Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn linarin từ cúc hoa vàng ( flos chrysanthemi indici)

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ N • • • VŨ THỊ NGUYỆT MINH NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN LINARIN TỪ CÚC HOA VÀNG (FLOS CHRYSANTHEMIINDICI) LUẬN VĂN THẠC SỸ Dược HỌC • • • • CHUYÊN NGHÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC & Độc CHẤT MÃ SỐ : 607315 Ngưòi hướng dẫn khoa học: TS Trần Việt Hùng HÀ NƠI 2010 M è í e ả m ổ n Với lòna kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn TS Trần Việt Hùng, người anh công việc, người thầy tận tụy trực tiếp hướng dẫn, bảo tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Đốc Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung Ương, Ban giám hiệu, Phòng quản lý sau đại học thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình học tập thực đề tài Đặc biệt, cảm ơn bạn đồng nghiệp Khoa Vật lý đo lường giúp đỡ, san sẻ công việc đóng góp ý kiến cho tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình bạn bè động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập cũns thực luận văn Luận văn hoàn thành nhờ tài trợ kinh phí Đề tài cấp Nhà nước KC.10.16/06-10 Xin trân trọng cảm ơn PGS TS Trịnh Văn Lẩu, chủ nhiệm đề tài! Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2010 DS Vũ Thị Nguyệt Minh 1.6.1.5 Hồ sơ chất đối chiếu 1.6.2 Hoạt động thiết lập chất chuẩn Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương CHƯƠNG ĐOI TƯỢNG VÀ PHƯỚNG PHÁP NGHIEN c ứ u 2.1 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u 2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN c ứ u 2.2.1 Hóa chất- thuốc thử 2.2.2 Thiết bị- dụng cụ 2.3 PHƯƠNG PHAP NGHIÊN c ứ u 2.3.1 Định tính nhóm chất đối tượng nghiên cứu dược liệu, sản phẩm chiết xuất, phân lập tinh chế 2.3.1.1 Định tính flavonoid phản ứng hóa học 2.3.1.2 Định tính linarin sắc kỷ lớp mỏng (TLC) 2.3.1.3 Định tính sắc kỷ lỏng hiệu cao (HPLC) 2.3.1.4 Định tính sắc kỷ khối phổ (LC MS) 2.3.1.5 Định lượng nhóm chất đổi tượng nghiên cứu dược liệu, sản phẩm chiết xuất, phân lập tỉnh chế 2.3.2 Chiết xuất, phân lập tinh chế 2.3.2.1 Chiết xuẩtflavonoid 2.5.2.2 Phần lập 2.3.2.3 Tinh chế 2.3.3 Xây dưng bô liêu nhân dang chất w • o • • • • o 2.3.4 Thiết lập chất chuẩn xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất chuẩn 2.3.4.1 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng tiêu chất lượng 2.3.4.2 Ouy trình thiết lập phân tích đánh giả chất chuẩn 2.3.4.3 Đánh giá chất lượng chuẩn thông qua liên phòng thí nghiệm 2.3.4.4 Phương pháp xử lý số liệu CHƯƠNG KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u 3.1 KIỀM TRA CHÁT LƯỢNG DƯỢC LIỆU THEO DĐVNIV 3.2 ĐỊNH TÍNH NHĨM CHÁT VÀ ĐÓI TỨỢNG NGHIÊN c ứ u 3.2.1 Định tính flavonoid phản ứng hóa học 3.2.2 Định tính linarin bàng phương pháp sắc ký lóp mỏng (TLC) 3.2.3 Định tính định lượng ỉinarin dược liệu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 3.3 XAY DựNG QUY TRÌNH CHIÉT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHÉ 3.3.1 Xây dựng quy trình chiết xuất 3.3.1.1 Khảo sát xây dựng quy trình chiết xuất 3.3.1.2 Đánh giá độ ổn định quy trình chiết xuất 3.3.1.3 Quy trình chiết xuất flavonoid tồn phần từ Cúc hoa vàng 3.3.2 Xây dựng quy trình phân lập 27 27 30 30 30 30 30 32 32 32 32 32 32 33 34 34 34 34 34 35 35 37 38 38 40 40 41 41 42 43 45 45 45 47 48 50 ì 3.3.2.1 Nghiên cứu lựa chọn hệ dung mơi pha động 50 3.3.2.2 Ouv trình phân lập 51 3.3.2.3 Đánh giá độ ổn định quy trình phân lập 54 3.3.3 Xây dựng quy trình tinh chế 55 33.3.1 Khảo sát xây dựng quy trình tinh chế linarin 55 3.3.3.2 Ouy trình tinh chế 56 3.3.3.3 Khảo sát độ ổn định quy trình tình chế 58 3.4 B ộ D LIỆU NHẬN DẠNG LINARIN 58 3.4.1 Đặc điểm hình thái 58 3.4.2 Đo điểm chảy 58 3.4.3 Đo phổ (UV- VIS) 59 3.4.4 Đo phổ hồng ngoại (IR) 59 3.4.5 Đo phổ khối lượng (MS) 60 3.4.6 Đo phổ cộng hưỏng từ hạt nhân (NMR) 61 3.5 THIỂT LẬP CHÁT CHUẨN 62 3.5.1 Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích 62 3.5.1.1 Xây dựng phương pháp phân tích 62 3.5.1.2 Thẩm định phương pháp phân tích 64 3.5.2 Tiêu chuẩn chất lượng đánh giá chất chuẩn 68 3.5.3 Áp dụng tiêu chuẩn chất hrọng phưottg pháp phân tích thẩm đinh để xác đinh chất lương liêu làm chất chuẩn 68 • • • o nguyên o • 3.5.3.1 Định tính 68 3.5.3.2 Điểm chảy 68 3.5.3.3 Tạp chất liên quan 69 3.5.3.4 Định lượng 70 3.5.4 Đóng gói đánh giá đồng l 72 3.5.5 Đánh giá chất lượng chuẩn thơng qua liên phòng thử nghiệm (PTN) xác định giá trị ấn định 72 CHƯƠNG BÀN LUẬN 75 4.1 Tính hiệu kinh tế 75 4.2 Nghiên cửu chiết xuất, phân lập tinh chế linarin từ Cúc hoa vàng 75 4.3 Xây dựng liệu phân tích, nhận dạng chất 76 4.4 Thiết lập linarin làm chất chuẩn quốc gia 76 KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ANOVA : CĐC COA : : COSY : CRS : DĐVN DEPT : : EI : ESI : FAB : FT-IR : GPC : HMBC : HPLC : HSQC : IR KH&CN LOD : : : : LOQ : MS : NICPBP : Analysis o f variance Phân tích phương sai Chất đổi chiểu (ĐC: đổi chiếu) Certificate o f analysis Phiếu kiểm nghiệm Chemical Shift Correlation spectrometry Liên hệ dịch chuyển hóa học Chemical refeưence Standard Chất chuẩn đổi chiểu hỏa học Dược điển Việt Nam Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Chuyển đổi phân cực biến dạng (phổ) Electron Impact Va chạm điện tử Electro Spray Ionisation lon hóa bang phun điện tử Fast atom bombardment Bắn phá nguyên thử nhanh Fourier Transform Infrared Spectrophotometry Hồng ngoại biến đổi Fourier Gel Permeation Chromatography Sắc ký thấm qua gel (đồng nghĩa với SEC) Heteronuclear Multiple Bond Coherence Liên hệ đa liên kết dị nhân High Performance Liquid Chromatogarphy, Sắc ký lỏng hiệu cao Heteronuclear Singular Quantum Coherence Liên hệ đơn lượng tử dị nhân Infra-red Hồng ngoại Khoa học công nghệ Limit of detection Giới hạn phát Limit of quantitation Giới hạn định lượng Mass Spectrometry Phổ khối lượng, gọi tắt phổ khối National Institute for Control of Pharmaceuticals and NMR PTN SEC SKĐ SKLM SPPL S/N TB TLC USP UV-VIS Viện KNT.T.Ư WHO Biological Products Viện Kiểm nghiệm Dược phẩm Sinh phẩm Trung Quốc Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởns từ hạt nhân Phòng thí nghiệm Size eclusion chromatography Sắc ký rây (sàng lọc) phân tử (đồng nghĩa với GPC) Sắc ký đồ Sắc ký lớp mỏng Sản phẩm phân lập Signal to noise ration Tỷ số đáp ứng (tín hiệu) chia cho nhiễu Trung bình Sắc ký lóp mỏng The United States Pharmacopoeia Dược điển Mỹ Ultraviolet - Visible Tử ngoại - khả kiếm Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương World Health Organization Trang DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số hãns cung cấp chất chuẩn linarin Bảng 2.1 Tóm tắt tiêu phương pháp thử chất chuẩn Bảng 2.2 Quy tẩc làm ừòn sổ Bảng 3.1 Kết định tính flavonoid dược liệu Bảng 3.2 Kết định lượng linarin Cúc hoa vàng Bảng 3.3 Kết chiết xuất flavonoid toàn phần ethanol 70%, 90% 100% Bảng 3.4 Kết chiết xuất flavonoid toàn phần methanol 70%, 90% 100% Bảng 3.5 Kết định lượng linarin flavonoid toàn phần Bảng 3.6 Kẻt khảo sát độ lặp lại quy trình chiểt xuất Bảng 3.7 Kết khảo sát độ lặp lại quy trình phân lập Bảng 3.8 Độ tan linarin methanol nhiệt độ phòng 60°c Bảng 3.9 Hiệu suất hàm lượng linarin ữong sản phẩm sau lần kết tinh Bảng 3.10 Hiệu suất hàm lượng linarin sản phẩm sau lần kết tinh Bảng 3.11 Điểm chảy cùa linarin sau tinh chế Bảng 3.12 Kết đo phổ tử ngoại khả kiến (UV - V IS) Bảng 3.13 Kết đo phổ hồng ngoại (IR) cùa linarin Bảng 3.14 Kểt đo phổ khối lượng (ESI MS) linarin Bảng 3.15 Khảo sát pha động thành phần pha động Bảng 3.16 Kết xác định khoảng tuyển tính Bảng 3.17 Kết khảo sát độ lặp lại hệ thong Bảng 3.18 Kết khảo sát độ chụm phương pháp Bảng 3.19 Kết xác định độ Bảng 3.20 Kết xác định LOD cho phép định lượng Bảng 3.21 Tóm tẳt chi tiêu phương pháp thử chất đối chiểu Bảng 3.22 Kêt phân tích tạp mẫu thử linarin Bảng 3.23 Điều kiện sắc ký Bảng 3.24 Kết định lượng linarin nguyên liệu thiết lập chuẩn Bảng 3.25 Kết đánh giá độ đồng lô Bảng 3.26 Các thông số hệ sắc ký Bảng 3.27 Kết xác định hàm lượng Bảng 3.28 Kết đánh giả theo ANOVA Bảng 4.1 Số liệu thẩm định phương pháp HPLC linarin Bảng 4.2 Các tiêu đánh giá 10 35 39 41 44 45 46 47 48 55 55 56 58 58 59 60 61 62 64 65 65 66 67 68 69 71 71 72 72 73 73 77 77 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cẩu trúc phân tử linarin Hình 1.2 Cúc hoa vàng Hình 1.3 Một phần cẩu trúc pha tĩnh Sephadex® LH20 Hình 1.4 Phân biệt sẳc ký phân tích, sẳc ký bán điều chế điều chế Hình 1.5 Sơ đồ máy HPLC Hình 1.6 Mơ hình mơ tả quy trình cơng tác thiết lập lập chuẩn khu vực ASEAN Hình 1.7 Hình ảnh số chất chuẩn đổi chiếu hỏa học chuẩn khu vực Asean Hình 1.8 Mơ hình thiết lập chất đối chiếu Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương Hình 2.1 Một số thiết bị sử dụng ừong nghiên cứu Hình 3.1 Cúc hoa vàng Chrysanthemum indicum L (1) Chrysanthemum sp.(2) Hình 3.2 Một sổ đặc điểm bột Cúc hoa vàng CH] (a) CH2 (b ) Hình 3.3 Sắc ký đồ vết linarin chuẩn mẫu thử CH2 Hình 3.4 sẳc ký đồ HPLC mẫu Cúc hoa vàng (1 ) mẫu đối chiếu linarin (2) Hình 3.5 Sơ đồ quy trình chiết xuất ílavonoid tồn phần từ Cúc hoa vàng Hình 3.6 Sắc ký đồ flavonoid tồn phần (T) chẩt đổi chiếu linarin (ĐC) hệ dung môi Cloroform - methanol - nước (5:1:0,1) Hình 3.7 Sơ đồ quy trình phân lập linarin từ flavonoid tồn phần Hình 3.8 SKĐ SPPL (T) linarin chuẩn (C) hệ (a), hệ (b), hệ 3(c ) Hình 3.9 Sơ đồ quy trình tinh chế linarin Hình 3.10 Phổ tử ngoại khả kiến (ƯV - VIS), ghi từ 200 - 900 nm mẫu thử linarin (methanol, 0,01 mg/ml) Hình 3.11 Phổ hồng ngoại (IR) mẫu thử linarin, 2.000 - 400 cm’1 Hình 3.12 Phổ khối (ESI MS) linarin Hình 3.13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (]H-NMR,13C-NMR) mẫu thử linarin Hình 3.14 Sắc ký đồ (pha động sổ 3) phổ DAD dung dịch đổi chiếu linarin Hình 3.15 SKĐ xác định tạp mẫu thừ linarin Hình 3.16 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn linarin (a) dung dịch thử linarin (b ) Hình 3.17 Sản phấm chất chuẩn Viện KNT.T.Ư Hình 3.18 Đóng chuẩn buồng Glove - Box, Viện KNT.T.Ư Hình 3.19 Tủ bảo quản chẩt chuẩn Viện KNT.T.Ư 14 15 16 28 28 29 31 40 40 42 44 49 50 53 54 57 59 60 61 61 63 70 71 74 74 74 ĐẶT VẮN ĐÈ • Từ cổ xưa, người biết sử dụng cỏ làm thuốc phòng chữa bệnh Cùng với phát triển kinh tể - xã hội, mô hĩnh bệnh tật thay đổi theo, ngày xuất nhiều loại bệnh lạ Việc kết họp hài hòa hai y học cổ truyền y học đại xu tất yếu thời đại nhàm giải khỏ khăn y học Trong năm gần đây, xu hướng quay trở lại sử dụng sản phẩm có nguồn Sốc thảo mộc để phòns điều trị bệnh trở nên thịnh hành giới Mặt khác, tri thức sử dụng cỏ làm thuốc coi sở quan trọng để sàng lọc tìm thuốc mới, nhẩt nước tiên tiến Mỹ, Pháp V iệc sàng lọc tác dụng sinh học từ họp chất thiên nhiên dựa vào kinh nshiệm cộng đồng để tìm thuốc đánh giá có hiệu tiết kiệm so với việc tổng họp hóa học Đến năm 1985 cỏ khoảng 3.500 cẩu trúc hóa học cỏ nguồn gốc tự nhiên phát hiện, 2.618 chất số từ thực vật bậc cao, 512 chất từ thực vật bậc thẩp 372 chất từ nguồn khác [26] Có 119 chẩt tinh khiết chiết tách từ khoảng 90 loài thực vật bậc cao sử dụng làm thuổc toàn giới Ở Việt Nam, nay, cỏ nhiều sách tập họp cơng trình nghiên cứu dược liệu kinh nghiệm phòng chữa bệnh ữong nhân dân ta “Nhữi7g thuổc vị thuốc Việt Nam” tác giả Đỗ Tất Lợi; uTừ điển thuốc” tác giả Võ Văn Chi; “Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam” tập thể tác giả Viện Dược liệu Trong dược liệu sử dụng, có nhiều dược liệu xây dựng tiêu chuẩn đưa vào Dược điển Việt Nam (DĐVN) Flavonoid nhóm chất lớn dược liệu có tác dụng chổng oxy hóa gổc tự mạnh Linarin ílavonoid có Cúc hoa vàng, số nghiên cứu giới chứng minh linarin cỏ tác dụng điều hòa huyết áp, ức chế phát triển tế bào ung thư tiền liệt tuyến kểt họp với acid chlorogenic [31]’ [39l Ở Việt Nam, Cúc hoa vàng vị thuốc quen thuộc y học cổ truyền, có vị ngọt, đắng, tỉnh bình mát, có tác dụng nhiệt, giải cảm, tán phong thấp, giáng hỏa, giải độc, làm sáng mắt [6]’ [10]’ [12J’ [15l Dược điển Việt Nam IV có hẳn chuyên luận riêng Cúc hoa vàng, nhiên lại không đề cập đến thành phần linarin [9]; Trong đó, Dược điển Trung Quổc lại quy định hàm lượng linarin Cúc hoa vàng không 0,8% [37] Dược điển Việt Nam xuất lần thứ tư (DĐVN IV, 2009) có 314 chuyên luận dược liệu thuốc có nguồn gốc dược liệu; trons có 80 chuyên luận cần sử dụng chất chuẩn chiết từ dược liệu Hoàng kỳ (astragaloside IV), Chi tử (jasnimoidin), Đại hoàng (emodin), c ổ t tối bổ (naringin) Do việc chiết xuẩt, phân lập tinh chế chất đặc trưng từ dược liệu làm chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược liệu trở nên cần thiết đổi với công tác kiểm tra giám sát chất lượng thuốc Để giải vẩn đề cấp thiết đó, tron? phạm vi đề tài cấp Nhà nước KC.10.16/06-10, thực đề tài: “Nghiên cửu thiết lập chất chuẩn ỉinarin từ Cúc hoa vàng (Flos Chrysanthemi indici)” Để đạt mục tiêu chiết xuất, phân lập, tinh chế linarin tò Cúc hoa vans đạt độ tinh khiết làm chất chuẩn thiết lập chất chuẩn linarin, nội dung nghiên cứu cụ thể đề tài bao gồm: - Khảo sát lựa chọn quy trình chiết xuất, phân lập tinh chế linarin tò Cúc hoa vàng - Xây dựng liệu phân tích cấu trúc, nhận dạng đánh siá độ tinh khiểt linarin - Thiểt lập chẩt chuẩn linarin đạt độ tinh khiết tối thiểu 95 % phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu LINARIN-01 —DMS0—HM3C PHỤ LỤC III SẤC KÝ ĐỒ HPLC ,.fIN\LINA0017 D Mienex Luna 150x4, 6mm; 5um; l,0ml/ph; 334nm; Me0H-H20-avacetic= 52-4 6-2 12/4/2009 1:47:12 PM Chi Thu Instrument C:\HPCHEM\l\METHODS\LINARIN.M 12/4/2009 2:04:49 PM by Thu (modified after loading) alysis Method • C:\HPCHEM\l\METHODS\SILYB.M 12/16/2009 10:22:00 AM by Thu St changed (modified after loading) ,nh luonq chuan TP Linarin jgqtion Date mple Name q Operator