Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC • • B ộ Y TÉ Dược HÀ NỘI -if if— • • LÊ THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẩ N ACID CHLOROGENIC TỪ KIM NGÂN HOA PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG THUố C LUẬN VĂN THẠC s ĩ DƯỢC HỌC • • • • Chuyên ngành : Kiểm nghiệm thuốc - độc chất Mã số : 60 73 15 Nguòi hng dẫn khoa học: TS Đồn Cao Son TS Trần Hồng Anh óH HÀ NỘI - 2010 bSl LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tơi xin chân thành cảm ơn TS Đồn Cao Son TS Trần Hồng Anh, người thầy tận tình, trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: TS Trần Việt Hùng - Khoa Vật lý đo lường, ThS Lục Thị Vân - Khoa Kiểm nghiệm dạng bào chế, ThS Nguyễn Tuấn Anh - Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương, nhiệt tình quan tâm, giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng quản lý sau Đại học, thầy giáo Trường Đại học Dược Hà nội, bạn đồng nghiệp khoa Kiêm nghiệm dạng bào chế, khoa Kiểm nghiệm Đông dược, khoa Vật lý đo lường Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương, cán Trung tâm Dược điên Dược thư Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi, động viên, giúp đỡ, san sẻ công việc góp ý kiến cho tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình bạn bè động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập trình thực luận văn Ds LÊ THỊ THU HIỀN MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN CÁC KÝ HIỆU, ♦ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN • VĂN DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC • CÁC HÌNH VẼ,7ĐỒ THỊ• TRONG LUẬN • VĂN ĐẶT VẤN ĐÈ CHƯƠNG - TỒNG QUAN 1.1 Chất chuẩn sử dụng chất chuẩn 1.1.1 Chất chuẩn đối chiếu hóa học 1.1.2 Các thông tin chuẩn acid chỉorogenic 1.2 Tống quan ve acid chlorogenic dược liệu Kim ngân hoa 1.2.1 Tổng quan acid chỉorogenic 1.2.2 Tồng quan dược liệu Kim ngân hoa 1.3 Một số qui trình phân lập tinh chế acid chlorogenic nghiên cứu 1.4 Phương pháp phân lập tinh chế sắc ký cột 1.4.1 Phương pháp sắc kỷ cột silica gel 1.4.2 Sắc ký loại trù' theo kích cỡ ứng dụng tỉnh chế acid chlorogenic 12 1.5 Phưong pháp định tính, định luọng xác định cấu trúc phân t ủ 15 1.5.1 Định tính xác định độ tình khiết điểm chảy - M P 15 1.5.2 Định tính phố hồng ngoại - I R 16 1.5.3.Định tính, định lượng họp chất đặc trưng dược liệu, sản phẩm q trìnlí chiết xuất, phân lập tinh chế từ dược liệu sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC) 16 1.5.4 21 Phương pháp xác định cấu trúc plíân tủ' CHƯƠNG - NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 24 2.1 Nguyên liệu 24 2.2 Phương tiện nghiên cứu 24 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 24 2.2.2 Hoá chất, dung môi 25 2.3 Nội dung nghiên cứu 26 2.4 Phương pháp nghiên cứu 26 2.4.1 Kiếm nghiệm dược liệu Kim ngân hoa dùng đế nghiên cứu 26 2.4.2 Phương pháp chiết xuất acid chỉorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa 27 2.4.3 Phăn lập tinh chế acid chỉorogenic phương pháp sắc kỷ cột 27 2.4.4 Các phương pháp định tính, định lượng xác định cấu trúc acid chỉorogenỉc 27 CHƯƠNG - THỤC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ 31 3.1 Kiếm nghiệm dưọc liệu Kim ngân hoa 31 3.1.1 Định tỉnh dược liệu Kim ngân hoa 31 3.1.2 Địnlt tính, địnlĩ lượng acid chíorogenic dược liệu Kim ngân hoa 33 3.2 Chiết xuất acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa 35 3.2.1 Lựa chọn dung môi chiết phương pháp chiết 35 3.2.2 Tiến hành chiết xuất 35 3.2.3 Định tính acid chỉorogenic cao đặc cắn C1 phương pháp TLC 36 3.2.4 Định lượng acid chỉorogenic cắn C1 38 3.3.Qui trình phân lập acid chlorogenic sắc ký cột silica g e l 40 3.3.1 Kỹ thuật phân lập 40 3.3.2 Kết phân lập acid cỉtỉorogenic sắc kỷ cột silica gel 41 3.4 Tinh chế acid chlorogenic sắc ký cột Sephadex 45 3.4.1 Kỹ thuật tinh chế 45 3.4.2 Kết tinh chế acid chỉorogenic sắc kỷ cột Sephadex G15 46 3.4.3 Kết tỉnh chế acid chỉorogenic sắc kỷ cột Sephadex GIO 49 3.5 Định tính, xác định cấu trúc, định lưọìig xác định tạp chất liên quan acid chlorogenic tinh chế 53 3.5.1 Đặc điểm hình thái 53 3.5.2 Đo nhiêí tính xác đinh đơ• tinh khiết • • nóng o chảy để đinh • • 53 3.5.3 Đinh tỉnh acid chỉorogetiic phương pháp sắc kỷ lớp mỏng 54 3.5.4 Định tính acid chlorogenic phương plĩáp đo hồng ngoại 55 3.5.5 Định tính acid chlorogenỉc tinh chế phương pháp H P L C 56 3.5.6 Xác định cẩu trúc acid chlorogenỉc tinh chế 58 3.5.7 Định lượng acid chlorogenỉc tinlĩ chế phương plĩáp HPLC 62 3.5.8 Xác định tạp chất liên quan acid chỉorogenic tinh chế 66 3.6 Thẩm định phưoìig pháp HPLC sử dụng đế định lượng acid chlorogenic tinh chế 68 3.6.1 Xác định tính đặc lĩiệu 69 3.6.2 Khoảng tuyến tính 70 3.6.3 Độ lặp lại 71 3.6.4 Độ 71 3.6.5 Xác định LOD 73 3.6.6 Xác định LOQ 74 3.7 Xây dựng tiêu chuẩn dự thảo cho chất chuẩn phòng thí nghiệm 74 3.8 Sử dụng acid chlorogenic tinh chế đưọc làm chất chuẩn PTN để định tính, định lưọng acid chlorogenic mẫu dưọc liệu Kim ngân hoa 77 3.8.1 Định tính acid chlorogenỉc trongdược liệu Kim ngân h o a 77 3.8.2 Định lượng acid chỉorogenỉc dược liệu Kimngân hoa 80 3.8.3 Xác định độ ấm dược liệu 82 CHƯƠNG - BÀN LUẬN VÈ KÉT QƯẢ 83 KỂT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO 88 PHỤ LỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN 13c NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Cacbon - 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 'H NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 'H-'H c o s y 'H -’H Chemical Shift Coưelation Spectroscopy 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two - Dimensional NMR DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ESI-MS Phổ khối lượng phun điện tử Electron Spray Ionization Mass Spectrometry HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence HSQC Heteronuclear Singular Quantum Coherence IR Infrared Phổ hong ngoại TLC Thin layer chromatography Sac ký lóp mỏng HPLC High performance liquid chromatography Sác ký lỏng hiệu cao HSPL Hệ số pha loãng MS Mass spectrum PA Pure analysis ISO International organization for standardization IEC International electrotechnical commision c Chuẩn I T Thử C+T Chuẩn + Thử DĐVN III Dược điển Việt Nam III RSD Relative Standard deviation SD Standard deviation TB Trung bình uv Ultraviolet VIS Visible Bảng 1.1 Hàm lượng acid chlorogenic số loại Bảng 1.2 Hàm lượng acid chlorogenic phân bố số phận Kim ngân Bảng 1.3 Khả tách lọc số loại gel Sephadex 13 Bảng 3.4 Kết định lượng acid chlorogenic dược liệu Kim ngân hoa đem nghiên cứu 34 Bảng 3.5 Kết chiết xuất mẻ dược liệu 36 Bảng 3.6 Giá trị Rj màu sắc vết sắc ký cao đặc C1 37 Bảng 3.7 Hàm lượng acid chlorogenic can C1 thu sau giai đoạn chiết xuất 38 Bảng 3.8 Khối lượng cắn Si thu sau giai đoạn phân lập cắn C1 qua cột silica gel 42 Bảng 3.9 Hàm lượng acid chlorogenic cắn Si thu sau giai đoạn phân lập can Cl qua cột silica gel 43 Bảng 3.10 Khối lượng cắn Sel thu sau tinh chế can Si qua cột Sephadex G I5 48 Bảng 3.11 Ket định lượng acid chlorogenic cắn Sel thu sau giai đoạn tinh chế cắn Si qua cột Sephadex GI 49 Bảng 3.12 Khối lượng cắn Se2 thu sau tinh chế can Sel qua cột Sephadex GIO 51 Bảng 3.13 Kết đo nhiệt độ nóng chảy acid chlorogenic tinh chế 53 Bảng 3.14 Kêt phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) sản phâm tinh chế 60 Bảng 3.15 Kết khảo sát tính thích họp hệ thống sắc ký định lượng acid chlorogenic tinh chế 64 Bảng 3.16 Kết định lượng acid chlorogenic tinh chế theo chuẩn 65 Bảng 3.17 Kết định lượng acid chlorogenic tinh chế theo chuẩn 66 Bảng 3.18 Kết xác định hàm lượng tạp chất liên quan acid chlorogenic tinh chế 68 Bảng 3.19 Kết xác định khoảng tuyến tính 70 Bảng 3.20 Kết khảo sát độ lặp lại 71 Bảng 3.21 Kết xác định độ 72 Bảng 3.22 Kết xác định LOD cho phép định lượng 73 Bảng 3.23 Giá trị Rf màu sắc vết sắc ký dịch chiết dược liệu Kim ngân hoa 78 Bảng 3.24 Kết định lượng acid chlorogenic mẫu dược liệu Kim ngân hoa 82 CHLOROGENIC-DMSO-HMBC A.CHLOROGENIC-DMSO-HMBC C u r r e n t D a ta P a r a m e te r s NAME A.CHLORO G EN IC EXPNO PROCNO F2 - A c q u i s i t i o n P a r a m e te r s D a te 20080723 T im e INSTRUM av500 PROBHD mm M u l t i n u c l cosygpqf PULPROG TD 2048 SOLVENT DMSO NS 16 DS SWH 0 0 Hz F ID R E S 4 Hz AQ 0 s e c RG 256 DW 0 0 u s e e DE 0 u s e e TE 3 K 0 0 0 0 s e c D1 8 9 s e c d l3 0 0 0 0 s e c D 16 0 0 0 s e c INO 0 0 0 0 s e c MCREST 0 0 0 0 s e c MCWRK 8 9 s e c PWnMMPT fn Vw.rLrUNINHilj J_ - s 1H 1 1 - 0 0 2 NUC1 PO PI PL1 SFO l GPNAM1 GPNAM2 GPX1 GPX2 GPY1 GPY2 G PZ1 G PZ2 P16 usee usee dB MHz S IN E 100 S I N E 0 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 0 u s e e F I - A c q u is it io n p a m e te rs NDO TD 160 SFO l 0 3 MHz F ID R E S 0 0 Hz sw 9 pp m FnMODE QF ppm F2 SI SF WDW SSB LB GB PC P ro c e s s in g p a m e te rs 1024 0 0 4 MHz S IN E 0 0 Hz FI SI MC2 SF WDW SSB LB GB P ro c e s s in g p a m e te rs 1024 QF 0 0 MHz S IN E 0 0 Hz C u rre n t D a ta P a r a m e te r s NAME A CHLORO G EN IC EXPNO PROCNO F2 - A c q u i s i t i o n P a r a m e t e r s 20080723 D a te _ T im e INSTRUM av500 PROBHD mm M u l t i n u c l cosygpqf PULPROG TD 2048 SOLVENT DMSO 16 NS DS 0 0 Hz SWH 4 Hz F ID R E S 0 s e c AQ 256 RG DW 100.000 u s e e 6.00 u s e e DE TE 3 K 0 0 0 0 s e c D1 8 9 s e c 0 0 0 0 s e c d l3 0 0 0 s e c D 16 0.0 0 0 0 s e c INO MCREST sec 8 9 s e c MCWRK 0.00000000 CHANNEL f l NUC1 P0 PI PL1 SFO l — — 1H 1 u s e e 1 u s e e - 0 dB 0 2 MHz = = = = = = GRADIENT CHANNEL GPNAM1 S I N E 0 GPNAM2 S IN E 00 GPX1 0 GPX2 0 GPY1 0 GPY2 0 G PZ 1 0 G PZ 0 P16 0 0 % % % % % % usee F I - A c q u is itio n p a m e te rs ND0 TD 160 SFO l 0 3 MHz F ID R E S 0 0 Hz 9 ppm FnMODE QF sw 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 ppm F2 SI SF WDW SSB LB GB PC P ro c e s s in g p a m e te rs 1024 0 0 4 MHz S IN E 0 0 Hz FI SI MC2 SF WDW S SB LB GB P ro c e s s in g p a m e te rs 1024 QF 0 0 MHz S IN E 0 0 Hz C XI BRÚ K ỆR C u rre n t D a ta P a r a m e te r s NAME A C H LO R O G EN IC EXPNO PROCNO A.CHLOROGENIC-DM SO-COSYGP C >