô

 ột dược liệu được chiết với cloroform để loại dầu béo vất m

đó được chiết bằng methanol ở nhiệt độ ph

 ập trung dịch chiết methanol, cô dưới áp ất giảm được cắn

 ịch chiết methanol được hấp phụ l  ạt, sau đó giải hấp phụ

ằng nước cất và ethanol 10% để loại đường Cuối c

để tách lấy các glycosid

 ột silica gel để tách các glycosid, rửa giải bằng hỗn hợp CHCl–

, geniposid được tách ra khỏi hỗn hợp ở phân đoạn 7 – 



ả Vaandering Brenda, geniposid chỉ lản phẩm trung gian của quá tr

ết xuất (lệu để tạo ra genipin) do vậy quy tr đề cập đếngiai đoạn tinh chế sảẩm

ảo một số tệu  có đưa ra sơ đồ chung để chiết xuất

ột số thần chính trong dược liệu D 

Định tính và định lượng Geniposid trong các sản phẩm trung gian của quá

ết xuất, phân lập v ế ằng phương pháp SKLM [ 

 ứu ở trong nước

Năm 2002, tác giả Đặng Ngọc Quang vộng sự [] đ ứu phân

ập được 14 iridoid glycosid từ rễ cây Mơ lông (tên khoa học  

ọ Cà phê (Rubiaceae) trong đó có Geniposid Theo các tác giả ndược liệu được phơi khô rồi tán th ột, sau đó chiết Soxhlet với dung 

ịch chiết methanol sau khi cất thu hồi dung môi sẽ thu được cắn DButanol để chiết cắn trịch chiết butanol được cho qua cột có chứa silica gel sắc

 ột, d ớp dưới của hỗn hợp dung môi cloroform –  – nước

ửa giải thu được 6 phân đoạn, trong đó Geniposid được

 ở phân đoạn 4 Tuy nhiên đề tỉ thu thập dược liệu ở Việt Nam, c

ực nghiệm được các tác giả nghiứu ở Nhật Bản

ảo các tệu cho thấy các nghiứu trong nước về vị dược

ệu Dới chỉ đưa ra được thần hóa học chung vụng dược lý

ủa dược liệu Đến nay trong nước chưa c ứ ề ếấ

  ế   ấ ẩ  ệ ạ   ả  ẩ

 ủ  ố ấ  ừ  ầ ầ  ấ ẩ 

  ến hành đề    ầ     ẩ  ất lượdượệế ẩốc Đông dượ

ổng quan của một số phương pháp hoá lử dụng trong nứu đề t

ắc ký lớp mỏng (SKLM)  

ắc

  ột kỹ thuật sắc ký, trong đó pha tĩnh chứa chất hấp phụ được trải

ớp mỏng, mịn và đồng ất, được cố định tr ến k ặc phiến kim

ại, nhựa; pha động lột hệ gồm một dung môi đơn thuần hoặc hỗn hợp nhiều

ối hợp với nhau theo tỷ lệ quy định Sắc ký được tiến hđộng di chuyển qua pha tĩnh trên đó đ đạt các chất cần tách Trong quá tr

ển qua chất hấp phụ, các cấu tử (ần trong hỗn hợp mẫu thử di chuyển

ớp mỏng theo hướng pha động với những tốc độ khác nhau dẫn đến việc tách

  ố khác nhau tr ớp mỏng Kết quả thu được một sắc ký đồ tr ớp

ỏng, ở đó, các th ần của mẫu thử phân bố rải rác dọc theo đường đi củadung môi động Cơ chế của sự tách có thể lấp phụ phân bố, trao đổi ion, sọc

ử hay phối hợp nhiều cơ chế, trong đó một loại nào đó trội lặc nhiều,

ộc vất của chất lĩnh và dung môi pha động

Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu các chất

ặc soi huỳnh quang ở các bước sóng 254nm, 366nm hoặc phun

ốc thử hiện mặc quét lề mặt bản mỏng thiết bị  ột thiết

ị đo cường độ ản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến của chất cần phân

ỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng một trong cácphương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích [3, 14]

1.6.1.2 Các đại lượng đặc trưng

ảng cách từ điểm xuất phát tới tâm vết phân tích (tính bằng cm)

ảng cách từ điểm xuất phát tới mức dung môi pha động (đo tr

đường đi của vết, tính bằng cm)

 ị từ 0 đến 1

ệc ổn định giá trị Rthường phụ thuộc nhiều yếu tố vặp nhiều khó khăn về

ặt kĩ thuật n     ường tiến h   ới chất chuẩntrong cùng điều kiện sắc ký

 Ứng dụng

Định tính

ựa vị Rỗi có một giá trị R đặc trưng trong một hệ dung môi phađộng Khi định tính thườn   ới chất chuẩn chạy sắc ký trong cùng điều

ện

ử tinh khiết

Dùng SKLM để kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất thể hiện các vết lạ ngo

ết chính của hợp chất khi khai triển dung dịch mẫu với các hệ dung môi khác nhau.Đây là một ứng dụất phổ biến của SKLM

ắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp chia tách trong đó pha động lột

ất lỏng cĩnh chứa trong cột lột chất rắn đưới dạng tiểu

ặc lột chất lỏng phủ trột chất mang dạng rắn hay một chất mang rắnđ được biến đổi bằng liết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trắc ký

ỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ

ột số đại lượng đặc trưng của quá trắc ký

ời gian lưu

 ời gian lưu (t  ời gian tính từ khi chất phân tích được ti  ệ

ống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó Thời gian lưu là

 ề mặt định tính tr ắc ký đồ của một chất tan trong điều kiện sắc ký

ới: W là độ rộng đáy pic

  ực tế nếu các pic cân đối th độ phân giải để 2 pic tách tối thiểu lR=1,0 Trong phép định lượng R=1,5 l ợp

trong đó: W là độ rộng pic ở chiều cao 1/20.

ảng cách từ đường cao hạ từ đỉnh pic tới đường cong phía trước

ủa pic ở 1/20 chiều cao

ệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trắc ký đồ Trong phépđịnh lượng thầu AF nằm trong khoảng 0,8

ự giống nhau về thời gian lưu trên sắc ký đồ của chuẩn v ử l cơ sở của

ử định tính Trện đại với detector diod array ta có thể vẽ

ổ UV ủa pic chuẩn vử rồi chồng 2 phổ với nhau để thấy sự giống

ề dạng phổ thông qua hệ số Match

 ệ số Match xấp xỉ 1,000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau ho

 ệ số Match cần 1,000 thự tương tự của phổ c

 ệ số Match > 0,900 thỉ ra 2 phổ tương tự

 ệ số Match < 0,900 thỉ ra 2 phổ khác nhau

Hơn thế nữa, với deteối phổ (MS) nhờ thư viện phổ mần chất

ẩn ta cũng có thể định tính được nếu như chất thử có mặt trong thư viện phổ



Định lượng

ệc so sánh độ lớn tín hiệu thu được từ pic chuẩn vử (diện tích hoặc

ều cao pic) trong c ột điều kiện sắc ký xác định là cơ sở của phép địnhlượng

 Các phương pháp định lượng có thể áp dụng l

+ Phương pháp dùng chuẩn ngoại

+ Phương pháp dùng chuẩn nội

+ Phương pháp thêm chất chuẩn

+ Phương pháp chuẩn hoá diện tích

ử tạp chất

ề cơ sở của cách thử tạp chất cũng giống như định lượng Ngoài ra, đối với

 ử tạp chất li    ết t ạp chất hoặc không có tạp chất

ẩn thể tính tỉ lệ tạp chất dựa vện tích pic của tạp so với hoạt chất

1.6.3 Đo nhiệt độ nóng chảy 

 ảng nhiệt độ nóng chảy của một chất lảng nhiệt độ đệu chỉnh kể

ừ khi chất rắn bắt đầu nóng chảy vất hiện những giọt chất lỏng đầu tiới khi

ất rắn chuyển ho   ạng thái lỏng ỗi chất khác nhau có nhiệt độ

ảy khác nhau

Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy lột chỉ tiọc rất quan trọng Điểm

ảy lẩn để kiểm tra mức độ tinh khiết của một chất

 Đo nhiệt độ nóng chảy có thể dùng để định tính và xác định độ tinh khiết của

ẫu thử, thường tiến hành xác định khoảng chảy của một hỗn hợp gồm các phần

ằng nhau của mẫu thử vủa mẫu chuẩn

1.6.4 Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) 

 ắc

ử dụng đặc tính hấp thụ ánh sáng trong v ồng ngoại (bước sóng khoảng

  ủa các chất hóa học Mỗi chất khác nhau có khả nămg hấp thụ ánh

ồng ngoại (IR) khác nhau đặc trưng riêng cho chất đó Ở nhiệt độthường các liết của các hợp chất đự dao động (bao gồm dao động hóa trị

 ổ IR được dùng để định tính các chất bằng cách so sánh với chất chuẩn.

 ối hợp với phổ UV, NMR, MS để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất

ữu cơ (bộ khung của phân ử, nhóm chức, vị trí của nhóm thể trên nhân thơm, phân

ệt các đồng phân)

 ễn biến của phản ứng hóa học

 ứu sự tương tác nội phân tử hoặc giữa các phân tử

ới sự phát triển của kỹ thuật chuyển dạng Fourier, quang phổ hồ

ại FTIR ngày càng được ứng dụng để định lượng nhiều hơn

ần lớn các hợp chất Iridoide có nhóm mang m –  ể hiệnbăng hấp thu trong vử ngoại ở bước sóng 233ới log ảng 3,8

ổ IR thường có tín hiệu ở 1722 cm 

1.6.5 Phương pháp phân tích khối phổ (MS)

ắc

ối phổ được thực hiện dựa trên cơ sở xác định khối lượng (thường lị số

 ố lượng tương đối của các ion tạo ra từ phân tử bị ion hóa vị phá vỡ

ảnh

 ắc: Dùng chùm điện tử có năng lượng trung b 100eV) để bắn

ử hữu cơ ở chân không cao (10 đó, chất hữu cơ

ị ion hóa v ị phá vỡ th ảnh Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể

ện bằng ột số vạch có cường độ khác nhau tập hợp thột khối phổ đồ hoặc

ổ khối

 Ứng dụng

Xác định đồng vị

ử đồng vị của cột nguyố có cố điện tích hạt nhân chỉ

ố neutron nối lượng nguyử khác nhau Có ể dùng MS để xácđịnh thần đồng vị của các nguyố trong mẫu

Định tính

   ối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử M

   ạnh đó xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của

  ới khối lượng của v ảnh ion có thể xác định được công thức

ủa chất phân tích

 Trong phân tích dược thường sử dụng kết nối GC/MS hoặc LC/MS Có thể so

 ổ nghi ứu với thư viện phổ có trong máy hoặc phổ chất đối chiếu để

ẳng định thần định tính của mẫu

Xác định công thức cấu tạo

Để xác định công thức cấu tạo của chất nghiứu cần dỹ thuật ion hóa

ợp phân tách chất nghiứu thều mảnh ion để lấu tạo ghép

ối của chúng Việc biện giải phổ nối hợp với ổ NMR, phổ IR

Định lượng

Phân tích định lượng khối phổ tương tự như các kỹ thuật khác dùng phương

ết lập đường chuẩn hoặc thêm đường chuẩn cới đo cường độ vạch phổ

để xác định nồng độ

Trong phân tích thường d ết nối LC/MS, GC/MS hoặc CE/MS để có thểtăng cường tính chọn lọc với hạn định lượng cho phương pháp phân tích Nét

ổi bật của phân tích khối phổ lọn lọc và độ nhạy Giới hạn phát hiện có thể

ới 10gam Nên thường dỹ thuật này để phân tích hàm lượng vết 

ững hạt nhân nguy ử có khối lượng l ố lẻ v ững hạt nhân có khốilượng nguyử lố chẵn nhưng số thứ tự nguyử lố lẻ thừ v

ệu NMR Các hạt nhân có khối lượng vố thứ tự nguyử lố chẵn th

ừ vệu NMR Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ

ổ NMR phụ thuộc vật độ điện tử ở vận quanh protonđó

1.6.6.2 Các đại lượng đặc trưng

Độ dịch chuyển hóa học δ

Độ dịch chuyển hóa học δ ự khác nhau giữa vị trí hấp thụ của hạt nhân

ổ NMR của mẫu phân tích vủa chất chuẩn

ới: νần số cộng hưởng của proton của mẫu

νần số cộng hưởng của proton của chất chuẩn nội tetramethylsilan

νần số của phổ kế

ằng số tương tác spin

ằng số tương tác spinảng cách giữa các vạch của tín hiệu bộiđược biểu hiện bằng Hz, đặc trư  ự tương tác spin Trị số J phụ thuộc vtương quan không gian và mật độ e ở vận của 2 proton tương tác

ện tích dưới tín hiệu

ện tích dưới tín hiệu tỷ lệ với số lượng proton cho tín hiệu đó Đường cong

  ện tích dưới tín hệu cho biết số lượng tương đối của proton cho tín

ệu

 Ứng dụng

ổ NMR thường được ứng dụng trong xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ

ết hợp với các thông tin của các loại phổ khác như phổ khối, phổ IR, phổ UV

1.6.7 Phương pháp sắc ký cộ  

ể nói sắc ký cột lột dạng của sắc ký giấy vắc ký lớp mỏng Trong

ắc ký cột, chất hấp phụ hoặc chất lền cho pha cố định được nhồi trong các ống

ụ gọi lột" Nhờ vậy mể khai triển dung môi liục với nhiều hệ

ừ phân cực yếu đến phân cực mạnh

ất của chất được sử dụng lột mự tách trong cột sẽ xảy

ủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ) hoặc theo cơ chế phân bố (cột phân

ố)

ột: ột lững ống thủy tinh ụ d  70 cm, đường kính 1  

cm, đầu dười có 1 vủy tinh có khóa để điều chỉnh tốc độ chảy của dung môi

ất dắc ký cột đều phải được tiẩn hóa để việc sử

ụng dễ dận lợi (Ví dụ: Silica gel 60 Merck: quy định cỡ hạt 0,063  



ầu của cột sắc ký lất rắn dột phải phân tán đồng đều ở mọi điểm

ột thột khối đồng nhất



ệ dung môi dắc ký giấy đều có thể ứng

ụng vắc ký cột Tuy vậy đối với các dung môi có độ sôi quá thấp (ether), hoặc

ịu, hoặc độc thửa trong sắc ký cột

Các dung môi thường dắc ký cột laceton, ethanol, methanol, butanol, nước

  ửa giải, dụng cụ dùng để hứng l ống nghiệm 20ml Các ống

ệm đều được đánh số từ 1 trở đi, vắp xếp sẵn trong các giá theo thứ tự để

ỏi nhầm lẫn trong quá trập hợp Các phân đoạn sau khi phân tích vập hợp

ể tích mỗi phân đoạn mử lý bằng cách cất thu hồi trong b

ầu ở áp suất giảm hoặc cho bốc hơi tự nhiồi cách thủy

 Ứng dụng:

Ứng dụng chủ yếu của phương pháp sắc ký cột lất ra khỏi hỗn

ợp Tộc bản chất của chất phân tích để lựa ọn cột tách và pha động rửa

ải thích hợp với mục đích thu được chất phân tích có độ tinh khiết cao

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN,

ỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ệu:

 ẩn phệm Geniposid của Tốc, hàm lượng 100%

 ị dược liệu D  ): đạt yầu

ất lượng theo DĐVN III

2.2 Phương tiện nghiứu:

ết bị, dụng cụ:

ứu đề tử dụng các thiết bị, dụụ đđược hiệu chuẩn theo ISO/IEC 17025 vủa Viện Kiểm nghiệm thuốc trungương và Viện Hóa học – ện Khoa học vệ Việt nam gồm:

 Máy đo điểm chảy ELECTROTHEMAL IA6304

 Máy đo phố hồng ngoại

 ủ bảo quản lạnh WESTPOINT

 ụng cụ thủy thủy tinh cần thiết cho quá trực nghiệm

ất, dung môi:

ội dung nghi ứu:

ạo lập chất chuẩn Geniposid từ dược liệu D

 ứu tết xuấtập ế Geniposid

ừ dược liệu D

2 Định tính Geniposid tinh chế được

ấu trúc của Geniposid tinh chế được

4 Định lượng Geniposid tinh chế được

5 Xác định giới hạn tạp chất liủa Geniposid tinh chế được

ựng vẩm định phương pháp HPLC để định lượng Geniposid tinh

 ự thảo tiẩn cho chất chuẩn phệm Geniposid

 ử dụng Geniposid tinh chế được l ất chuẩn ph  ệm để định tính, định lượng Geniposid trong vị dược liệu D

 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập v  ế Geniposid từ vị dược liệu



ết xuất:

 ại tạp (chất béo, nhựa, chất màu): phương pháp lắc si  ới



 ết xuất: dết hợp ới lắc si

 Xác định lượng chất chiết được trong methanol từ dược liệu bằngphương pháp cân, kết quả tính theo công thức sau:

ượng ất chiết được

ối lượắn thu được (g)

ối lượng dược liệu đết (g)

 Xác định hàm lượng Geniposid trong cắn methanol thu được bằng



ập:

 ử dụng than hoạt để hấp phụ Geniposid

 ải hấp phụ bằng methanol

 Tách phân đoạn bằng phương ắc ký cột sử dụng Silica gel của

  ửa giải bằng hỗn hợp cloroform –  ới tỷ lệ

ực tăng dần

 ểm tra các phân đoạn bằng SKLM có so sánh với chuẩnGeniposid để xác định phân đoạn có chứa Geniposid

ế:

 ử dụng dung môi aceton nóng để h    đó làm

ạnh để Geniposid kết tinh lại

 ểm tra Geniposid tinh chế bằng SKLM trệ dung môi khác

   ới chuẩn Geniposid về giá trị R  ắc vết thuđược

2.4.2 Định tính vểm tra độ tinh khiết Geniposid tinh chế được

 ển khai trệ dung môi khác nhau, so sánh giá trị R

ắc các vết của dung dịch chuẩn vử

 Xác định nhiệt độ nóng chảy của Geniposid tinh chế được, so sánh với

ảng nhiệt độ nóng chảy của Geniposid chuẩn theo tệu tham khảo được

 ổ IR của chất chuẩn vế được để định tính v

ểm tra độ tinh khiết của Geniposid tinh chế được

    ời gian lưu kết hợp với chồng phổ UV –  ủa dung

ịch ẩn vịch thử Geniposid theo điều kiện sắc ký đựa chọn để định

ế được Đồng thời HPLC cũng được lựa chọn để xác đinh tạp

ất liủa Geniposid đế

2.4.3 Xác định cấu trúc của Geniposid đế

ết hợp  hương pháp phân tích khối phổ  ộng hưởng từ hạt nhân

ữ liệu thu được từ 2 loại phổ n ới dữ liệu phổ có trongthư viện phổ để ẳng định ấu trúc ất đem đo ph ợp với cấu trúc của



2.4.4 Xác định hàm lượng ủa Geniposid tinh chế được

  ựng quy tr định lượng Geniposid tinh chế được bằng HPLC v

ẩm định phương pháp đó về các mặt: tính thích hợp của hệ thống, độ đặc hiệu,

ảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, LOD v

 Xác định hàm lượng Geniẫu thử theo công thức:

ện tích pic  tương ứng của mẫu thử vẫu chuẩn

: lượng cân tương ứng của mẫu thử vẫu chuẩn 

 hàm lượng củẫu chuẩn (%)

 ử dụng Geniposid tinh chế được l ất đối chiếu để định tính, định lượng Geniposid có trong dược liệu D

2.4.5.1 Định tính Geniposid có trong dược liệu D

 hương pháp SKLM ến hành theo DĐVN III

    ị R   ắc của vết Geniposid chuẩn với các vết thuđược trắc ký đồ của dung dịch thử

 ến hắc ký theo điều kiện đọn

Hàm lượng Geniposid có trong dược liệu (tính theo khô kiệt) được tính theo công

 ối lượng mẫu thử (

 ồng độ của dung dịch chuẩn Geniposid (mg/ml)

 : Độ pha loủa dung dịch thử

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VẾT QUẢ

 ạo lập chất chuẩn ừ vị dược liệu D

   ử dụng một số phương pháp sau để định tính, định lượng

ản phẩm trung gian của quá trết xuất, phân lập:

  ện vết:   ản mỏng dưới đ ử ngoại ở bước sóng

ặc phun dung dịch acid ấy

ết xuất, phân lập ế Geniposid ừ vị dược liệu D

  ảo một số t ệu [  ề quy tr  ập 

ủa geniposid vằng nghiứu thực nghiệm ở từng giai đoạn chiết xuất,chúng tôi đến hảo sát qua đó lựa chọn ra các điều kiện phợp

 ết xuất Iridoid ừ dược liệu D

     ần chính l     ứa rất

ều các chất khác như chất béo, nhựa vất màu do đó để có thể thuận lợi chiết

ất vập ần phải loại bỏ các thần này Chúng tôi đựa

 ết xuất Iridoid glycosid:

ại tạp (chất béo, nhựa, chất m

ảo sát, chúng tôi đựa chọn cloroform để loại các tạp l

ất béo, chất m ả năng hốt các chất tạp như màu,

ột dược liệu trủy

Để kiểm tra khả năng loại bỏ tạp chất bằng cloroform chúng tôi đ ến h

ới điều kiện sắc ký được ghi tại mục 3.1, các dung dịch thử vẩn được

 ịch chuẩn: Dung dịch Geniposid 0,4% trong ethanol (Chấm 10 µl)

ết quả ắc ký thu được ể hiện ở h 