Nghiên cứu công nghệ vi sinh chuyển hóa phytosterol đến androstendion (AD) và 9 alpha hydroxy AD sử dụng trong công nghiệp hóa dược

“Nghiên cứu công nghệ vi sinh chuyển hóa phytosterol đến androstendion AD và 9alpha-hydroxy AD sử dụng trong công nghiệp hóa- dược” Cơ quan chủ trì: Viện Hóa học Viện Khoa học và Công

“Nghiên cứu công nghệ vi sinh chuyển hóa phytosterol đến androstendion (AD)

và 9alpha-hydroxy AD sử dụng trong công nghiệp hóa- dược”

Cơ quan chủ trì: Viện Hóa học

Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam

Chủ nhiệm: PGS.TS Lưu Đức Huy

8176

HÀ NỘI – 6/ 2010

THÔNG TIN TÓM TẮT VỀ NHIỆM VỤ

1.Tên nhiệm vụ: “Nghiên cứu công nghệ vi sinh chuyển hóa phytosterol đến

androstendion (AD) và 9alpha-hydroxy AD sử dụng trong công nghiệp hóa- dược”

2.Mã số:

3.Thời gian thực hiện: 6/2007- 6/2010

4.Cơ quan thực hiện:

Phía Việt nam:

Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam

Địa chỉ: 18- Hoàng Quốc Việt- Cầu Giấy- Hà Nội

Trung tâm kỹ thuật sinh học, Viện HL KH LB Nga

Địa chỉ: Prosp 60 let Oktyabrya 7 kor.1, Moscow, 117312 Russian Federation

Phía Việt nam: PGS TS Lưu Đức Huy

Viện Hóa học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam

Phía LB Nga: TS Andryushina V.A

Trưởng phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh steroid- TT kỹ thuật sinh học – Viện HL KH LB Nga

6.Mục tiêu nhiệm vụ:

- Có được công nghệ tiên tiến chỉ một vài cường quốc KHCN có, rất cần thiết cho công nghiệp sản xuất thuốc steroid từ nguyên liệu mới phytosterol mà Việt Nam hiện tại không thể tự nghiên cứu, đó là 02 công nghệ vi sinh chuyển hoá phytosterol đến androstenedione (AD) và từ AD đến 9alpha- OH AD

- Làm cho sterol dồi dào thế mạnh của Việt nam trở thành nguyên liệu số 1 tổng hợp các loại thuốc steroid thay thế diosgenin và solasodin không có sức cạnh tranh

vì phải trồng trên đất nông nghiệp nhiều năm là mục tiêu chung

-Đào tạo chuyên gia về khoa học công nghệ hoá- dược steroid và CNSH vi sinh steroid dược phẩm

7 Danh sách cán bộ khoa học tham gia chủ chốt :

Phía Việt nam:

Họ và tên Học hàm, học vị

Chuyên môn

Cơ quan

1 Lưu Đức Huy PGS TS NCVC Viện Hóa học

2 Nguyễn Thị Diệp Ths.NCV Viện Hóa học

5 Trương Nam Hải PGS TS NCVC Viện Công nghệ sinh học

6 Nguyễn Thị Quý Ths.NCV Viện Công nghệ sinh học

7 Phạm Thị Bích Hợp TS.NCVC Viện Công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN

Thay mặt tập thể cán bộ khoa học thực hiện đề tài, chúng tôi xin cảm ơn chân thành Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam, Viện Hóa học, tất cả các cơ quan chức năng ban ngành đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và cần thiết

để đề tài được triển khai đạt kết quả tốt và hoàn thành đúng hạn

Xin chân thành cảm ơn Trung tâm Kỹ thuật sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga , đặc biệt là các cán bộ khoa học TS Andryushina A.V., TS Voyshvillo N.E, TS Savinova T.S và TS Rodina N.E đã phối hợp chặt chẽ và trực tiếp với phía Việt nam

để hoàn thành tốt các nhiệm vụ đặt ra

Xin chân thành cảm ơn Viện CNSH, Viện KHCNVN đứng đầu là PGS.TS Trương Nam Hải đã phối hợp chặt chẽ cùng chúng tôi để hoàn thành tốt Nhiệm vụ đúng hạn

Đề tài đã nhận được tài trợ toàn b ộ của Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo

dự án với LB Nga 2007-2010, Mã s ố………. Ban chủ nhiệm đề tài xin ghi nhận

và chân thành cảm ơn!

Chủ nhiệm

PGS.TS Lưu Đức Huy

MỤC LỤC PHẦN A: BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT ĐỀ TÀI

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

LỜI MỞ ĐẦU……….1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 3

1.1.Vài nét về sản xuất, nhu cầu tiêu thụ dược phẩm gốc steroid, trên thế giới 3

1.2 Giới thiệu về sterol 4

1.3.Chuyển hóa vi sinh sterol đến 17-cetosteroid và ….:……… 6

1.3.1.Tình hình nghiên cứu ngoài nước:……… ….6

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước……… 8

1.4.Thu hồi, tinh chế phytosterol từ phế phụ thải công nghiệp:……… 9

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước:……….9

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan đến Nhiệm vụ:……… 9

1.4.2.1.Tình hình nghiên cứu, sản xuất và tiêu thụ dược phẩm steroid trong nước ………

.9 1.4.2.2.Nghiên cứu của chủ nhiệm & Cs liên quan đến Nhiệm vụ:……… 11

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 13

2 1 Phương pháp nghiên cứu sterol ……… 13

2.1.1.Chiết suất sterol : 13

2.1.2.Các phương pháp phân tích sterol ………… ………14

2.2.Phương pháp vi sinh phân cắt chọn lọc mạch nhánh hỗn hợp sterol đến 17-cetosteroid :………18

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC ……… 20

3.1.Tiếp nhận và hoàn thiện 02 công nghệ vi sinh sản xuất Androstendion (CN1) và 9α

- hydroxy Androstendion (CN2) quy mô phòng thí nghiệm từ Trung tâm Kỹ thuật sinh

học- Viện HL KH LB Nga……….20

3.2.Triển khai kiểm tra CN1 và CN2 trên fermentor 5,0 lít……… 28

3.3 Triển khai CN2 chuyển hoá vi sinh AD đến 9α - OH AD trên fermentor pilot 80 L do Mỹ sản xuất:……… 39

3.4 Triển khai lặp lại CN2 chuyển hoá vi sinh AD đến 9α - OH AD lên quy mô pilot 80 L………44

3 5.Nghiên cứu lắp đặt và triển khai công nghệ quy mô 50 L chiết xuất tinh chế phytosterol từ phụ thải công nghiệp tinh luyện dầu đậu tương………48

3.6 Phân tích giám định các sản phẩm bằng các phương pháp phổ: 63

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ KHÁC……….67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……….69

TÀI LIỆU THAM KHẢO……….… 72 PHẦN B:PHỤ LỤC ( Đóng thành cuốn riêng):

Không đánh số trang, được bố trí theo thứ tự

• Đề cương và Hợp đồng

• Công nghệ 1 vi sinh sản xuất Androstendion ( AD) từ hỗn hợp phytosterol

• Công nghệ 2 vi sinh sản xuất 9alpha- hydroxy Androstendion (9α-OH AD) từ AD

• Các tài liệu về kết quả phân tích các sản phẩm phytosterol, AD và 9α- OH AD

• Sao lục các phổ

• Các báo cáo khoa học của đơn vị phối hợp- Viện CNSH

• Các công bố khoa học liên quan

• Minh chứng các kết quả đào tạo

• Báo cáo thống kê kết quả thực hiện đề tài

• Báo cáo tóm tắt ( 02 tr.) kết quả thực hiện đề tài ( tiếng Việt và tiếng Anh)

• Báo cáo quyết toán tài chính đề tài

• Biên bản kiểm tra định kỳ của Bộ KH & CN

• Công văn của Bộ KH & CN cho phép điều chỉnh nội dung và kinh phí đề tài

CÁC TÀI LIỆU KÈM THEO:

-Quyết định thành lập hội đồng nghiệm thu cấp cơ sở

-Biên bản cuộc họp hội đồng cấp cơ sở

-Phiếu nhận xét- GS TSKH Trần Văn Sung

-Phiếu nhận xét- PGS TS Lê Mai Hương

-Phiếu nhận xét- PGS TS Nguyễn Văn Tuyến

-Phiếu nhận xét- PGS TS Nguyễn Hải Nam

-Phiếu nhận xét- PGS TS Phan Minh Giang

-Phiếu nhận xét- TS Trần Văn Thanh

-Phiếu nhận xét- TS Đỗ Quốc Việt

-Giấy xác nhận đã hoàn thiện, chỉnh sửa Hồ sơ của Hội đồng nghiệm thu cấp cơ sở

-Quyết định thành lập hội đồng nghiệm thu cấp nhà nước

-Biên bản cuộc họp hội đồng cấp nhà nước

-Giấy xác nhận đã hoàn thiện, chỉnh sửa Hồ sơ của Hội đồng nghiệm thu cấp nhà nước -Giấy chứng nhận của Cục trưởng cục thông tin khoa học và công nghệ quốc gia……

Các tài liêu sau Bộ KH & CN lưu giữ, không yêu cầu đưa vào Hồ sơ:

- Phiếu nhận xét – GS TSKH Nguyễn Thu Vân – Chủ tịch Hội đồng

- Phiếu nhận xét – GS TS Phạm Thanh Kỳ- Phó chủ tịch Hội đồng

-Phiếu nhận xét – GS TSKH Phan Tống Sơn- Phản biện

-Phiếu nhận xét- PGS TS Nguyễn Thị Hoài Trâm- Phản biện

-Phiếu nhận xét- PGS TS Lê Mai Hương

-Phiếu nhận xét- PGS TS Vũ Đào Thắng

-Phiếu nhận xét- TS Dương Văn Hợp

-Phiếu nhận xét- DS CK2 Nguyễn Huy Văn

-Phiếu nhận xét- TS Trần Khắc Vũ

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AD: Androstenedione: Androstendion

ADD: Androstadienedione : Androstadiendion

9α- OH AD: 9-alpha hydroxy androstendion

Viện HL KH LB Nga: Viện Hàn lâm Khoa học Liên bang Nga

Bộ KH & CN: Bộ Khoa học và Công nghệ

TLTK: Tài liệu tham khảo

Viện KHCNVN: Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam

TGĐ: Tổng giám đốc

Cty: Công ty

HPLC: High performance liquid chromatography: Phương pháp sắc ký lỏng cao áp

TLC: Thin layer chromatography : Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Đnc : Điểm chảy

NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

MS: Mass spectrometry : Phổ khối lượng

IR: Infrared spectroscopy :Phổ hồng ngoại

UV: Phổ tử ngoại

CN: Công nghệ

Ph- VN: Mẫu phytosterol Việt nam, sản phẩm của Phòng thí nghiệm Hoá học Steroid và Alkaloid- Viện Hoá học - Viện KHCNVN

Ph-No1: Mẫu phytosterol nước ngoài 1

Ph-No2: Mẫu phytosterol nước ngoài 2

L : Lít

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1- Môi trường nhân giống và chuyển hoá của chủng Mycobacterium neoaurum

………21

Bảng 2- Môi trường nhân giống và chuyển hoá của chủng vi sinh Rhodococcus…- erythropolis………22

Bảng 3- Kết quả định lượng sản phẩm AD sau khi lên men quy mô 5 L 31

Bảng 4- Kết quả định lượng sản phẩm 9α-OH AD sau khi lên men quy mô 5 L 36

Bảng 5- Kết quả định lượng sản phẩm 9α- OH AD sau khi lên men quy mô 80 L 41

Bảng 6- Kết quả định lượng sản phẩm 9α-OH AD quy mô 80 L 46

Bảng 7- Mô tả các chi tiết, các bộ phận và xuất xứ c ủa reactor………49

Bảng 8- Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân lên hiệu suất thu hồi phytosterol…….……51

Bảng 9- Ảnh hưởng của thời gian thủy phân lên hiệu suất thu hồi phytosterol………52

Bảng 10- Ảnh hưởng của độ kiềm lên hiệu suất thu hồi phytosterol………53

Bảng 11- Ảnh hưởng nhiệt độ, dung môi kết tinh lên hiệu suất kết tinh thu hồi phytosterol quy mô phòng thí nghiệm………54

Bảng 12- Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân quy mô pilot lên hiệu suất thu hồi phytosterol……… 55

Bảng 13- Ảnh hưởng của thời gian thủy phân lên hiệu suất thu hồi phytosterol quy mô 50 lít………56

Bảng 14- Ảnh hưởng của độ kiềm lên hiệu suất thu hồi phytosterol quy mô 50 L……….57

Bảng 15- Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ, dung môi kết tinh lên hiệu suất tinh chế kết tinh hỗn hợp phytosterol quy m ô 50 L……….…59

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

Hình 1- Cấu trúc một số sterol điển hình………5

Hình 2- Sắc đồ HPLC của một hỗn hợp phytosterol điển hình 15

Hình 3- Phổ HPLC của sản phẩm AD độ tinh sạch ~ 100% 27

Hình 4- Phổ HPLC của sản phẩm 9α - OH AD độ tinh sạch ~ 100% 27

Hình 5- Kết quả định tính sản phẩm AD ở nồi 5 L và bình tam giác 500 ml……… 30

Hình 6- Sắc ký đồ HPLC của chất chuẩn AD 32

Hình 7- Sắc ký đồ HPLC của sản phẩm AD thô mẻ 5 lít……… 33

Hình 8- Sắc ký đồ HPLC của sản phẩm AD tinh chế mẻ 5 lít……… 33

Hình 9- Định tính sản phẩm 9α -OH AD ở fermentor 5 L và bình tam giác 500 ml 35

Hình 10- Sắc ký đồ HPLC của chất chuẩn 9α -OH AD 37

Hình 11- Sắc ký đồ HPLC của sản phẩm thô 9α -OH AD 38

Hình 12- Sắc ký đồ của sản phẩm tinh chế 9α -OH AD 38

Hình 13- Kết quả định tính sản phẩm 9α -OH AD ở nồi 80 L 41

Hình 14- Sắc ký đồ của chất chuẩn 9α -OH AD 42

Hình 15- Sắc ký đồ của sản phẩm thô 9α -OH AD quy mô 80 lít- lần 1 43

Hình 16- Sắc ký đồ HPLC của sản phẩm 9α -OH AD quy mô 80 lít-1 43

Hình 17- Kết quả định tính dịch lên men ở nồi 80 L-2 bằng sắc ký bản mỏng 45

Hình 18A- HPLC 9α -OH AD ( 128 g) sau tinh chế 99,24% 47

Hình 18B- HPLC 9α -OH AD ( 20g) sau tinh chế 96,12% 47

Hình 19- Sơ đồ thiết kế & hình ảnh nồi phản ứng 50 lít……… 50

Hình 20- Phổ IR của hỗn hợp phytosterol 64

Hình 21- Phổ HPLC của hỗn hợp phytosterol……….65

Hình 22- Phổ MS của thành phần β - Sitosterol 65

Hình23- Phổ MS của thành phần Stigmasterol 66

Hình 24- Phổ MS của thành phần Campesterol 66

DANH MUC CÁC SƠ Đ Ồ

Sơ đồ 1- Chuyển hoá hỗn hợp sterol đến các loại thuốc gốc steroid……… 8b

Sơ đồ 2- Sơ đồ thiết kế nồi phản ứng 50 L thu hồi chiết tách phytosterol……….….50

Sơ đồ 3- Sơ đồ tóm tắt quy trình công nghệ quy mô 50 L chiết tách phytosterol

từ phụ thải CN dầu đậu tương……… 62

Chương I TỔNG QUAN I.1 Vài nét về sản xuất, nhu cầu tiêu thụ dược phẩm gốc steroid, đặc biệt là hocmon cocticoid trên thế giới:

-Trên thế giới các dược phẩm gốc steroid, nhất là hocmôn cocticoid bắt đầu được sản xuất từ những năm 1950 thế kỉ trước Qui mô lớn nhất sản xuất hocmôn steroid tổng hợp là ở Mỹ Tại Mỹ, năm 1990 tiêu thụ các dược phẩm cocticoid là 400 triệu

đô la chiếm hơn 7% so với các dược phẩm nói chung Trung bình hàng năm mức

độ tăng trưởng sản xuất hocmôn steroid khoảng 20% Sự tăng nhanh tốc độ tiêu thụ sản xuất các thuốc hocmôn steroid có liên quan đến các thành tựu của y học cho phép mở rộng đáng kể sử dụng chúng trong thực tiễn chữa bệnh Năm 1991 trên thế giới sản xuất hơn 150 tấn cocticosteroid Việc sản xuất các dược phẩm hocmôn steroid ở Nhật, ví dụ chỉ sau 2 năm 1984-1986 đã tăng lên 3 lần và đạt 619 triệu đô la

-Nói riêng, theo thống kê nhu cầu tiêu thụ trên thế giới về các dược phẩm cocticosteroid (tính theo đơn vị tỉ đô la) như sau:

1980 1990 2000 (2010)

1,5 4,5 10,8 (15)

-Như vậy, tiêu thụ dược phẩm cocticoid trên thế giới là rất lớn và có khuynh hướng ngày càng tăng Người ta dự đoán rằng nhu cầu thế giới tiêu thụ các dược phẩm cocticoid đến 2010 tăng ít nhất tới 14-15 tỷ đô la

-Trước đây, các dược phẩm có gốc steroid được sản xuất từ diosgenin, solasodin, một số nước sử dụng axit mật và hecogenin nhưng xu hướng chung đang chuyển sang dùng phytosterol vì giá thành rẻ do thu hồi từ phế phụ thải công nghiệp chế

biến nông lâm sản như phế thải CN bột giấy, phụ thải CN mía đường, CN tinh luyện dầu đậu tương

I.2 Giới thiệu về sterol:

I.2.1 Nguồn tự nhiên của sterol:

-Sterol là một trong những hợp chất rất phong phú, nó có trong động vật có xương sống, động vật không xương sống và thực vật

I.2.1.1.Sterol động vật biển không xương sống:

-Sterol dạng thấp của đời sống thực, động vật là đáng chú ý vì chúng gợi ý cho ta

về sự liên quan giữa giai đoạn tiến hóa với kiểu mẫu của sterol được hình thành Trong nhiều sterol động vật không xương sống, chuỗi mạch bên 8 cacbon của cholesterol được thay bằng một đơn vị có 9 cacbon với các nhóm metyl ở C20 hoặc bằng một đơn vị 10 cacbon với nhóm etyl Những sterol của động vật biển, một số kiểu mẫu điển hình là: spongesterol, clionasterol, 24- metylencholesterol, fucosterol

-Sterol là những ancol ở thể rắn có cấu trúc 27- 29 nguyên tử C, thuộc nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, ví dụ β-sitosterol, ergosterol,

stigmasterol) nhưng đều có chung một khung cơ bản perhydrocyclopentano phenanthren và một chuỗi ngang với các nhóm metyl (loại ergostan) hoặc ete (stigmastan) đặc biệt là ở C21

-Một số sterol có nhóm metyl ở C4 hoặc C14 Các chất này được gọi là metylsterol Tất cả các sterol đều có nhóm OH ở C3 Sterol có nối đôi ở mạch nhánh gọi là stenol Các sterol không có nối đôi gọi là stanol

-Công thức một số sterol điển hình được dẫn ra dưới đây:

I.3.Chuyển hóa vi sinh sterol đến 17-cetosteroid và tổng hợp thuốc gốc steroid

từ sterol:

I.3.1.Tình hình nghiên cứu ngoài nước:

-Phát minh ra một số chủng vi sinh phân cắt chọn lọc mạch nhánh các sterol đến 17- cetosteroid như Androstendion (AD), Androstađiendion (ADD) và 9α- OH AD

là một trong số các thành tựu nổi bật và quan trọng nhất trong lĩnh vực công nghệ sinh học dược phẩm thế giới trong thời gian cuối thế kỷ XX Thành tựu này mở ra khả năng sử dụng “ rác công nghiệp- sterol” làm nguyên liệu đầu tổng hợp các loại thuốc steroid thiết yếu giá rẻ thay thế nguồn nguyên liệu truyền thống diosgenin & solasodin phải trồng trên đất nông nghiệp nhiều năm do vậy giá thành cao Cũng cần nhấn mạnh là thành công nhất trong ứng dụng công nghệ vi sinh trong sản xuất dược phẩm ở quy mô công nghiệp chính là trong lĩnh vực sản xuất các dược phẩm steroid

Xin thuyết minh :

-Trên thế giới, từ lâu diosgenin và solasodin là nguyên liệu số 1 cho bán tổng hợp các loại thuốc có gốc steroid Tuy nhiên, giá cả trên thị trường quốc tế của chúng ngày càng tăng do phải trồng nhiều năm (khoảng 5 năm) trên đất nông nghiệp Do vậy người ta đã ra sức tìm kiếm những nguồn nguyên liệu mới rẻ tiền hơn Các sterol thực vật đã được chú ý đến nhiều nhất vì chúng có trữ lượng rất lớn và có thể thu hồi từ phế phụ thải một số ngành công nghiệp ( CN sản xuất bột giấy, CN tinh luyện dầu đậu tương, CN mía đường) Điều này đã trở thành hiện thực sau khi phát minh ra một số chủng vi sinh phân cắt chọn lọc mạch nhánh các sterol đến 17-

cetosteroid (Fujimoto K et al J Amer Chem.Soc 1982.Vol 104 N-17pp.4718; Westmejze H et al Tetr.Lett 1980.Vol 21 N 27.pp 2665) Các nghiên cứu chuyển

hoá vi sinh sterol đã phát triển mạnh mẽ trong những năm gần đây và đặc biệt chỉ

một số ít cường quốc khoa học công nghệ mới có như là Mỹ, Tây Đức cũ, Nhật,

Nga

-Trên thực tế, một số hãng dược phẩm quốc tế như Apdzon & Serdz của Mỹ, Sering của Tây Đức, Mitsubisi của Nhật đã bắt đầu sử dụng các sterol thông qua 17-cetosteroid trung gian để bán tổng hợp một số thuốc có gốc steroid; Nga đã có

đề cương quốc gia thu hồi, chuyển hoá phytosterol từ 1993 / Riakhovskaya M.I., Luận án TS VHLKH LB Nga 1990; L Đ Huy, Luận án TS VHLKH LB Nga,

1992 /

-Công bố khoa học liên quan ( xem phần TLTK)

-Trung tâm kỹ thuật sinh học Viện HL KH LB Nga đã có nhiều thành tựu trong lĩnh vực chuyển hóa phytosterol đến 17-cetosteroid như AD, 9α- OH AD Chúng tôi đã trực tiếp đến thăm làm việc, đã ký kết thỏa thuận hợp tác và trên cơ sở đó Bộ

KH & CN đã phê duyệt Nhiệm vụ Nghị định thư này để chúng ta có thể có được công nghệ sản xuất AD và 9α- OH AD từ phytosterol Việt Nam Theo thỏa thuận phía Nga sẽ chuyển giao công nghệ cùng với các chủng vi sinh đột biến tương ứng quy mô phòng thí nghiệm chuyển hóa phytosterol đến AD và từ AD đến 9α- OH

AD, hiệu suất chuyển hóa đạt ≥ 70 +/- 5% với độ tinh sạch các sản phẩm đạt ≥ 97% Các công nghệ bền vững và họ sẵn sàng giúp ta giai đoạn tiếp theo chuyển lên quy mô sản xuất công nghiệp

-Công bố khoa học của phía đối tác Nga (xem phần TLTK)

I.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước:

- Trước khi đề tài này được phê duyệt, chúng tôi chưa được biết có nơi nào ở trong nước và trong khu vực có những công bố về chuyển hóa vi sinh sterol đến 17-cetosteroid, cũng như các nghiên cứu khác liên quan

-Công bố khoa học liên quan ( xem phần công bố của tác giả trong Mục TLTK):

-Từ sterol đến các thuốc gốc steroid có thể tóm tắt minh họa trong sơ đồ 1 sau:

C 3

C 3

C 3

H H H

H R

C 3

OH O

methyl- prednisolone , cortinef )

1.Fluorinated at 9-position 2.Corticosteroids:

( Dexamethasone, fluocinar, triamcinolone, beta-methasone )

2 Anabolics

(Phenobolin ,

Sylabolil )

2.Androgens ( Methyltestosterone, ethers of testosterone )

2.Mineralo-and gluco- corticoids( Hydrocortisone, prednisolone ,

methyl- prednisolone, cortinef ) 3.Progestagens

(Norethysterone acetate )

3.Progestagens (Acetomepregenole, megestrolacetate, esters of

17 alpha-hydroxyprogesterone )

(Spironolactone, canrenone )

5 Anabolics (Methandrostenolone)

Sơ đồ1 Chuyển hoá hỗn hợp sterol đến các loại thuốc gốc steroid

I.4.Thu hồi, tinh chế phytosterol từ phế phụ thải công nghiệp:

I.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước:

-Cholesterol cũng như phytosterol được phân lập từ rất lâu, nhưng nó chỉ được xem như “rác” trong các nghiên cứu, tức là khi gặp người ta bỏ qua không quan tâm

-Sau những phát minh đầu tiên phân cắt vi sinh chọn lọc mạch nhánh sterol ( cả cholesterol và hỗn hợp phytosterol) đến 17-cetosteroid như Androstendion, các nhà khoa học bắt đầu tập trung đến việc thu hồi chúng từ các nguồn phế phụ thải công nghiệp chế biến nông lâm sản như từ phế thải CN bột giấy, từ phụ thải CN mía đường, CN tinh luyện dầu đậu tương Hiệu quả nhất là thu hồi phytosterol từ nguồn phụ thải CN tinh luyện dầu đậu tương, hàm lượng có thể đạt từ 3-5-10%, thậm trí cao hơn tùy nguồn nguyên liệu

-Mỹ, Nhật và Tây Đức có những công bố khoa học và bằng phát minh đầu tiên trong lĩnh vực thu hồi sterol từ phế phụ thải công nghiệp, đặc biệt là từ phụ thải CN tinh luyện dầu đậu tương

-Nga có đề tài quốc gia thu hồi tinh chế phytosterol từ phế thải CN bột giấy từ

1993

-Cu Ba đã có những nghiên cứu chiết xuất phytosterol từ rỉ đường, phụ thải CN mía đường Tuy nhiên phương pháp không hiệu quả, không có ý nghĩa thực tiễn -Trong khu vực chúng tôi không thấy có công bố khoa học nào liên quan cho đến thời điểm này

-Các công bố khoa học liên quan ( xem phần TLTK )

I.4.2 Tình nghiên cứu trong nước liên quan đến Nhiệm vụ:

I.4.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất, tiêu thụ dược phẩm steroid trong nước

-Cho đến nay, Việt Nam phải nhập khẩu toàn bộ các loại thuốc có gốc steroid với

những khoản ngoại tệ rất lớn, do chưa có nguyên liệu đầu và công nghệ tổng hợp

Nhận thức được tầm quan trọng của vấn đề nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất các dược phẩm steroid, ngay từ những năm bảy - tám mươi thế kỷ trước Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (KHCNVN) và Bộ Y tế đã ra sức tìm kiếm nguồn nguyên liệu diosgenin và solasodin từ cây cỏ Việt Nam Kết quả là sau nhiều năm điều tra sàng lọc không chỉ ra được cây nào có thể làm nguyên liệu vì

hàm lượng hoạt chất quá thấp Cây Solanum (cà) di thực từ Liên Xô cũ vào Việt Nam trồng thử ở Lâm Đồng nhưng dần bị thoái hoá Một vài cây Dioscorea (củ

mài) lấy giống từ Mehico cho hàm lượng diosgenin khá, vì vậy Bộ Y tế đã có

chương trình quốc gia 3 kế hoạch 5 năm “Di thực, gieo trồng Dioscorea, chiết xuất

và chuyển hoá diosgenin đến các loại thuốc steroid” Tuy nhiên từ năm 1990 đến nay không thấy tiếp tục đề tài này và chưa đưa vào sản xuất được loại thuốc nào,

có lẽ chính vì xu hướng chung trên thế giới đang chuyển sang nguyên liệu mới tiên tiến phytosterol (?) hay là vì lý do nào khác (?)

-Tại Hội thảo Đức-Việt về Hoá học các hợp chất thiên nhiên được tổ chức tại Viện KHCNVN từ 15-20/4/1998, Tiến sĩ người Đức H.Ripperger, một chuyên gia lớn

về Solanum đã trả lời chúng tôi rằng: “Hai mươi năm trước đây chúng ta đã tuyên

bố: diosgenin và solasodin là nguyên liệu số một cho tổng hợp các loại thuốc steroid mà không ngờ rằng sterol sẽ chiếm vị trí độc tôn này trong một ngày gần

đây !”

-Lần đầu tiên, chính phủ đã phê duyệt Chương trình hóa- dược quốc gia

2007-2020, trong đó đã phê duyệt nội dung “ chiết xuất phytosterol từ phụ thải công nghiệp tinh luyện dầu đậu tương và nghiên cứu tổng hợp một số thuốc gốc steroid

từ phytosterol”

-Không còn nghi ngờ gì nữa, phytosterol là cơ hội, là nguyên liệu đầu tiên tiến tiềm năng, là thế mạnh của Việt Nam trong công nghiệp sản xuất dược phẩm steroid trong thời gian tới

-Như trên đã nói, phytosterol có thể được thu hồi từ phế phụ thải CN sản xuất bột giấy, CN mía đường và CN tinh luyện dầu đậu tương- 3 ngành sản xuất lớn của Việt Nam Đậu tương là ngũ cốc quan trọng số 3 của Việt Nam, sản lượng hàng trăm ngàn tấn/ năm và tăng nhiều chục phần trăm/ năm Năm 2007, ông Nguyễn Hữu Ninh Phó TGĐ Tổng Cty dầu thực vật đã trả lời chúng tôi trực tiếp rằng: Tổng sản lượng dầu đậu tương tiêu thụ của Tổng Cty dầu thực vật Việt Nam chiếm

75 % thị phần cả nước là ~ 100.000 tấn /năm Chỉ riêng Công ty dầu Cái Lân - Quảng Ninh, theo ông Phạm Văn Dũng trưởng phòng kỹ thuật cho biết, tổng dầu thô nguyên liệu tiêu thụ khoảng 48.000 tấn/ năm 3-5% con số đó là cặn- phụ thải- nguyên liệu mà ta có thể dùng để chiết xuất phytosterol, hiện nay đang được bán cho các cơ sở chế biến thức ăn gia súc và xuất khẩu rất không kinh tế Hàm lượng phytosterol trong nguồn phụ thải này khoảng 3-5% tuỳ đầu nguyên liệu

-Cho đến nay chúng tôi chưa được biết có nơi nào khác ngoài Viện Hoá học – Viện KHCNVN có nghiên cứu liên quan đến đề tài phytosterol cả về chiết xuất tinh chế, chuyển hóa vi sinh và hóa học

I.4.2.2.Nghiên cứu của chủ nhiệm & Cs liên quan đến Nhiệm vụ:

a)Nghiên cứu “Hoàn thiện một số phương pháp mới tổng hợp cocticoid từ 17-

cetosteroid ”: Từ 1988 đến nay chúng tôi liên tục nghiên cứu trong lĩnh vực này

và xin tóm tắt như sau:

+)L.Đ.Huy: Luận án TS, Viện Hoá hữu cơ N.D Zelinsky -Viện HL KH LB Nga (1992) với đề tài “Hoàn thiện một số phương pháp mới tổng hợp cocticoid từ 17- cetosteroid.” Tác giả đã được trao Giải nhất Giải thưởng KHKTTN về thành tựu khoa học cơ bản năm 1998 cùng Huy chương Tuổi trẻ sáng tạo KHKT do TT KHTN & CNQG kết hợp Đoàn TNCS Hồ Chí Minh tổ chức và trao giải

+)Chúng tôi đã tiếp tục nghiên cứu đề tài chuyển hoá phytosterol bằng tài trợ của Quỹ khoa học Quốc tế IFS ( Inter Found for Science ), (1996- 1999)

+) Chúng tôi đã nhận được tài trợ lần thứ 2 từ tổ chức IFS, (2001- 2003)

-Xem Mục “Các công bố khoa học của tác giả”

b)Nghiên cứu “Chiết xuất phytosterol từ phụ thải CN tinh luyện dầu đậu tương”:

+) Năm 2003: Bằng nguồn kinh phí cấp cơ sở chọn lọc của Viện Hóa học, lần đầu tiên chúng tôi đã nghiên cứu thành công phương pháp phòng thí nghiệm rất hiệu quả khả thi thu hồi tinh chế phytosterol từ phụ thải công nghiệp tinh luyện dầu đậu tương, đã nhận được 500g phytosterol mẫu với độ tinh sạch ≥ 90%

-Xem phụ lục các công bố khoa học của tác giả

c)Nghiên cứu “Chuyển hóa vi sinh phytosterol đến AD và 9α- OH AD”:

+) Năm 2005: Chúng tôi đã cộng tác với TT KH Quốc gia Cu Ba chuyển hoá thử nghiệm thành công phytosterol do phòng thí nghiệm của chúng tôi chiết xuất tinh chế từ phụ thải CN dầu đậu tương đến AD & ADD với hiệu suất tốt ( ≥ 65%) +) Năm 2006: Mẫu phytosterol của Việt Nam cũng đã được Trung tâm kỹ thuật sinh học – Viện HL KH LB Nga thử nghiệm chuyển hóa bằng chủng vi sinh đột biến công nghiệp của Nga đến AD hiệu suất ≥ 70%, độ tinh sạch sản phẩm ≥ 97% -Xem công bố khoa học của tác giả

Chương II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II 1 Phương pháp nghiên cứu sterol

II.1.1 Chiết suất sterol :

-Đặc tính của sterol là chất không phân cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo, caroten, lexitin nhưng tan tốt trong các dung môi không phân cực như dầu, ete, benzen, CHCl3 Do vậy các dung môi này được dùng làm dung môi để chiết sterol Ngoài ra còn có thể chiết sterol bằng cồn (dạng glycozit)

-Sản phẩm chiết bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp của các este sterol kết hợp với lipit, caroten, lexitin Phải qua giai đoạn xà phòng hóa để tách các chất này

ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ Tinh chế sterol bằng phương pháp kết tinh phân đoạn Trong nghiên cứu, để định lượng sterol có thể kết tủa sterol bằng digitonin

-Chiết sterol từ phụ thải công nghiệp tinh luyện dầu đậu tương được thực hiện dựa trên cơ sở phương pháp chiết phytosterol từ dầu đậu tương Phương pháp được

thực hiện mô phỏng thí nghiệm quy mô phòng thí nghiệm như sau / Raphael Ikan Natural Products 2-nd Ed Academic Press INC San Diego ,California 1991/ :

82g dầu đậu tương thêm 400 ml MeOH và 75g NaOH/KOH, đun hồi lưu 3 giờ Sau đó thêm 200 ml nước và chiết hỗn hợp này 3 lần, mỗi lần 300 ml ete isopropyl Dịch chiết ete isopropyl được rửa với muối, cất thu hồi dung môi Cặn không xà phòng hóa được hòa tan trong 100ml ete dầu, lọc Để yên 12 giờ Hỗn hợp phytosterol sẽ tủa Lọc lấy tủa, sấy khô, đun hồi lưu với anhydic acetic (10 ml) trong 3 giờ Để lạnh qua đêm, được tủa acetat sterol Lọc, rửa tủa và kết tinh lại từ hỗn hợp dung môi chọn lọc

-Phương pháp chung chiết xuất tinh chế phytosterol từ phụ thải CN dầu đậu tương: Thuỷ phân kiềm nguyên liệu “Phụ thải CN dầu đậu tương“ → Trung hòa dich thủy phân bằng axít sunfuric → Trích ly →Sterol thô →Kết tinh lại nhiều lần bằng hỗn hợp dung môi chọn lọc → Sterol tinh khiết

II.1.2.Các phương pháp phân tích sterol

-HPLC là kỹ thuật phân tách vật lý hai hay nhiều cấu tử trong một hỗn hợp, có thể dùng để phân tích các phân tử hoặc ion hữu cơ Như vậy, độ tinh khiết của nhiều hợp chất hữu cơ có thể được đánh giá bằng phương pháp HPLC Kỹ thuật này bao gồm một pha rắn (pha tĩnh) được nhồi vào một cột thép không rỉ và một pha lỏng

di động (pha động) chạy qua Việc phân tách các cấu tử trong dung dịch được thực hiện nhờ sự khác nhau về tỷ số phân bố của các chất tan giữa hai pha Phương pháp HPLC, dựa trên cơ chế của hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc kích cỡ tùy thuộc vào kiểu pha tĩnh được sử dụng

-Cấu hình thiết bị của HPLC bao gồm: hệ thống bơm, van bơm mẫu, cột sắc ký, đầu dò (detector) và hệ thống xử lý, ghi sắc ký đồ (máy tính)

-Cột sắc ký dùng trong HPLC để phân tích sterol có thể thuộc một trong các kiểu phân tách dưới đây:

-Cột pha thường: Gồm các chất phân tích tương tác với bề mặt của chất rắn phân cực (pha tĩnh) như trường hợp của cột nhồi và lớp màng mỏng sắc ký Dung môi của phương pháp này là hỗn hợp 2 hoặc 3 dung môi có độ phân cực khác nhau -Cột pha ngược: Sợi silica có đường kính rất nhỏ (đường kính trong 3-10 µm) và

độ xốp cao cho hiệu suất tương tác cao giữa chất phân tích và pha tĩnh Trong hệ thống này, chất sterol phân cực hơn, tuơng tác kém hơn với pha tĩnh không phân cực và do đó tách rửa từ các cột nhanh hơn Hệ pha ngược nhạy hơn đối với sự có mặt của liên kết đôi và kích thước phân tử so với hệ pha thường Số liên kết đôi trong sterol tăng lên hoặc kích thước của chất phân tích giảm, tương tác kém với

pha tĩnh và bởi vậy tách rửa từ các cột nhanh hơn Một vài pha phân cực di động được sử dụng trong hệ pha ngược HPLC, thường chứa acetonitrile và methanol và thường thêm nước

-Trong cột tách luôn luôn xảy ra sự cạnh tranh giữa độ tan của chất tan trong pha động và tương tác vật lý của nó với bề mặt của pha tĩnh Nếu như mẫu tan tốt trong pha động thì nó sẽ rửa giải sớm “Độ mạnh” của pha động có thể được điều chỉnh bằng cách thay thế tỉ lệ dung môi đem sử dụng

-Detector thích hợp nhất cho phân tích sterol là detector UV và RI Đối với các sterol, detector UV thường hoạt động ở bước sóng 200-210 nm Đáng tiếc là

detector UV không thể sử dụng cho toàn bộ detector để định lượng các sterol Hình

3 dưới đây chỉ ra khả năng tách và xác định các sterol campesterol, stigmasterol và

tráng với dung dịch AgNO3 5% trong MeOH + H2O (thay nước) sau đó hoạt hóa ở

1200Ctrong khoảng thời gian 30 phút

-Các hệ dung môi là: benzen-etyl acetat (4:1), benzen-clorofoc (9:1)

-Một số sterol khó tách rời như cholesterol và stigmasterol, có thể chuyển chúng thành dẫn xuất acetyl trước khi tiến hành phân tích

-Để hiện màu trên lớp mỏng dùng dung dịch SbCl3 trong CHCl3, H2SO4 20% trong cồn hoặc H2SO4- H2O (1:1) và hơ nóng kính Một số sterol có thể phát hiện

vết bằng soi UV

II.1.2.2.2 Phương pháp xác định điểm chảy (Đnc.) :

-Barton có nhận xét về điểm chảy của sterol như sau:

-Tất cả sterol dãy 3β- ol có điểm chảy cao hơn điểm chảy của các acetat tương

ứng, trừ các sterol có nối đôi ∆ 7− 8(các sterol này điểm chảy của acetat cao hơn)

-Điểm chảy của các 5 α - sanol (sterol no) thấp hơn điểm chảy của các sterol có

dây nối đôi trong vòng (sterol)

-Các 3-ceto-∆ 4- sterol (thu được do oxy hóa ∆ 3 - sterol) có điểm chảy thấp, thấp

hơn điểm chảy của sterol tương ứng

II.1.2.2.3 Phổ tử ngoại (UV):

-Sự có mặt các nhóm liên hợp (chromophor) trong sterol cho phép ta áp dụng quy

tắc Woodward để dự đoán phổ hấp thụ của sterol Ví dụ đối với ergosterol; vòng đơn thuần đien (253), 4 nhóm ankyl (+20), 2 dây nối đôi ngoại vòng (+10) có λ

2960 - 2850 và 1485 - 1445 cm-1 tương ứng với dao động giãn C-H và uốn cong

CH2 Tín hiệu ở 1385 - 1380 cm-1 và 1370 - 1365 cm-1 tương ứng với sự hấp thụ

của nhóm đimetyl cuối mạch.Các sterol không no cho dải hấp thụ ở 3040 - 3010

cm-1 tương ứng với dao động giãn C-H (cis) và ở 690 cm-1 do dao động uốn cong C-H của alken (cis) 2 lần thế và ở 840 - 790 cm-1 nếu là anken 3 lần thế Dao động giãn C = C cho giải hấp thụ ở vùng 1680 - 1620 cm-1

-Nếu các nhóm OH chuyển thành ceto thì sẽ mất các dải hấp thụ đặc trưng của nhóm OH, đồng thời xuất hiện dải hấp thụ ở 1718 - 1704 cm-1 của nhóm cacbonyl Nếu nhóm cacbonyl nằm ở trong vòng 6 cạnh thì trị số hấp thụ tùy thuộc ở vị trí của nhóm này và ở cấu hình C5 là α hayβ

-Các vòng cyclopentenon hấp thụ ở 1738 - 1949 cm-1 nếu có dây nối đôi liên hợp

sẽ có sự chuyển vị bathochromic của dải này đến 1680- 1660 cm-1

-Các acetat sterol cho băng ở 1733 - 1739 cm-1 và 1250 – 1200 cm-1

II.1.2.2.5.Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H - NMR & C13- NMR

-Vùng δ = 3,0 và 1,0 ppm luôn có 1 dải hấp thụ do các nhóm metylen và metyl của khung sterol Ngoài ra còn thấy vài tín hiệu có cường độ mạnh ở 1,20 - 0,70 ppm tương ứng với proton metyl ở C18 và C19 Ptoton metyl C18 cho doublet ở 0,89 ppm

và của C26 cho doublet ở 0,875 ppm.Còn có các tín hiệu phức tạp của các proton chuỗi alkyl và anken của mạch ngang tạo nên.Các proton vinyl cho các tín hiệu ở 5,2 & 5,5 ppm tùy theo vị trí của chúng nằm ở vòng hay ở mạch ngang

-Phổ 13 C- NMR là công cụ bổ sung mạnh cùng phổ 1H- NMR khi nghiên cứu cấu trúc tinh vi của các sterol tinh khiết Tuy nhiên trong phân tích hỗn hợp sterol, thường chỉ dùng HPLC-MS

II.1.2.2.6 Phổ khối lượng (MS):

-Tín hiệu chung cơ bản của sterol trong khối phổ là ion [M]+, [M-(R+42)]+ do sự loại 42 đơn vị khối lượng của mạch ngang sterol Sự loại phân tử H2O tạo ra ion

(III) và tiếp theo là các ion (V), (VI) như sơ đồ 2 dưới đây:

Sơ đồ 2 Quá trình phân mảnh sterol trong khối phổ

C8H17CH CH

(VI) m/e 96

(IVa)

(IVc) m/e 145

(IIIb) m/e 217 (IIIa)

m/e 370 [M-18]+ hoÆc [M-60] +

(I) Y= H hoÆc CH3CO-

(II) [M-(42+R)]+

II.2 Phương pháp vi sinh phân cắt chọn lọc mạch nhánh hỗn hợp sterol đến 17-cetosteroid :

-Xin dẫn ra một ví dụ minh họa về phương pháp nghiên cứu lượng nhỏ bao gồm các bước chung sau đây:

Bước 1: Chuẩn bị các ống nghiệm sạch thạch nghiêng môi trường NB, ủ 5-7 ngày

ở 30oC, từ các khuẩn lạc riêng rẽ chủng vi sinh phát triển lên các tấm NB

Bước 2: Thêm ống thạch nghiêng vào 100 ml NB + Tween 80; nuôi cấy lắc 48 giờ

ở 30oC và 200 vòng/phút

Bước 3: Chuyển 1/10 (v/v) vào bình Erlenmeyer có chứa 50 ml NB + nguyên liệu

đầu (phytosterols/ AD) 1mg/ml; tiếp tục ủ 120 giờ ở 30oC, 200 vòng/phút

Bước 4: Dừng quá trình bằng cách hấp khử trùng 15 phút ở 121oC Các mẫu được phân tích hoá học tiếp theo: Chiết sản phẩm bằng dung môi thích hợp và phân tích bằng HPLC

-Trong đề tài này, chuyển hoá vi sinh hỗn hợp phytosterol đến AD dùng chủng vi

sinh đột biến Mycobacterium neoaurum và AD đến 9α -OH AD dùng chủng vi sinh Rhodococcus erythropolis và các phương pháp tương ứng do phía Nga cung

cấp Đây là các chủng vi sinh công nghiệp và các công nghệ của phía Nga Công nghệ được mô tả chi tiết và chuyển giao cho Viện Hóa học, gồm hai giai đoạn nói chung: oxi hoá vi sinh và phân lập tinh chế sản phẩm từ sinh khối bằng dung môi hữu cơ chọn lọc

-Cũng cần nhấn mạnh ưu điểm nổi trội có tính hiệu quả rất cao mà phương pháp vi sinh có được là chỉ một giai đoạn thực nghiệm, từ một hỗn hợp phức tạp 3-8 cấu tử sterol tất cả đều bị cắt chọn lọc mạch nhánh để tạo ra dẫn xuất 17- ceto, đồng thời còn thực hiện được luôn quá trình oxy hóa chọn lọc nhóm 3beta- hydroxy đến 3-ceto-∆4 Cho đến nay không có bất kỳ phương pháp hóa học nào có thể làm được

Chương III THỰC NGHIỆM , KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN III.1.Tiếp nhận và hoàn thiện 02 công nghệ vi sinh sản xuất Androstendion (CN1) và 9α - hydroxy Androstendion (CN2) quy mô phòng thí nghiệm từ TT

Kỹ thuật sinh học- Viện HL KH LB Nga

III.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dụng cụ, thiết bị:

-Hóa chất: mua từ các hãng Merck, Sigma

-Hai chủng vi sinh vật Mycobacterium neoaurum, Rhodococcus erythropolis; các

cơ chất phytosterol của Nga mang sang ( Ph- No1) và mua của hãng Merck (Ph-

III.1.2.Phương pháp nghiên cứu:

III.1.2.1.Chuyển hóa hỗn hợp phytosterol đến AD bằng phương pháp sử dụng

chủng vi sinh đột biến của Nga Mycobacterium neoaurum:

-Chủng Mycobacterium neoaurum được làm giàu trong môi trường nhân giống 4

ngày rồi chuyển sang môi trường chuyển hóa theo tỷ lệ 10%, có bổ sung 1% phytosterol, nuôi ở 29oC, 220 vòng/phút Quá trình chuyển hóa kéo dài ba ngày và được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng sử dụng etyl acetat làm dịch chiết (tỷ lệ 1:4),

chạy trong hệ dung môi n-hexan: aceton (tỷ lệ 3:2), soi dưới UV 254 nm Dịch nuôi cấy sau đó được tách chiết và tinh chế Độ tinh sạch của AD được đánh giá bằng HPLC Thành phần môi trường nhân giống và chuyển hóa cho chủng

Mycobacterium neoaurum được liệt kê trong Bảng1 dưới đây:

glucose soybean non-degreased soybean degreased citric acid

(NH4)2HPO4

urea MgSO4FeSO4CaCO3 Phytosterol pH: 6.8 - 7.2

20

10

5 2.2 1.5 0.5 0.5 0.05

3

10

Bảng1 Môi trường nhân giống và chuyển hoá của chủng Mycobacterium neoaurum

III.1.2.2.Phương pháp hydroxyl hóa AD đến 9α-OH AD bằng chủng vi sinh

của Nga Rhodococcus erythropolis:

-Làm giàu chủng Rhodococcus erythropolis trong môi trường nhân giống lần 1 ba

ngày ở 29oC, khuâý đảo 220 vòng/phút rồi chuyển sang môi trường nhân giống lần

2 (20%) một ngày ở cùng điều kiện nuôi cấy Chuyển chủng sang môi trường chuyển hóa (20%) có bổ sung AD (4,0 g/l), duy trì một ngày và kiểm tra lượng cơ

chất còn dư bằng TLC Kết thúc quá trình chuyển hoá, dịch nuôi cấy có bổ sung etyl acetat với tỷ lệ tương đương , sau đó được chuyển sang giai đoạn tách chiết

tiếp theo để thu nhận sản phẩm Dưới đây là Bảng 2 liệt kê thành phần môi trường nhân giống và chuyển hóa cho chủng Rhodococcus erythropolis:

25

5

1 4.5

Bảng2 Môi trường nhân giống và chuyển hoá của chủng vi sinh Rhodococcus erythropolis

III.1.3 Kết quả và thảo luận:

III.1.3.1 Chuyển hóa vi sinh phytosterol đến AD bằng chủng Mycobacterium neoaurum:

-Để đánh giá hoạt tính của chủng Mycobacterium neoaurum chuyển hóa

phytosterol đến AD với hiệu suất đạt yêu cầu theo hợp đồng đã ký, 4 đợt thí nghiệm sau đây đã được thực hiện:

a)Đợt thí nghiệm 1a: Trước tiên, chủng Mycobacterium neoaurum được lên men

trên cơ chất phytosterol nước ngoài Ph- No1 và môi trường của phía đối tác Nga cung cấp ở quy mô bình tam giác dung tích 750 ml chứa 100 ml môi trường chuyển hóa Kết thúc quá trình chuyển hóa, hàm lượng AD đánh giá theo TLC là 5 g/l Từ 3 g phytosterol ban đầu tách được 1,21 g AD thô có độ tinh sạch kỹ thuật là

82,72% Tinh chế tiếp theo thu được 1,105 g AD có độ tinh sạch 97,85% theo HPLC, hiệu suất tinh chế đạt 94,85%

b)Đợt thí nghiệm 2a:

+ Cơ chất Ph- No1 và môi trường của Nga: Từ 5 g phytosterol thu được 3,01 g AD thô có độ tinh sạch kỹ thuật 59,74% (HPLC)

+ Cơ chất Ph- No1 của Nga, môi trường Việt Nam:

Sau 98 giờ, hàm lượng AD theo TLC ước tính khoảng 4,5 g/l Từ 6 g cơ chất ban đầu thu được 3,22 g AD thô có độ tinh sạch kỹ thuật 69,90% (theo HPLC) Tinh chế cùng lượng AD thô ở thí nghiệm trên được 5,15 g AD với độ tinh sạch đạt 105,83%, hiệu suất tinh chế là 85,12%

+ Cơ chất phytosterol Việt Nam (Ph-VN), môi trường của Nga cung cấp: Hiệu suất

chuyển hóa AD tiếp tục được đánh giá qua thí nghiệm trên môi trường của Nga với hai mẫu cơ chất của Việt Nam là Ph-VN1 và Ph-VN2 Từ tổng cộng 10 g hai loại phytosterol trên gộp lại làm thí nghiệm, sau 98 giờ chuyển hóa ước tính hàm lượng

AD đạt 4,4 g/l theo TLC, thu được 5,77 g AD thô với độ tinh sạch kỹ thuật trung bình là 70,08% theo HPLC Lượng AD thô này tiếp tục được làm tinh chế thu được 4,91 g AD có độ tinh sạch là 103,96%, hiệu suất tinh chế đạt 87,37%

c)Đợt thí nghiệm 3a: thí nghiệm với phytosterol của nước ngoài trên môi trường của Nga và Việt Nam

+ Môi trường Nga: Từ 4 g phytosterol Ph-N02, sau 96 giờ chuyển hóa ước tính hàm lượng AD khoảng 5,2 g/l theo TLC, chiết được 2,71 g AD thô, độ tinh sạch kỹ thuật là 75,27% (theo HPLC)

+ Môi trường Việt Nam: Tương tự, từ 4 g phytosterol Ph-N02 trên sau 96 giờ chuyển hóa, dịch nuôi cấy có hàm lượng AD theo TLC khoảng 4,7 g/l được chiết

và thu hồi 2,31 g AD thô Phân tích bằng HPLC cho thấy AD thô này có độ tinh sạch kỹ thuật khá cao là 91,88%

-Kết hợp tinh chế lượng AD thô trong đợt thí nghiệm này thu được 3,97 g AD, độ tinh sạch theo HPLC là 97,28%, đạt hiệu suất tinh chế 83,23%

d)Đợt thí nghiệm 4a: Đánh giá khả năng chuyển hóa phytosterol Việt Nam (Ph-VN) trên môi trường của Việt Nam

-Thí nghiệm được tiến hành trên cơ chất phytosterol Việt Nam Ph-VN : Sau 96 giờ chuyển hóa, từ 6 g sterol tách được 3,9 g AD thô, độ tinh sạch kỹ thuật 94,13% Tinh chế và nhận được 2,84 g AD với độ tinh sạch là 99,55%

-Như vậy, môi trường chuyển hóa của Việt Nam sử dụng bột đậu tương mua ngoài thị trường rất phù hợp cho chủng Mycobacterium neoaurum trong việc chuyển hóa phytosterol Việt Nam đến AD

III.1.3.2 Triển khai hydroxyl hóa AD đến 9α-OH AD băng chủng vi sinh

Rhodococcus erythropolis :

-Việc hydroxyl hóa AD đến 9α-OH AD bằng chủng Rhodococcus erythropolis của Nga được triển khai giám định qua bốn đợt thí nghiệm sau:

a)Đợt thí nghiệm 1b: Thí nghiệm trên môi trường Nga, cơ chất AD Nga :

-Quá trình chuyển hoá kết thúc sau 24 giờ Không quan sát thấy cơ chất còn lại trong dịch nuôi cấy theo TLC Từ 0,4 g cơ chất cho vào môi trường, tách được 0,4

g 9α-OH AD thô có độ tinh sạch kỹ thuật là 78,61%

b)Đợt thí nghiệm 2b: Môi trường Nga, cơ chất AD Nga và AD Merck

-Quá trình kéo dài 22 giờ Theo TLC, cả hai nguồn AD của nước ngoài còn dư dưới 1% Từ 2,8 g AD của Nga tách được 3,04 g 9α-OH AD thô có độ tinh sạch kỹ thuật là 58,77% (theo HPLC) Từ tổng cộng 3,35 g 9α-OH AD thô ,kết hợp với phần thu ở đợt 1, tinh chế được 2,95 g sản phẩm có độ tinh sạch là 96,77% (theo HPLC), với hiệu suất tinh chế là 87,80%

-Từ 0,8 g AD của Merck thu được 0,89 g sản phẩm 9α-OH AD thô Lượng sản phẩm thô này sẽ được tinh chế cùng với lượng sản phẩm thô ở phần thí nghiệm đợt 3b

c)Đợt thí nghiệm 3b: Thí nghiệm trên môi trường Việt Nam:

-Kết quả phân tích UV ở 254 nm sau 18 giờ cho thấy vẫn còn vết AD rất đậm Các bình này được nuôi thêm một ngày và kiểm tra lượng cơ chất dư thừa Tuy nhiên ở ngày thứ hai, lượng cơ chất ước tính còn khoảng hơn 90%

-Như vậy, môi trường chuyển hóa của Việt Nam không phù hợp cho việc hydroxyl hóa AD sử dụng chủng Rhodococcus erythropolis của Nga

d)Đợt thí nghiệm 4b: Lựa chọn nguyên liệu tạo môi trường phù hợp cho chủng Rhodococcus erythropolis

Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên ba lô thí nghiệm:

+ Lô thí nghiệm 1: Dùng nước chiết ngô ngọt của Việt Nam làm môi trường, AD Merck làm cơ chất

+ Lô thí nghiệm 2: Dùng môi trường chuyển hoá của Nga nhưng thay thế cao ngô bằng cao nấm men của hãng Biomedicals, AD của Nga làm cơ chất

+ Lô thí nghiệm 3: Dùng môi trường chuyển hoá của Nga và cơ chất AD Việt Nam Nguồn cơ chất này là kết quả chuyển hoá phytosterol Việt Nam đến AD nhờ

chủng Mycobacterium neoaurum

-Sau 24 giờ chuyển hoá, kết quả AD ở lô 1 mới được chuyển hoá một nửa

Như vậy, nước chiết ngô ngọt của Việt Nam cũng không phù hợp dùng cho việc hydroxyl hoá AD

-Ở lô 2 và 3: phản ứng chạy rất tốt, không còn cơ chất trong môi trường, ước tính khoảng 5 g/l sản phẩm tạo thành theo TLC Các bình ở lô 1 và 2 được mang đi tách chiết và thu được 1,26 g có độ tinh sạch kỹ thuật là 85,36% (lô 2) và 1,22 g 9α-OH

AD thô có độ tinh sạch kỹ thuật là 87,04% (lô 3) Tinh chế sản phẩm thô của hai lô thu được 2,01 g 9α-OH AD có độ tinh sạch 100,4%, hiệu suất tinh chế là 84,45%

Kết luận:

1) §ã tiếp nhận và hoàn thiện công nghệ vi sinh từ Liên bang Nga chuyển hóa phytosterol đến AD (CN1) đạt hiệu suất chuyển hóa ≥ 70 ± 5% theo HPLC, độ

tinh sạch sản phẩm ≥ 97% theo HPLC sử dụng chủng vi sinh đột biến do phía Nga

cung cấp Mycobacterium neoaurum

-Các kết quả nhận được tương tự khi sử dụng phytosterol Việt Nam Ph-VN và 02 mẫu nguyên liệu phytosterol có nguồn gốc nước ngoài khác nhau Ph-No1 và Ph-

No2

2) Đã tiếp nhận và hoàn thiện công nghệ vi sinh từ Liên bang Nga Chuyển hóa AD đến 9α -OH AD (CN2) với hiệu suất chuyển hóa đạt ≥ 70 ± 5%, độ tinh sạch sản phẩm ≥ 97% theo HPLC sử dụng chủng vi sinh đột biến do phía Nga cung cấp

III.2 Bảo quản, nuôi cấy và chọn lọc hai chủng vi sinh vật

-Hai chủng Mycobacterium neoaurum và Rhodococcus erythropolis được giữ trong

ống thạch nghiêng ở 4oC trong vòng một tháng Các chủng này được cấy chuyển sang môi trường nhân giống mỗi khi tiến hành một đợt thí nghiệm chuyển hoá Trong trường hợp hai chủng vi sinh nói trên bị nhiễm vì một nguyên nhân nào đó thì cần tiến hành các khâu pha loãng, cấy chuyển, sàng lọc và thử hoạt tính Chúng tôi đã tiếp nhận chủng gốc trong ống ampul từ các chuyên gia Nga và bảo quản trong tủ lạnh chuyên dụng vi sinh 4oC tại phòng Kỹ thuật di truyền, viện Công nghệ sinh học- Viện KHCNVN

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min -0.25

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 240nm,4nm (1.00)

mAU(x1,000) 240nm,4nm (1.00)

III.2.Triển khai kiểm tra CN1 và CN2 trờn fermentor 5,0 lớt của Mỹ sản xuất

( Hai nội dung này khụng cú trong đăng ký ban đầu của Nhiệm vụ)

III.2.1 Kiểm tra CN1 chuyển hoỏ vi sinh phytosterol đến AD trờn fermentor 5,0 lớt do Mỹ sản xuất:

-Sau khi kiểm tra cỏc fermentor hiện cú của Viện CNSH, cỏc chuyờn gia Nga cho rằng cấu trỳc fermentor quy mụ 5,0 lit cũng như 80,0 lớt của Mỹ sản xuất của Viện CNSH cú cấu trỳc khụng phự hợp để triển khai cụng nghệ 1 của Nga chuyển hoỏ vi sinh phytosterol đến AD Do vậy, trước khi xem xột khả năng triển khai trờn fermentor 80,0 lớt của Mỹ chỳng tụi đành phải thử triển khai kiểm tra trờn fermentor 5,0 lớt cú cựng cấu trỳc

Thực nghiệm:

- Húa chất: mua từ cỏc hóng Merck, Sigma

- Hai chủng vi sinh vật Mycobacterium neoaurum, Rhodococcus erythropolis và

cỏc cơ chất chuẩn phytosterol, AD của Nga được cỏc chuyờn gia Nga trực tiếp mang sang làm thớ nghiệm

- Phytosterol do Phũng Steroid và Alkaloid tự điều chế (độ tinh khiết ≥ 94%) và 02 mẫu Ph-N nguồn gốc nước ngoài

- AD (độ tinh khiết ≥ 95%) Merck và là sản phẩm của Nhiệm vụ này

- Fermentor 5,0 lớt dựng cho CN1 và CN2 cú tờn là Bioflo 110 fermentor, nước sản xuất: Mỹ, mó số: 500383632

- Phõn tớch dựng bản mỏng đế nhụm silica gel 60 F254 (Merck)

- Sản phẩm sau phõn tỏch tinh chế được kiểm tra trờn hệ thống sắc ký lỏng cao ỏp HPLC của Shimadzu, cột LC18 (25 cm x 4,6 mm, 5 àm), đệm H2O : metanol = 4 :

6, tốc độ 1 ml/phỳt, bước súng phỏt hiện: 240 nm

Phương phỏp:

-Làm giàu chủng Mycobacterium neoaurum trong 500 ml môi trường nhân giống

với thành phần môi trường như sau: glucose 5 g, soybean flour 6.5 g, citric acid 1.1 g, urea 0.25 g, NH4Cl 0.5 g, K2HPO4 0.25 g, MgSO4 0.25 g, FeSO4.7H2O 0.025

g, CaCO3 0.75 g; pH 6.8 Dịch nuôi cấy được lắc ở 29oC, 220 vòng/phút trong 4 ngày rồi chuyển sang 3,5 lít môi trường chuyển hóa trong nồi lên men 5L đã được chuẩn bị từ trước với các thành phần sau: glucose 70g, soybean flour 52.5 g, citric acid 7.7 g, (NH4)2HPO4 5.25 g, urea 1.75 g, MgSO4 1.75g, FeSO4 0.175 g, CaCO310.5 g Môi trường chuyển hóa có hàm lượng phytosterol là 10g/l và được khử trùng ở 118oC, 30 phút rồi làm lạnh về nhiệt độ phòng trước khi tiếp giống 1 ngày Dịch nuôi cấy sau 3 ngày được lấy ra và đánh giá lượng cơ chất còn dư và sản phẩm tạo thành bằng sắc ký bản mỏng

Kết quả triển khai chuyển hoá vi sinh phytosterol đến AD trên fermentor 5,0 lít do Mỹ sản xuất:

-Tiến hành lên men hai lần trong fermentor 5,0 lít, với tổng thể tích môi trường chuyển hóa là 3,5 lít, tỷ lệ cơ chất 10 g/l và tiếp giống là 15% Quá trình lên men được đảm bảo vô trùng Các thông số sau được duy trì trong suốt quá trình lên men: tốc độ khuấy 600 vòng/phút, pO2 khoảng 90%, nhiệt độ ổn định ở 29oC, pH ban đầu 6,8 Dầu phá bọt được thêm vào nồi lên men với một lượng tối thiểu vì

chủng vi sinh rất nhạy cảm với chất này Ngoài ra, hai bình tam giác 500 ml chứa

100 ml môi trường chuyển hóa trong mỗi bình cũng được lắc song song cùng thời gian lên men trên để so sánh

-Lần thứ nhất, kết quả lên men không thành công vì toàn bộ cơ chất kết tụ với nhau

và bám hết trên thành bình, cộng với lượng bọt dâng lên nhiều nên cánh khuấy không có hiệu lực kéo cơ chất xuống Kết quả là cơ chất sterol không được chuyển hóa và AD không tạo thành

-Để khắc phục hiện tượng trên chúng tôi tiến hành lên men đợt 2 nhưng có điều chỉnh một số thông số như kiểm soát lượng bọt bằng chất chống bọt nhưng ở lượng

tối thiểu để hạn chế ảnh hưởng của nó tới tốc độ sinh trưởng của chủng Ngoài ra, tốc độ khuấy được điều chỉnh tăng lên phối hợp với nguồn cung cấp oxi giảm xuống mỗi khi lượng bọt gia tăng

-Sau 70 giờ chuyển hóa, dịch lên men ở nồi 5,0 lít được lấy ra để đánh giá sản phẩm và cơ chất còn dư bằng sắc ký bản mỏng Kết quả cho thấy quá trình chuyển hóa đang tiếp diễn, cơ chất vẫn còn vạch mờ trên bản sắc ký Sau 88 giờ chuyển hóa, dịch lên men trong nồi 5,0 lít và 2 bình tam giác 500 ml tiếp tục được đánh giá bằng TLC Không quan sát thấy vạch cơ chất nào trên bản mỏng Như vậy quá trình chuyển hóa ở các bình trên đã kết thúc sau 88 giờ chuyển hóa Hàm lượng

AD ở nồi 5,0 lít đánh giá theo TLC khoảng 2,5 g/l, trong khi ở hai bình tam giác

khoảng 5,0 g/l (Hình 4) Tiếp đó, dịch lên men được lấy ra theo đường bơm phía

đáy nồi Trên các điện cực có bám nhiều bọt, môi trường và cả cơ chất màu trắng

Hình 4 Kết quả định tính sản phẩm AD ở nồi 5 L và bình tam giác 500 ml

-Để thuận tiện cho công việc tách chiết sản phẩm, toàn bộ dịch lên men ở thí nghiệm này được gom lại và li tâm thu được 338,52 g sinh khối tế bào Hàm lượng

AD còn lại trong dịch nổi (3,3 l) theo HPLC là 0,25 g/l, nhỏ hơn 1,0 g/l, nên được loại bỏ Chiết lượng sinh khối nói trên thu được 9,2 g AD thô có độ tinh sạch kỹ thuật là 85,04% (theo HPLC) Lượng sản phẩm thô này tiếp tục trải qua quá trình

3µl 4µl 5µl 5L 5L 500ml 500ml

AD standard 70hr 88hr

tinh chế thu được 8,25 g AD, cú độ tinh sạch là 94,79% (theo HPLC) Hiệu suất theo Mol là 31%, tương ứng với 2,23 g/l Kết quả được trỡnh bày cụ thể trong

AD thụ

Độ tinhsạch KT(HPLC)

AD Tin chế

Độ tinh sạch (HPLC)

Hiệu suất chuyển húatheo Mol

cơ chất và mụi trường dớnh xung quanh thành bỡnh nờn khụng được chuyển húa 2) Sau khi khử trựng, mụi trường chuyển húa trong fermentor 5 lớt khụng được lắc đều như ở bỡnh tam giỏc nờn quan sỏt thấy cú sự kết tụ của cỏc hạt sterol trong mụi trường Điều này cũng gúp phần nhỏ ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển húa 3) Nguyờn nhõn chớnh, theo ý kiến ngay từ ban đầu của các chuyên gia Nga, thiết bị lờn men hiện có của viện CNSH không thích hợp để thực hiện chuyển hoá vi sinh này Theo họ, thiết bị lờn men dùng cho quá trình chuyển hoá vi sinh này cần có những yêu cầu kỹ thuật sau: Hệ thống cung cấp khớ phải được điều chỉnh để kiểm soỏt bọt tạo thành trong khi cỏnh khuấy hoạt động Điện cực dẫn chất chống bọt nờn được thỏo ra để hạn chế độ dớnh của mụi trường chuyển húa Hầu hết cỏc điện