Nghiên cứu thiết lập mẫu chuẩn thứ cấp kháng nguyên độc tố ho gà PT (pertussis toxin)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN SỸ TUẤN NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP MẪU CHUẨN THỨ CẤP KHÁNG NGUYÊN ĐỘC TỐ HO GÀ PT (Pertussis Toxin) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN SỸ TUẤN NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP MẪU CHUẨN THỨ CẤP KHÁNG NGUYÊN ĐỘC TỐ HO GÀ PT (Pertussis Toxin) LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: 607/QĐ-ĐHNT Quyết định thành lập HĐ: 685/QĐ-ĐHNT Ngày bảo vệ: 19/08/2017 Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ LAN PHƯƠNG PGS.TS NGUYỄN VĂN DUY Chủ tịch Hội đồng: TS NGUYỄN ĐỨC TÂN Khoa sau đại học: KHÁNH HÒA – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Nghiên cứu thiết lập mẫu chuẩn thứ cấp kháng nguyên độc tố ho gà PT (Pertussis Toxin)” cơng trình nghiên cứu cá nhân tơi chưa cơng bố cơng trình khoa học khác thời điểm Khánh Hòa, ngày 30 tháng 08 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Sỹ Tuấn iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin chân thành cảm ơn: Khoa Sau đại học, Viện Công nghệ sinh học Môi trường – Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình học tập thực đề tài TS Nguyễn Thị Lan Phương – Phó Viê ̣n trưởng Viê ̣n Vắ c xin và Sinh phẩ m Y tế – Người thầy đã trực tiế p hướng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt kiến thức, tận tình bảo, giúp đỡ, định hướng cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu thực đề tài PGS.TS Nguyễn Văn Duy – Người thầy truyền đạt kiến thức, trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ cho tơi nhiều kiến thức quý báu để hoàn thành luận văn Các anh chị em bạn đồng nghiệp Phòng Kiểm định, Phòng Nghiên cứu phát triển, Phòng Vắc xin DPT – Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành đề tài luận văn Cuối tơi xin gửi tình cảm thân thương đến gia đình, bạn bè giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn! Khánh Hịa, ngày 30 tháng 08 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Sỹ Tuấn iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC BẢNG xi DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ xii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xiii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh ho gà 1.2 Tổ ng quan về vi khuẩn ho gà 1.2.1 Hình thái vi khuẩn ho gà 1.2.2 Tính chất ni cấy 1.2.3 Tính chất sinh hóa 1.2.4 Tính chất kháng nguyên Bordetella pertussis 1.2.4.1 Các kháng nguyên độc tố 10 1.2.4.2 Các ngưng kết nguyên (FIM: Fimbriae hay Agglutinogen- AGG) 12 1.2.4.3 Kháng nguyên ngưng kết hồng cầu diềm tua FHA (Filamantous haemagglutinin: FHA) 13 1.2.4.4 Protein màng tế bào hay PRN 69 kDa (PRN: Pertactin) 14 1.3 Vắc xin ho gà 14 1.4 Công nghệ kỹ thuật sản xuất kháng nguyên ho gà PT 15 1.4.1.Nuôi cấy vi khuẩn ho gà thu hỗn hợp kháng nguyên chứa PT 15 1.4.2 Phương pháp tinh chế độc tố PT 16 1.4.2.1 Các phương pháp tinh chế độc tố PT 16 1.4.2.2 Phương pháp sắc ký lực 17 1.4.3 Kỹ thuật đông khô 18 v 1.5 Vai trò mẫu chuẩn độc tố ho gà sản xuất vắc xin ho gà 22 1.5.1 Mẫu chuẩn độc tố ho gà quốc tế 22 1.5.2 Hướng dẫn WHO thiết lập mẫu chuẩn thứ cấp 23 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.2 Vật liệu 25 2.2.1 Sinh phẩm - Hóa chất - Dung dịch 25 2.2.2 Nguyên vật liệu 26 2.2.3 Thiết bị 27 2.3 Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Phương pháp tinh chế kháng nguyên PT 28 2.3.1.1 Sơ đồ tổng quát qui trình tinh chế kháng nguyên độc tố PT 28 2.3.1.2 Phương pháp thu kháng nguyên thô từ canh cấy ho gà chủng BP 509 28 2.3.2 Phương pháp pha chế đông khô kháng nguyên độc tố PT 31 2.3.2.1 Qui trình đông khô mẫu chuẩn độc tố PT thiết bị đông khô EPSILON - 6D (Christ) 31 2.3.2.2 Đông khô thử nghiệm độc tố ho gà PT tinh chế 34 2.3.3 Các phương pháp kiểm tra chất lượng 35 2.3.3.1 Tiêu chuẩn chất lượng mẫu chuẩn PT đông khô 35 2.3.3.2 Các phương pháp kiểm tra kháng nguyên PT 36 2.3.3.3 Các phương pháp đánh giá chất lượng sản phẩm mẫu chuẩn đông khô 43 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Kết 47 3.1.1 Tinh chế kháng nguyên độc tố ho gà PT 47 3.1.1.1 Thu hồi kháng nguyên thô từ canh cấy vi khuẩn ho gà 47 3.1.1.2 Tinh chế PT từ kháng nguyên thô cột sắc ký lực Sepharose 4Bfetuin 48 vi 3.1.1.3 Kiểm tra đánh giá chất lượng sản phẩm PT sau tinh chế 51 3.1.2 Kết nghiên cứu xác định qui trình đơng khơ máy EPSILON -6D 55 3.1.2.1 Xác định độ đồng phân liều ảnh hưởng công thức pha dung dịch protein/ đệm tá chất dùng cho đông khô 55 3.1.2.2 Xác định ảnh hưởng q trình đơng khơ đến hoạt tính kháng nguyên độc tố ho gà PT 57 3.1.3 Kết đông khô lô mẫu chuẩn PT 58 3.1.3.1 Kết kiểm tra trạng thái vật lý sản phẩm sau đông khô 58 3.1.3.2 Kết kiểm tra độ đồng lô PT-01 PT-02 sau đông khô 61 3.1.3.3 Kết đánh giá độ ổn định sản phẩm đông khô bảo quản ≤ - 20 °C tháng 62 3.2 Thảo luận 65 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên đầy đủ Ghi Độc tố men ACT Adenylate Cyclase Toxin AND Deoxyribo Nucleic Acid ADP Adenosyl Diphosphat aP Acellular Pertussis vaccine APS Amoni Per Sulfat AGG Agglutinogen AMP Adenosine Mono Phosphate BP Bordetella Pertussis BG Bordet Geugou BSA Bovin Serum Albumin CHO Chinese Hamster Ovary Cell Vắc xin ho gà vô bào Ngưng kết nguyên Vi khuẩn ho gà Tế bào buồng trứng chuột Hamster Trung Quốc CV Hệ số biến thiên Coefficient of Variation Chương trình tiêm chủng mở CTTCMR rộng DNT Dermo Necrotic Toxin Độc tố gây hoại tử DPT Diptheria – Pertussis – Tetanus Vắc xin Bạch hầu – Ho gà – Uốn ván Diptheria –Tetanus – acellular Vắc xin Bạch hầu – Uốn ván – Pertussis Ho gà vô bào DTaP-Hib- Diptheria –Tetanus – acellular Vắc xin Bạch hầu – Uốn ván – HepB Pertussis – Haemophilus influenza Ho gà vô bào – Viêm màng não – Hepatitis B mủ – Viêm gan B Dulbecco's Modified Eagle's Môi trường DMEM DTaP DMEM viii Medium EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid ELISA Enzym-linked Immunosorbent Phản ứng miễn dịch gắn men assay FHA Filamentous Haemagglutinin Yếu tố diềm tua ngưng kết hồng cầu FIM Fimbriae Agglutinogen Các ngưng kết nguyên bề mặt HLT Heat Labile Toxin Độc tố không bền với nhiệt HST Heat Stable Toxin Độc tố bền với nhiệt HSF Histamin Sensitive Factor Yếu tố nhạy cảm histamine Huyết bào thai bê HTBTB Kháng thể G IgG Immunoglobulin G IFN Interferon IL Interleukine IU International Unit Đơn vị quốc tế IVAC Institute of Vaccine and Medical Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế Biologicals JNIH Japanese National Institute of Viện Y tế Quốc gia Nhật Bản Health kDa kilo Dalton LPF Lymphocytosis Promoting Factor LPS Lipopolysaccharide NIBSC National Institute for Biological Viện Quốc gia Tiêu chuẩn Standards and Control Kiểm định sinh học Vương Quốc Yếu tố kích hoạt bạch cầu Anh NP Nitơ Protein ix OD Opacity Density PBS Phosphate Buffered Saline RPM Revolutions Per Minute SBC Streptavidine Biotin Complex TCT Tracheal Cytotoxin Số vòng quay phút Độc tố khí quản Trọng lượng phân tử TLPT TMB Tetra Methyl Benzidine TSB Tryptic Soy Brorth Môi trường TSB UNICEF United Nations Children’s Fund Quỹ Nhi đồng Liên Hiệp Quốc WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới wP Whole cell Pertussis vaccine Vắc xin ho gà toàn tế bào x % 100.00 90.00 80.00 Tỉ lệ 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 T0 tuần Thời gian tháng tháng PT-01 tháng tháng PT-02 Hình 3.8 Tỷ lệ % giảm hàm lượng kháng nguyên lô PT-01 PT-02 đông khô sau tháng bảo quản ≤ -20 °C Song song với trình giảm hàm lượng kháng nguyên, độ ẩm tồn dư lô sản phẩm sau đông khô tăng lên rõ rệt Ở lô PT-01 độ ẩm tồn dư sau tháng 5,16 % lơ PT-02 độ ẩm tồn dư sau tháng bảo quản 3,74 % Kết cho thấy có liên quan độ ẩm tồn dư sản phẩm đông khô với độ ổn định hàm lượng kháng nguyên lô kháng nguyên độc tố đông khô Hàm lượng kháng nguyên đại diện cho protein đặc hiệu kháng nguyên độc tố PT, giống các sản phẩm sinh học khác có q trình giáng hóa tự nhiên theo thời gian tùy thuộc vào dạng sản phẩm (đông khô hay dạng nước), nồng độ sản phẩm, thành phần chất ổn định thêm vào, điều kiện bảo quản…sản phẩm giữ dạng đông khô điều kiện bảo quản lạnh sâu làm chậm lại q trình giáng hóa Chính lý mẫu chuẩn nói chung khuyến cáo nên giữ dạng đông khô với độ ẩm tồn dư thấp tốt Sản phẩm sau đơng khơ có tính háo ẩm cao nên độ kín vật chứa sản phẩm đơng khơ nhằm tránh xâm nhập khơng khí (hơi ẩm) vào sản phẩm trình bảo quản yếu tố quan trọng để trì tính ổn định sản phẩm thời gian dài Việc chọn loại vật liệu để đảm bảo độ kín sản phẩm đơng khơ có vai trị định việc trì mức độ ẩm tồn dư sản phẩm đông khô Kết 69 xác định độ ổn định lô kháng nguyên tinh chế loại vật liệu chứa khác đơng khơ ampoule, hàn kín giữ hàm lượng (hoạt tính) kháng nguyên độc tố PT tốt đông khô lọ Đối với thiết bị đơng khơ EPSILON - 6D có thiết kế để đóng nút lọ theo cách vừa hút chân khơng vừa đóng nút buồng đơng khơ Nếu sử dụng ampoule phải qua giai đoạn hở cách xạc khí ni tơ khơ vào buồng đơng khơ sau đưa ampoule đơng khơ ngồi để hàn thủ công Nghiên cứu sản phẩm đông khô lọ (lô PT-01), sử dụng phương pháp hút chân khơng q trình đóng nút đảm bảo độ chân khơng đóng nút khơng giữ độ ẩm tồn dư q trình bảo quản điều ảnh hưởng đến hoạt tính kháng nguyên độc tố PT Trong sản phẩm đông khô chứa ampoule hàn thủ công sau xả khí ni tơ đảm bảo độ kín giữ độ ẩm tồn dư tương đương ban đầu mức độ giảm hoạt tính PT điều kiện thời gian bảo quản không đáng kể Trong điều kiện để sản phẩm đơng khơ có độ ẩm ≤ % theo tiêu chuẩn mẫu chuẩn thứ cấp vật liệu chứa nên chọn ampoule chọn cách hút chân khơng xả khí trơ trước hàn ống Nếu đông khô mẫu chuẩn với số lượng lớn nên sử dụng loại ampoule đặc chủng cho thiết bị hàn chân không Nhật (máy hàn vắc xin BCG) 3.2.3 Khả ứng dụng lợi ích nghiên cứu sản xuất mẫu chuẩn kháng nguyên độc tố PT IVAC Với kết nghiên cứu xác lập thơng số qui trình tinh chế qui trình đơng khơ kháng ngun độc tố ho gà PT, việc thiết lập mẫu chuẩn thứ cấp kháng nguyên độc tố ho gà PT hoàn tồn khả thi có tính ứng dụng cao vì: - Có phù hợp cao trang thiết bị sẵn có nguồn kháng ngun thơ thu nhận từ canh cấy chủng ho gà BP 509 môi trường nuôi cấy đặc hiệu sinh PT với dự án sản phẩm quốc gia nghiên cứu sản xuất vắc xin ho gà vô bào - Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu làm mẫu chuẩn không yêu cầu khắt khe tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu để sử dụng pha vắc xin ho gà vô bào nên lô nghiên cứu dự án sản phẩm quốc gia có hàm lượng kháng nguyên cao chưa phép sử dụng cho người hồn tồn tận dụng để tinh chế làm nguyên liệu sản 70 xuất mẫu chuẩn thứ cấp kháng nguyên độc tố PT, tránh thất thoát lãng phí nguồn nguyên liệu nghiên cứu - Hiện mẫu chuẩn độc tố ho gà PT sử dụng công tác nghiên cứu kiểm định IVAC mẫu chuẩn quốc tế (JNIH-5), nhiên việc sử dụng mẫu chuẩn gặp nhiều khó khăn số lượng mua (hiện khơng q ống/năm), không đủ dùng cho nhu cầu nghiên cứu kiểm định, bên cạnh thủ tục mua bán phức tạp, giá thành cao, khó khăn thủ tục nhập hải quan việc vận chuyển cần phải bảo quản lạnh ảnh hưởng đến chất lượng mẫu chuẩn Do nghiên cứu sản xuất thành công mẫu chuẩn độc tố PT góp phần chủ động, thể tính sẵn sàng IVAC q trình nghiên cứu sản xuất vắc xin ho gà vô bào Đồng thời góp phần khẳng định khả sản xuất thành công vắc xin ho gà vô bào tương lai gần - Về mặt kinh tế: sở kết ban đầu nghiên cứu mở rộng cho nghiên cứu sản xuất mẫu chuẩn với qui mô lớn Và sản xuất thành công mẫu chuẩn độc tố ho gà PT với số lượng 1000 ống dùng 10 năm tới giúp làm lợi cho IVAC nói riêng nhà nước nói chung khơng phải nhập mẫu chuẩn quốc tế độc tố ho gà PT Hiện giá cho ống mẫu chuẩn quốc tế độc tố ho gà NIBSC 109 £ (bảng Anh) chưa tính chi phí vận chuyển Việt Nam, thành công tiết kiệm số tiền lớn để nhập số lượng mẫu chuẩn độc tố 71 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ❖ Kết luận Qua kết mà luận án đạt tơi rút số kết luận sau đây: Đã xác lập qui trình tách chiết tinh chế kháng nguyên độc tố ho gà PT (từ chủng BP 509) phương pháp sắc ký lực qua cột sepharose 4Bfetuin cho độ đặc hiệu cao, độ tinh tốt (75,46 %) hiệu suất tinh chế đạt 50 % Đã thiết lập qui trình đơng khô kháng nguyên độc tố ho gà PT thiết bị đông khô EPSILON - 6D - Tá chất đông khô tỉ lệ hàm lượng protein kháng nguyên với tá chất có điểm đơng tồn phần -32 oC - Đã xác định độ ẩm tồn dư liên quan đến độ kín vật liệu chứa yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm độc tố PT đơng khơ q trình bảo quản Vật liệu đông khô bảo quản độc tố ho gà PT nên dùng ampoule (ống) đặc chủng chuyên dùng cho sản phẩm đông khô Đã sản xuất sản phẩm dự tuyển mẫu chuẩn thứ cấp kháng nguyên độc tố ho gà lô PT-02 với số lượng 60 ống, có hàm lượng kháng nguyên sau tháng bảo quản nhiệt độ ≤ -20 oC 10,16 μg NP/ml Đánh giá so sánh kết bước đầu tương đương với mẫu chuẩn độc tố ho gà quốc tế JNIH-5 Mẫu chuẩn kháng nguyên thứ cấp dùng thử nghiệm in vivo ELISA, CHO/K1 thử nghiệm kết tủa miễn dịch kháng nguyên - kháng thể Ouchterlony ❖ Đề xuất Tiếp tục nghiên cứu hồn thiện qui trình tinh chế thiết lập mẫu chuẩn kháng nguyên thứ cấp độc tố ho gà PT Tiếp tục theo dõi tính ổn định lô mẫu chuẩn kháng nguyên thứ cấp độc tố ho gà PT-02 thiết lập theo thời gian bảo quản 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Đình Bồng 1998 ''Nghiên cứu hồn thiện qui trình sản xuất vắc xin ho gà qui mô bán công nghiệp Viện Vắc xin Nha Trang -Đà Lạt'' Luận án phó tiến sĩ khoa học Y dược, Hà Nội Hoàng Thị Thu Hà, Nguyễn Thùy Trâm, Phạm Thanh Hai, Lương Minh Hòa, Nguyễn Thị Anh Xn, Hồng Thị Bích Ngọc, Vũ Ngọc Hà & Đặng Đức Anh 2014 "Chẩn đoán vi khuẩn Bordetella pertussis trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng phương pháp khuếch đại gen Việt Nam" Tạp chí Y học dự phòng, Tập XXIV, Số 11 (160) Lê Đăng Hà 1994 Ho gà Bách khoa thư bệnh học, Hà Nội, Nhà xuất Trung tâm biên soạn từ điển Bách khoa Lê Văn Hiệp 1991 ''Góp phần tìm hiểu yếu tố liên quan đến độc tính cơng hiệu Vắc xin ho gà sản xuất nồi lên men'' Luận án phó tiến sĩ Y dược học Lê Văn Hiệp 1998 "Góp phần tìm hiểu yếu tố liên quan đến độc tính cơng hiệu vắc xin ho gà sản xuất nồi lên men" Tạp chí Y học dự phịng, VIII(5), pp.13-22 Lê Văn Hiệp 2004 Công nghệ sản xuất, Vắc xin ho gà Miễn dịch công nghệ, Nhà xuất Y học, Hà Nội Lê Văn Hiệp 2006 Vắc xin học, Qui trình sản xuất vắc xin ho gà, Hà Nội, Nhà xuất Y học Lê Văn Hiệp & Phan Bổn 2001, ''Kết dùng kháng huyết ho gà đơn giá đặc hiệu sản xuất Viện Vắc xin để xác định ngưng kết nguyên chủng vi khuẩn ho gà vắc xin ho gà'' Tạp chí Y học dự phịng, tập XI, số (48) Nguyễn Thị Thu Hoa 2012 ''Nghiên cứu bất hoạt nước cốt ho gà Formaldehyde sản xuất vắc xin Bạch hầu – Ho gà – Uốn ván (DPT)'' Thạc sĩ kỹ thuật Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Hà Nội 73 10 Lê Kim Hòa 1995 ''Sản xuất vắc xin BCG số nhận xét bước đầu phương pháp nuôi cấy phân tán'' Luận án Phó tiến sĩ y dược, Viện Vệ sinh Dịch tễ TW 11 Lê Văn Phủng 2002 Trực khuẩn ho gà, Vi sinh y học, Hà Nội, Nhà xuất Y học 12 Nguyễn Thị Lan Phương 2008 ''Xây dựng phương pháp đánh giá số kháng nguyên vắc xin ho gà đề xuất qui trình sản xuất vắc xin ho gà an toàn cao Viện Vắc xin Nha Trang'' Luận án tiến sỹ vi sinh y học, Viện Vệ sinh Dịch tễ TW 13 Đặng Đức Trạch 1992 Vi khuẩn ho gà, Vi sinh vật y học, Hà Nội, Nhà xuất Y học 14 Nguyễn Thị Thế Yến 1999 ''Nghiên cứu sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu – Ho gà –Uốn ván'' Luận án phó tiến sĩ khoa học Y dược, Viện Vệ Sinh dịch tễ TW, Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH 15 Arciniega JL, Hewlett EL, Johnson FD, Deforest A, Wassilak SG, Onorato IM, Manclark CR and Burns DL 1991 "Human serologic response to envelopeassociated proteins and adenylate cyclase toxin to Bordetella pertussis" The Journal of Infectious Diseases, 163, pp.135-142 16 Ashworth LA, Irons LI and Dowsett AB 1982 "Antigenic relationship between serotype-specific agglutinogen and fimbriae of Bordetella pertussis" Infection and Immunity, Vol 37, No.3, pp.1278-1281 17 Ashworth LA, Dowsett AB, Irons LI and Robinson A 1985 "The location of surface antigens of Bordetella pertussis by immuno-electron microscopy" Dev Biol Stand 61, pp.143-151 18 Austin BJ 2012 Whooping Cough Cases Increase In Texas 19 Bagley K, Abdelwahab S, Tuskan R, Fouts T and Lewis G 2002 "Pertussis toxin and the adenylate cyclase toxin from Bordetella pertussis activate human monocyte-derived dendritic cells and dominantly inhibit cytokine production through a cAMP-dependent pathway" J Leukoc Biol, 72(5), pp.962-969 74 20 Baraff LJ, Manclark CR, Cherry JD, Christenson P and Marcy SM 1989 "Analyses of adverse reactions to diphtheria and tetanus toxoids and pertussis vaccine by vaccine lot, endotoxin content, pertussis vaccine potency and percentage of mouse weight gain." The Pediatric Infectious Disease Journal, 8, pp.502-507 21 Bergey DH, Harrison FC, Breed RS, Hammer BW, and Huntoon FM 1923 Bergey’s manual of determinative bacteriology, st ed The Williams and Wilkins Co., Baltimore 22 Biken JICA 1993 "Text book for Diphtheria- Pertussis - Tetanus Combined vaccine" Biological products technology course 6/1992-3/1993 23 Brennan JM, Burns LD, Meade DB, Shahin DR and Manclark CR 1995 "Recent advances in the development of Pertussis vaccines" Vaccines: New approaches to Immunological problem, Chapter II, NewYork, pp.22-44 24 Bunrnette WN 1992 "Perspective in recombinant pertussis toxoid development" Vaccine Research and Development., Marcel Dekker New York, pp.143-93 25 Burns D 1988 "Subunit structure and enzymic activity of pertussis toxin" Microbiol Sci , (9), pp.285–7 26 Cameron J 1978 "Some problems and their solution in the production of DPT vaccine”, 15th IABS cogress: vaccination in the deverloping countries" Devolop Biol Standard, Vol 41, pp.45-53 27 Cameron J 1982 "Whooping cough: infection and disease" The Lancet, 1301, London, pp.567-582 28 Camille L, Rudy A and Dubuisson J 2001 "Bordetella pertusis, molecular pathogenesis under multiple aspects" Microbiology, Vol 4, pp.82-89 29 CDC 2000 "Pertussis Case Definition" Chapter 11 30 Cherry JD, Dorothy XL, Penny NL, Kashmira PH and JC JC Michael 2004 "Determination of serum antibody to Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin in vaccinated and unvaccinated children and in children and adults with 75 pertussis" Clinical Infectious Diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America, 38, pp.502–507 31 Cody CL, Bara LJ and Cherry JD 1981 "The rate of adverse reactions associated with DTP and DT immunization in infants and children" Pediatrics, Vol 68, pp.650-660 32 Corbel MJ, Kreeftenberg JG and Knezevic I 2004 "Who working group on Standardization and Control of Pertussis vaccine - Report of a meeting held on 6-7 May 2003, Ferney Voltaire, France" Vaccine, Vol 22, pp.293-300 33 Edwards KM and Decker MJ 2008 "Pertussis vaccines In: In: Plotkin SA, Orenstein WA, Offit PA, eds" Vaccines,, 5th, pp.468-517 34 Fujiwara H and Iwasa S 1989 "The quantitative assay of the clustering activity of the lymphocytosis-promoting factor (Pertussis toxin) of Bordetella pertussis on Chinese Hamster Ovary (CHO) cells" Journal of Biological Standardization, Vol 17, pp.53-64 35 Fumitoshi CH 1996 "Quality Assurance of vaccine" Vaccine handbook, Maruzen, Tokyo -Japan, pp.15-20 36 Granstrom M 1996 "The history of Pertussis vaccines: from whole cell to subunit vaccines" New generation vaccines, Second edition, Revised and Expanded, Mareel Dekker, Inc, NewYork - Basel - Hongkong, pp.107-13 37 Grimprel E, Guison N and Bégué P 1993 "New aspects of pertussis in France, 26 years after generalized pertussis vaccination" The Journal of biological Standardization, Vol.21, pp.5-6 38 Hage DS and Cazes J 2005 Handbook of Affinity Chromatography, Second Edition: CRC Press 39 Hewlett EL, Donato GM and Gray MC 2006 "Macrophage cytotoxicity produced by adelyte cyclise toxin from Bordetella pertussis: more than just making AMP" Molecular Microbiology, 59, pp.447-459 40 Irons LI and MacLennan AP 1979 "Isolation of the lymphocytosis promoting factor-haemagglutinin of Bordetella pertussis by affinity chromatography" Biochim Biophys Acta, 580(1), pp.175-185 76 41 Ju C, Sheu GC, Cheng Y and Lu CH 1997 "Production and Purification of Bordetella pertussis toxin" Chinese J Microbiol Immunol, (30), pp.72-83 42 Kingston HGM 2001 "Immunity to Bordetella pertussis" Microbes and Infection, Vol 3, pp.655-677 43 König CHW 2009 The immunological basis for Immunization series, Module: Pertussis 44 Kreeftenberg JG 1999 "Standardization of acellular pertussis vaccine" Biologicals, Vol 27, pp.115-117 45 Leslie PH and Gardner AD 1931 "The Phases of Haemophilus pertussis" The Journal of Hygiene, pp.432-433 46 Locht C and Antoine R 1995 "A proposed mechanism of ADP-ribosylation catalyzed by the pertussis toxin S1 subunit" Biochimie, 77 (5), pp.333–40 47 Manclark CR 1981 "Pertussis vaccine research" Bull WHO, 59, pp.93 48 Margaret P 1991 "History of the Development of Pertussis Vaccine" Develop Biol Standard, Vol 73 49 Miler E 1993 "Current epidemiology of whooping cough in UK" The journal of Biological standardization, vol 21, pp.10-11 50 Moreno-Lopez M 1952 El genero Bordetella Microbiol Espanol, 5,pp:177181 51 Nencioni L, Volpini GF and Peppoloni S 1991 "Properties of pertussis toxin mutant PT-9K/1296 after formaldehyde treatment" Infection and Immunity, pp.625-630 52 Parkhill J, Sebaihia M, Preston A, Murphy LD, Thomson N, Harris DE, Holden MT and Churcher CM 2003 "Comparative analysis of the genome sequences of Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica" Nat Genet, 35(1), pp.32-40 53 Penelope ES, Amechand B, Glen DA, Stephen AC, Michel HK and Randy JR 1994 "The crystal structure of pertussis toxin" Structure, Vol 2, pp.45-57 77 54 Perera VY 1988 "Purification of Pertussis Toxin" Method in enzymology, vol.165, pp.120-26 55 Pourahmadi A, Esmaili F, Hosseini AZ, Rezaee A, Salehi E, Akhavizadegan MA and Mirjalili A 2004 "Proliferate Resonse to Purified Bordetella pertussis Toxin on Murine Spleen Lymphocytes " Arch Razi Ins, 58, pp.63-71 56 Preston NW 1970 "Pertussis Agglutinins in the Child" Symp Series Immunobiol Standard., Vol 13, pp.120-125 57 Preston NW, Zorgani AA and Carter EJ 1990 "Location of the three major agglutinogens of Bordetella pertussis by immuno-electronmicroscopy", J Med Microbiol vol 32(1), pp.63-68 58 Rey L and May JC 2004 Freeze-Drying/Lyophilization Of Pharmaceutical & Biological Products, Second Edition: Revised And Expanded (Drugs and the Pharmaceutical Sciences) 2nd Edition 59 Rudy HT 1998 "Background production of DPT group vaccine" RIVM/BIS/VTTC, The Netheland 60 Sato H 1996 Vaccine Handbook, Tokyo, NIH- Marusen 61 Sato Y and Cowell JL 1983 "Separation and purification of hemagglutinin from Bordetella pertussis" Infection and Immunity, 1, pp.313-320 62 Sekura RD, Fish F, Manclark CR, Meade B and Zhang YL 1983 "Pertussis toxin Affinity purification of a new ADP-ribosyltransferase" The Journal of Biological Chemistry, Vol 258, pp.14647-51 63 Shahin RD, Brennan MJ, Li ZM, Meade BD and Manclark CR 1990 "Characterization of the protective capacity and immunogenicity of the 69-kD outer membrane protein of Bordetella pertussis" The Journal of Experimental Medicine, 171, pp.63-73 64 Shimadzu 1996 Introduction to HPLC,LC World Talk Special Issue Volume 65 Skelton SK and Wong KH 1990 "Simple, Efficient Purification of Filamentous Hemagglutinin and Pertussis Toxin from Bordetella pertussis by Hydrophobic 78 and Affinity Interaction" Journal of Clinical Microbiology, Vol.28, pp.10621065 66 Savage JV, Decker MD, Edwards KM, Sell SH and Karzon DT 1990 "Natural history of pertussis antibody in the infant and effect on vaccine response" The Journal of Infectious Diseases, 161, pp.487–492 67 Stainer DW and Scholte MJ 1971 "A simple chemically defined medium for the production of phase Bordetella pertussis" J Gen Microbiol, 63, pp.211220 68 Weiss A 1997 "Mucosal Immune defenses and the responce of Bordettella Pertussis" ASM News, vol 63, pp.25 69 WHO/BS/03.1978 2003 Collaborative study Evaluation of Proposed International Standard of Pertussis Toxin code JNIH-5 70 WHO/IVB/11.03 2011 WHO manual for the establishment of national and other secondary standards for vaccines 71 WHO/TRS/No 800 1990 Guidelines for the preparation, characterization and establishments of international and other standards and reference for biological substances 72 WHO/TRS/No 878 1998 Guidelines for the production and control of the acellular pertussis component of monovalent or combined vaccines 73 WHO/EPI/GEN/93.14 2010 The immunological basis for immunization series: module 4: pertussis - update 2009 74 WHO/TRS/No 932 2006 Recommendations for the preparation, characterization and establishment of international and other biological reference standards (revised 2004) 75 Yeh SH 2003 "Pertussis: persistent pathogen, imperfect vaccines" Expert Rev Vaccines,, 2(1), pp.113-127 79 CÁC BẢNG PHỤ LỤC Phụ lục 1: OD280 lần tinh chế Lần tinh chế Phân đoạn OD280 Phân đoạn OD280 Phân đoạn OD280 Phân đoạn OD280 0,000 25 0,936 49 0,015 73 1,042 0,001 26 0,932 50 0,013 74 1,123 0,001 27 0,93 51 0,012 75 0,918 0,000 28 0,929 52 0,011 76 0,794 0,000 29 0,927 53 0,008 77 0,662 0,001 30 0,935 54 0,006 78 0,44 0,002 31 0,923 55 0,003 79 0,293 0,004 32 0,927 56 0,005 80 0,113 0,017 33 0,926 57 0,003 81 0,098 10 0,032 34 0,932 58 0,002 82 0,075 11 0,103 35 0,931 59 0,001 83 0,032 12 0,218 36 0,926 60 84 0,018 13 0,307 37 0,821 61 85 0,008 14 0,395 38 0,612 62 86 0,006 15 0,491 39 0,437 63 0,001 87 0,002 16 0,583 40 0,233 64 0,002 88 0,002 17 0,698 41 0,116 65 0,001 89 0,003 18 0,801 42 0,088 66 0,002 90 0,002 19 0,912 43 0,041 67 0,008 91 0,000 20 0,914 44 0,043 68 0,076 92 0,000 21 0,922 45 0,032 69 0,115 93 22 0,926 46 0,021 70 0,357 94 23 0,931 47 0,011 71 0,522 95 24 0,934 48 0,017 72 0,886 / / Lần tinh chế Phân đoạn OD280 Phân đoạn OD280 Phân đoạn OD280 Phân đoạn OD280 0,000 25 1,141 49 0,007 73 0,802 0,000 26 1,142 50 0,005 74 0,714 0,001 27 1,146 51 0,004 75 0,602 0,000 28 1,139 52 0,003 76 0,431 0,000 29 1,131 53 0,003 77 0,273 0,000 30 1,133 54 0,005 78 0,152 0,001 31 1,139 55 0,007 79 0,106 0,002 32 1,131 56 0,008 80 0,094 0,009 33 1,128 57 0,000 81 0,066 10 0,058 34 1,132 58 0,004 82 0,063 11 0,133 35 1,131 59 0,001 83 0,053 12 0,298 36 1,136 60 0,003 84 0,041 13 0,357 37 1,139 61 0,002 85 0,033 14 0,595 38 0,978 62 0,001 86 0,015 15 0,761 39 0,731 63 0,000 87 0,012 16 0,862 40 0,448 64 0,004 88 0,008 17 0,969 41 0,277 65 0,001 89 0,005 18 1,101 42 0,119 66 0,002 90 0,004 19 1,122 43 0,092 67 0,068 91 0,000 20 1,134 44 0,086 68 0,126 92 0,000 21 1,122 45 0,029 69 0,263 93 0,000 22 1,126 46 0,030 70 0,563 94 0,000 23 1,131 47 0,016 71 0,886 95 0,000 24 1,134 48 0,008 72 1,042 / / Lần tinh chế Phân đoạn OD280 Phân đoạn OD280 Phân đoạn OD280 Phân đoạn OD280 0,000 25 1,051 49 0,028 73 0,695 0,001 26 1,054 50 0,017 74 0,789 0,000 27 1,052 51 0,011 75 0,862 0,000 28 1,055 52 0,009 76 0,988 0,000 29 1,054 53 0,008 77 0,770 0,000 30 1,058 54 0,005 78 0,585 0,005 31 1,053 55 0,004 79 0,428 0,009 32 1,053 56 0,003 80 0,331 0,028 33 1,067 57 0,002 81 0,172 10 0,043 34 1,074 58 0,001 82 0,096 11 0,128 35 1,075 59 0,000 83 0,047 12 0,256 36 1,087 60 0,000 84 0,012 13 0,437 37 1,030 61 0,001 85 0,005 14 0,556 38 0,804 62 0,001 86 0,007 15 0,674 39 0,522 63 0,000 87 0,006 16 0,810 40 0,401 64 0,000 88 0,002 17 0,916 41 0,203 65 0,000 89 0,001 18 0,995 42 0,123 66 0,000 90 0,000 19 1,018 43 0,087 67 0,035 91 0,002 20 1,016 44 0,074 68 0,063 92 0,001 21 1,023 45 0,061 69 0,097 93 0,000 22 1,029 46 0,062 70 0,156 94 0,000 23 1,034 47 0,042 71 0,317 95 0,000 24 1,043 48 0,036 72 0,439 / / Phụ lục 2: Đệm PBS 0,01M pH 7,2 (Thành phần cho lít) NaCl 8, 015 g Na2HPO4 2H2O 1,779 g KH2PO4 0,408 g Nước cất vừa đủ lít Chỉnh pH 7,2 Phụ lục 3: Đệm Sodium acetate, pH = 5,5 (Thành phần cho lít) Sodium acetate khan 90,2g Nước cất vừa đủ lít Chỉnh pH 5,5 Phụ lục 4: Đệm pha kháng nguyên (Thành phần cho lít) Đệm BPS pH 7,2 1lít BSA 5g Tween 80 0,5 ml Phụ lục 5: Cơ chất TMB (Dùng cho phiến ELISA) Nước cất 9ml Đệm acetate, pH = 5,5 1ml TMB/Ethanol 0,167ml Oxy già 30% l Phục lục 6: Dung dịch rửa phiến (Thành phần cho lít) Nước cất lít Tween 80 0,5 ml ... nghiên cứu ho? ?n thiện qui trình tinh chế thiết lập mẫu chuẩn kháng nguyên thứ cấp độc tố ho gà PT - Tiếp tục theo dõi tính ổn định lơ mẫu chuẩn kháng nguyên thứ cấp độc tố ho gà PT- 02 thiết lập. .. độc tố ho gà PT (Pertussis Toxin) - Nghiên cứu thiết lập mẫu chuẩn thứ cấp kháng nguyên độc tố ho gà PT dạng đông khô Để thực mục tiêu trên, thực nội dung sau: - Nghiên cứu tách chiết tinh chế kháng. .. kháng nguyên độc tố ho gà từ nguyên liệu canh cấy thô sản xuất vắc xin ho gà vô bào IVAC - Đông khô thử nghiệm độc tố ho gà tinh chế để tạo mẫu chuẩn thứ cấp kháng nguyên độc tố ho gà PT dạng