Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hoá đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú (penaeus monodon)'

Từ những nguyên nhân trên mà đề tài "Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hoá đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon)” đã được thực hiện. GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu Theo FAO (2006) thì sản lượng tôm nuôi trên thế giới tăng bình quân hàng năm 10% trong suốt 3 thập niên qua. Trong đó tôm biển là đối tượng nuôi tăng nhanh nhất trong hoạt động nuôi thủy sản trên thế giới. Năm 2008 sản lượng tôm chiếm khoảng 15,4% tổng giá trị sản lượng thủy sản (FAO, 2010a). Sự phát triển nhanh của nghề nuôi tôm biển đã mang lại việc làm cho người dân và tạo nguồn thu nhập ngoại tệ của nhiều quốc gia thuộc Châu Á, Châu Mỹ và Châu Phi (Trung quốc, Thái Lan, Việt Nam, Indonesia, Ecuador, Bangladesh, Ấn Độ, Mexico và Brazil). Năm 2009, mặc dù giá tôm trên thị trường có nhiều biến động nhưng sản lượng tôm vẫn duy trì ở mức ổn định. Những thị trường tiêu thụ tôm lớn nhất bao gồm Hoa Kỳ, Nhật Bản, Tây Ban Nha và các nước cộng đồng Châu Âu (FAO, 2010b). Tôm sú là loài tôm biển được ưa chuộng và được nuôi ở hơn 22 quốc gia trên thế giới (FAO, 2002). Năm 2008, tổng sản lượng tôm sú nuôi trên thế giới đạt 721.867 tấn, với giá trị gần 3,35 tỷ đô la. Riêng ở Việt Nam, nghề nuôi tôm sú phát triển mạnh mẽ đặc biệt là các tỉnh ven biển thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Theo Tổng cục Thống kê Việt Nam (2010), diện tích nuôi tôm biển của Việt Nam là 623.300 ha, chiếm hơn 88% tổng diện tích mặt nước mặn lợ của cả nước, với sản lượng tôm nuôi là 413,1 ngàn tấn và tổng giá trị xấp xỉ 1,5 tỉ USD vào năm 2009. Tuy nhiên, hệ lụy của tốc độ phát triển nuôi tôm công nghiệp đã dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh, do vậy nghề nuôi tôm biển ở các nước trên thế giới cũng như Việt Nam đã gặp những trở ngại lớn. Sản lượng tôm nuôi của nhiều quốc gia suy giảm, ảnh hưởng lớn đến đời sống kinh tế của nhiều dân cư. Trong đa số trường hợp, dịch bệnh xảy ra là kết quả của sự suy thoái môi trường và tôm bị sốc, bao gồm cả bệnh do vi khuẩn và bệnh do virus. Để giải quyết vấn đề này chất hoá học và kháng sinh đã được thường xuyên sử dụng trong hoạt động nuôi tôm (Gomez-Gil et al., 2000; Gräslund và Bengtsson, 2001). Việc sử dụng thuốc kháng sinh không đúng cách đã dẫn đến sự kháng thuốc của những dòng vi khuẩn này (Weston, 1996). Mặt khác sản phẩm thủy sản xuất khẩu không đạt tiêu chuẩn do dư lượng thuốc kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật và vi sinh vật gây bệnh (Đặng Đình Kim và ctv., 2006). Chính vì vậy giải pháp trong phòng trị bệnh đã và đang được đặt ra bao gồm việc quản lý bệnh, địch hại tổng hợp (Li, 2008), đặc biệt là việc sử dụng các vi sinh vật hữu ích (Probiotics) nhằm cải thiện môi trường nuôi và tăng năng suất vật nuôi đã được thực hiện và đem lại nhiều kết quả đáng kể. Sử dụng vi sinh vật hữu ích là một giải pháp tích cực, có nhiều triển vọng để quản lý vi sinh trong ao nuôi thâm canh, hạn chế tối đa thuốc kháng sinh để bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm, hạn chế đáng kể lượng chất hữu cơ thải ra môi trường góp phần phát triển nghề nuôi thủy sản một cách bền vững. Theo Bao và Shen (2005) thì nuôi thủy sản bền vững đòi hỏi phải thiết lập các mô hình nuôi sạch bằng việc sử dụng vi sinh vật hữu ích không có độc tố, không có phản ứng phụ, không có dư lượng và không có sự kháng thuốc, đồng thời có hiệu quả trong việc cải thiện môi trường và gia tăng sức đề kháng cho vật nuôi trong việc giảm bệnh và duy trì cân bằng sinh thái. Trong tình hình này nhiều quốc gia trên thế giới đã áp dụng các quy trình sử dụng chế phẩm vi sinh như Hoa Kỳ, Nhật Bản, các nước trong Cộng đồng Châu Âu, Indonesia, Thái Lan với nhiều kết quả đạt được đáng khích lệ. Probiotics ngày nay đã trở thành hàng hóa ở một số nước và đang hình thành ngành công nghiệp sản xuất vi sinh giống như các ngành công nghiệp khác phục vụ cho nuôi trồng thủy sản (Zhou et al., 2009). Nhiều kết quả ứng dụng vi sinh vật hữu ích rất có ý nghĩa về nhiều mặt như cải thiện chất lượng nước, nâng cao tỉ lệ sống, tăng tăng trưởng và giảm hệ số chuyển hóa thức ăn FCR (Austin et al., 1995; Fuller, 1998; Rengpipat et al., 1998; Dalmin et al., 2001; Irianto và Austin, 2002; Wang, 2005). Một số kết quả nghiên cứu khác cũng đã chứng minh được hiệu quả sử dụng Probiotic mang lại các lợi ích về kinh tế, kỹ thuật, bảo vệ môi trường và đặc biệt trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm (Montes và Pugh,1993). Ở Việt Nam, nhất là vùng ĐBSCL, chế phẩm vi sinh cũng đã và đang được sử dụng rộng khắp trong nuôi thủy sản, nhất là tôm sú từ nhiều năm qua. Tuy nhiên hiệu quả sử dụng chế phẩm vẫn chưa được đánh giá đầy đủ nhất là hiệu quả kinh tế khi sử dụng đại trà ngoài thực địa (Vũ Ngọc Út, 2011). Ngoài ra, hầu hết các chế phẩm vi sinh có mặt trên thị trường hiện nay ở Việt Nam nói chung và ĐBSCL nói riêng, có nguồn gốc nhập nội với chất lượng không ổn định và nhất là giá bán rất cao. Sự khác biệt về điều kiện sinh thái có thể là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến hiệu quả xử lý môi trường và tác động tích cực lên đối tượng nuôi của các chủng vi khuẩn hữu ích trong các chế phẩm vi sinh nhập nội bị hạn chế. Zhou et al. (2009) cũng nhận định rằng ở Trung Quốc việc sử dụng chế phẩm vi sinh trong các ao nuôi tôm, cua cũng gặp nhiều khó khăn và hiệu quả chưa cao do người sử dụng không nắm được nhu cầu về điều kiện sinh thái của các nhóm vi khuẩn có lợi khi đưa vào trong hệ thống nuôi. Các tác giả này cũng đề xuất tốt nhất là cần phải phân lập các dòng vi khuẩn tại chỗ từ các vùng nuôi nước ngọt hoặc mặn để thích ứng với điều kiện sinh thái địa phương. Ngoài sự khác biệt về điều kiện sinh thái, các loại chế phẩm vi sinh nhập nội thường có giá bán cao nên càng ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi. Việc phát triển các chế phẩm vi sinh “bản địa” từ các chủng vi khuẩn hữu ích được phân lập tại chỗ sẽ giúp giải quyết được những hạn chế nêu trên. Vi khuẩn hữu ích có nguồn gốc từ vùng ĐBSCL sẽ thích nghi tốt với điều kiện sinh thái trong vùng và hiệu quả xử lý của chúng sẽ cao và ổn định khi được sử dụng trong môi trường có cùng điều kiện sinh thái. Ngoài ra, giá thành của chế phẩm vi sinh được sản xuất tại chỗ thấp sẽ góp phần đáng kể trong việc tăng hiệu quả sản xuất cho người nuôi, đáp ứng yêu cầu thân thiện môi trường và sản xuất thủy sản bền vững hiện nay. Mặc dù Bộ Thủy sản (2002) đã cho phép lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh trong nuôi thủy sản, tuy nhiên những chế phẩm lưu hành chủ yếu là những chủng loại nhập nội với giá bán cao, hiệu quả của các loại chế phẩm này chưa ổn định và chưa được đánh giá, nhất là hiệu quả kinh tế. Việc nghiên cứu chọn lựa các dòng vi khuẩn hữu ích có nguồn gốc tại địa phương làm cơ sở cho việc sản xuất đại trà chế phẩm vi sinh là rất cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao trong giai đoạn hiện nay nhằm nâng cao hiệu quả nuôi thủy sản, hạn chế sự ô nhiễm môi trường thúc đẩy và tăng cường sự bền vững của nghề nuôi. Từ những nguyên nhân trên mà đề tài "Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hoá đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon)” đã được thực hiện.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN

NGHIÊN CỨU QUẦN THỂ VI KHUẨN CHUYỂN HOÁ ĐẠM

TRONG BÙN ĐÁY AO NUÔI TÔM SÚ

(Penaeus monodon )

LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN

Cần Thơ - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN

NGHIÊN CỨU QUẦN THỂ VI KHUẨN CHUYỂN HOÁ ĐẠM

TRONG BÙN ĐÁY AO NUÔI TÔM SÚ

(Penaeus monodon )

LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản nước Mặn, Lợ

Mã số: 62 62 70 05

Người hướng dẫn khoa học:

PGs Ts NGUYỄN HỮU HIỆP PGs Ts TRƯƠNG QUỐC PHÚ

Cần Thơ – 2012

LỜI CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam kết luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi Tất cả các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong thời gian trước đây bởi tác giả khác

Cần Thơ, ngày … tháng ….năm 2012

TÁC GIẢ

PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN

LỜI CẢM TẠ

Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy sản, Bộ môn Thủy sinh học Ứng dụng, Khoa Thủy sản; Phòng Đào tạo; Phòng Quản lý Khoa học và Phòng Tài vụ Trường Đại học Cần Thơ đã tạo mọi điều kiện cho tôi được thực hiện chương trình Nghiên cứu sinh trong những năm qua

Tôi xin trân trọng và bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn PGs.Ts Nguyễn Hữu Hiệp và PGs.Ts Trương Quốc Phú trong thời gian qua đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu, chăm bồi kiến thức và hoàn thành luận án này

Xin cảm ơn sâu sắc đến PGs.Ts Nguyễn Thanh Phương và PGs.Ts Nguyễn Hữu Hiệp đã hướng dẫn chuyên đề nghiên cứu cho tôi Đặc biệt, trong quá trình nghiên cứu, thực hiện luận án, tôi đã nhận được những lời khuyên, những kinh nghiệm quí báu và sự giúp đỡ nhiệt tình về mặt chuyên môn từ PGs.Ts Đặng Thị Hoàng Oanh, Ts Trần Nhân Dũng, Ths Huỳnh Trường Giang

Sự giúp đỡ một số vật liệu thí nghiệm từ Ths Nguyễn Thị Hồng Vân, Ts Nguyễn Thị Thu Thảo, Ths Huỳnh Thanh Tới (Khoa Thủy sản); Ths Đỗ Tấn Khang, Trần Văn Bé Năm (Viện NC & PT Công nghệ Sinh học); và Ts Dương Minh Viễn (Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng), Trường Đại học Cần Thơ

Đặc biệt, chân thành cảm ơn PGs.Ts Vũ Ngọc Út và tập thể quí thầy cô thuộc Bộ môn Thủy sinh học Ứng dụng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này Hơn nữa, kết quả của luận án cũng nhờ vào sự đóng góp không nhỏ của các em sinh viên Châu Ngọc Sơn, Lê Mỹ Phương, Liễu Như

Ý (Bệnh học Thủy sản K30) Nguyễn Thanh Tâm, Lâm Trung Tính (Lớp Bệnh học Thủy sản K31) Lê Đông Cung, Nguyễn Hoàng Trong, Trương Minh Trường,

Đào Như Ý, Nguyễn Thị Mỹ Tú (Lớp Bệnh học Thủy sản K32) Nguyễn Hữu Anh Duy, Nguyễn Thị Thanh Tâm, Lê Văn Nhiều (Lớp Nuôi trồng Thủy sản Liên thông khóa 2009), Ngô Thị Huyền (Lớp Sinh học biển K34) và Mai Bé Túy (Lớp Bệnh học Thủy sản K33) Đặc biệt chân thành cám ơn Bác sĩ Trần Văn Dũng (ấp Trà Niên, xã Vĩnh Hiệp, huyện Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng) chủ trại nuôi tôm đã tào điều kiện giúp đở chúng tôi được phép thu mẫu trong ao vào giai đoạn đầu của quá trình thực hiện luận án này

Cuối cùng, xin được biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, bạn bè và những người thân đã chia sẻ, giúp đỡ và động viên để tôi có thêm nghị lực hoàn thành

PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN

ABSTRACT

Nitrogen accumulation affects the quality and sustainability of many aquaculture products Using beneficial bacteria to reduce nitrogen accumulation has been widely used for many decades Thus, study on nitrifying bacterial population in intensive shrimp pond sediments has been made The study was conducted from 2008 to 2011 Sampling was made before and after the seed stocking and then every 2 weeks post stocking until the end of the crop The steps

were listed below: (1) three groups of Bacillus, Nitrosomonas and Nitrobacter

were isolated from selective culture medium The bacterial strains were identified

by biochemical tests and molecular technique (2) Water quality and sediment in

the pond were analyzed by standard methods (APHA et al., 1995) Densities of some groups of bacteria (total bacteria, Vibrio, Nitrosomonas and Nitrobacter)

were also determined (3) The isolated strains were selected based on the ability

to improved water quality These strains were tested in 2 stages of shrimp The

first experiments tested on shrimp larvae using three bacterial species: B cereus (B37), Nitrosomonas nitrosa (S8) and Nitrobacter winogradskyi (N10) Bacillus

additional density is 106, 105 and 104 CFU/mL; Nitrosomonas and Nitrobacter

density added is 104 CFU/mL The second experiment tested on postlarvae stage

in the tank 500 L with 3 different kinds of bacteria Bacillus cereus (B9), Bacillus

amyloliquefaciens (B41) and Bacillus subtilis (B67) The density of bacteria

added was 105 - 106 CFU/g The third experiment was arranged similar to

experiment 2 with the addition of Bacillus cereus (B8), B37 and B38 at the

density of 105 - 106 CFU/g The water quality, bacterial density were determined

7 days/times until the end of experiment; survival and growth of the shrimp is determined at the end of the experiment

Nine strains of Bacillus, eight strains of Nitrosomonas and eight strains of

Nitrobacter were selected The collection of nitrifying bacteria in sediments of

intensive shrimp ponds was stored in the freezer at -80 º C in the college of Aquaculture and Fisheries, Can Tho University Based on physiological, biochemical tests and sequencing results strains B8, B9, B37 and B38 were

identified Bacillus cereus; strain B41 and B67 were identified as Bacillus

amyloliquefaciens and Bacillus subtilis respectively Strains S8 and S12 were identified as Nitrosomonas nitrosa and strains N10 and N12 were identified as

Nitrobacter winogradskyi

Most of the environmental parameters and sediment in intensive shrimp ponds were suitable for shrimp culture The density of total bacteria on pond sediment ranged from 104 - 106 CFU/g Bacillus ranging from 104 to 105 CFU/g

tended to be stable during the culture Nitrosomonas ranging from 7 to 2.6 × 103MPN/g Nitrobacter had the lowest density and ranged from 5.5 to 1.9 × 103MPN/g and total Vibrio tended to increase and range from 2.1 × 102 to 1.5 × 105CFU/g

The results from laboratory conditions showed that, the appropriate bacterial density added in tank at larvae stage was 105 CFU/mL for Bacillus This

was the optimal density of bacteria on biodegradation of organic matter and

suppression of other bacteria, especially Vibrio and survival of larval was

improved significantly Six strains tested on shrimp tanks in the laboratory conditions had better results in all parameters compared to control without

addition of bacteria Two strains Bacillus cereus (B37 and B9) were the most

dominant in the environment, maintained at high density, improved water quality, decomposed organic mater, improved survival of shrimp and increased shrimp

growth The survival rate of shrimp in treatments supplemented with Bacillus

higher (93 to 97.2%) compared to no added bacteria (70.8%) Absolute growth

rate of shrimp increased in the Bacillus bacterial treatments (10.7; 8.5 and 7.8 g/ind compared to controls (5.3 g/ind.) In shrimp culture when Bacillus was

introduced the development of natural nitrification bacteria were stimulated due

to the products NH4+/NH3 created by Bacillus Survival rate of shrimp was highest at Bacillus B37 treatment (93.3%), and lowest at control (70%) Absolute

growth in weight was highest in B37 (16.6 g/ind.), while in control was the lowest (5.2 g/ ind) Compared to strains B38; B8; strain B37 had better effect based on improvement of water quality, survival and growth of shrimp

Key words:Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter, water quality, Penaeus monodon

TÓM TẮT

Tích lũy đạm ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng các đối tượng nuôi thủy sản Sử dụng vi sinh vật hữu ích để giảm thiểu tích lũy đạm đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều thập kỹ qua Do vậy, nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú đã được thực hiện Nghiên cứu được tiến hành từ năm 2008 đến 2011 Nhịp thu mẫu được thực hiện trước và sau khi thả tôm và sau đó 2 tuần/lần cho đến khi kết thúc vụ nuôi Các bước thực hiện lần

lượt được liệt kê dưới đây: (1) ba nhóm vi khuẩn Bacillus, Nitrosomonas và

Nitrobacter được phân lập trên môi trường chuyên biệt Các chủng vi khuẩn này được định danh bằng phép thử sinh hóa và sinh học phân tử (2) Chất lượng nước

và bùn đáy ao đã được phân tích theo phương pháp chuẩn (APHA et al., 1995) Mật độ một số nhóm vi khuẩn (vi khuẩn tổng, Vibrio, Bacillus, Nitrosomonas và

Nitrobacter) đã được xác định (3) Các chủng vi khuẩn phân lập được chọn lọc

dựa trên khả năng cải thiện chất lượng nước Các chủng này được thử nghiệm ở 2 giai đoạn Ba thí nghiệm đã được bố trí thử nghiêm như sau Thí nghiệm thứ nhất

thử nghiệm trên ấu trùng tôm sú có sử dụng 3 loài vi khuẩn: B cereus (B37), N

nitrosa (S8) và N winogradskyi (N10) Mật độ Bacillus bổ sung là 106, 105 và

104 CFU/mL; mật độ Nitrosomonas và Nitrobacter được bổ sung là 104

MPN/mL Thí nghiệm thứ 2 thử nghiệm ở giai đoạn tôm giống trong bể 500 L

với 3 dòng vi khuẩn khác nhau B cereus (B9), B amyloliquefaciens (B41) và B

subtilis (B67) Mật độ vi khuẩn được bổ sung là 105 - 106 CFU/g Thí nghiệm 3 được bố trí tương tự như thí nghiệm 2, nhưng bổ sung vi khuẩn B cereus (B8), B37 và B38, với mật độ bổ sung là 105 - 106 CFU/g Các chỉ tiêu chất lượng môi trường nước, mật độ vi khuẩn, được xác định 7 ngày/lần cho đến khi kết thúc thí nghiệm; tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm được xác định vào cuối thí nghiệm

Kết quả đã sưu tập được 9 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus, 8 chủng thuộc nhóm Nitrosomonas và 8 chủng thuộc nhóm Nitrobacter Bộ sưu tập vi

khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm thâm canh hiện đang được lưu

trũ trong tủ đông (-80 ºC) tại Khoa Thủy sản, Đaị học Cần Thơ Căn cứ vào các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và trình tự gen đã định danh được 4 dòng B8, B9, B37

và B38 là Bacillus cereus; B41 là Bacillus amyloliquefaciens và B67 là Bacillus

subtilis ; S8 và S12 là Nitrosomonas nitrosa và N10 và N12 là Nitrobacter

winogradskyi.

Hầu hết các chỉ tiêu môi trường nước và bùn đáy ao nuôi tôm thâm canh tăng dần theo thời gian nuôi và thích hợp cho tôm nuôi Các chỉ tiêu vi sinh trong bùn đáy ao như mật độ vi khuẩn tổng số dao động từ 104 - 106 CFU/g Bacillus

dao động 104 - 105 CFU/g có khuynh hướng ổn định trong suốt vụ nuôi

Nitrosomonas dao động 7 - 2,6 × 103 MPN/g Nitrobacter có mật độ thấp nhất và dao động từ 5,5 - 1,9 × 103 MPN/g và tổng Vibrio có khuynh hướng tăng dần và dao động từ 2,1 × 102 - 1,5 × 105 CFU/g

Những kết quả trong điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy mật độ bổ sung thích hợp trong ương tôm sú ở giai đoạn ấu trùng là 105 CFU/mL đối với

Bacillus. Mật độ này là tối ưu về khả năng phân hủy vật chất hữu cơ và khả năng

lấn át các dòng vi khuẩn khác đặc biệt là vi khuẩn Vibrio và tỉ lệ sống của ấu

trùng đã được cải thiện đáng kể Tất cả sáu dòng vi khuẩn thử nghiệm trên tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm đều cho kết quả tốt hơn về mọi mặt so với bể đối chứng không bổ sung vi khuẩn Hai dòng Bacillus cereus (B37 và B9) là nổi trội nhất về khả năng tồn lưu trong môi trường, duy trì ở mật độ cao, cải thiện chất lượng nước, phân hũy hữu cơ, cải thiện tỉ lệ sống và tăng tăng trưởng của

tôm nuôi Tỉ lệ sống của tôm ở các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn Bacillus cao hơn (93 - 97,2%) so với không bổ sung vi khuẩn (70,8%) Tốc độ tăng trưởng

tuyệt đối của tôm tăng cao ở các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn (10,7; 8,5 và 7,8 g/con so với đối chứng (5,3 g/con) Trong nuôi tôm nếu bổ sung vi khuẩn

Bacillus sẽ kích thích nhóm vi khuẩn nitrate hóa phát triển tự nhiên do Bacillus

tạo ra sản phẩm NH4+/NH3 Tỉ lệ sống của tôm khi bổ sung Bacillus B37 cao nhất

(93,3%), còn đối chứng thấp nhất (70%) Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối về trọng

lượng cao nhất ở B37 (16,6 g/con), trong khi đó ở nghiệm thức đối chứng là thấp nhất (5,2 g/con) So với chủng B38; B8; chủng B37 có hiệu quả tốt hơn dựa trên các chỉ tiêu về chất lượng nước, tỉ lệ sống và tốc độ tăng trưởng

Từ khóa: Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter, ch ất lượng nước, tôm sú.

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM TẠ ii

ABSTRACT iv

TÓM TẮT vii

MỤC LỤC x

DANH SÁCH BẢNG xv

DANH SÁCH HÌNH xvii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xx

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu của nghiên cứu 4

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 4

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 4

1.3 Nội dung nghiên cứu 4

1.4 Ý nghĩa của luận án 6

1.5 Điểm mới của luận án 6

Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 7

2.1 Khái quát về tôm sú, hiện trạng môi trường và dịch bệnh trong nuôi tôm sú 7

2.1.1 Khái quát về tôm sú 7

2.1.1.1 Vị trí phân loại tôm sú 7

2.1.1.2 Sơ lược về đặc điểm sinh học của tôm sú 7

2.1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện sống của tôm 9

2.1.2 Hiện trạng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh trong nuôi tôm thâm canh 12

2.1.2.1 Hiện trạng ô nhiễm môi trường trong ao nuôi tôm thâm canh .12

2.1.2.2 Các bệnh thường xảy ra cho tôm khi ao nuôi thâm canh bị nhiễm bẩn 13

2.1.2.3 Các chất độc sinh ra từ quá trình phân hủy chất thải trong ao nuôi thâm canh 14

2.1.3 Xử lý ô nhiễm môi trường bằng phương pháp sinh học 17

2.1.3.1 Sử dụng vi sinh vật hữu ích (Probiotic) 17

2.1.3.2 Các ứng dụng của vi sinh vật hữu ích trong nuôi tôm 18

2.2 Các cơ chế tác động của chế phẩm vi sinh (Probiotic) 19

2.2.1 Sản sinh ra các hợp chất ức chế 19

2.2.2 Cạnh tranh chất dinh dưỡng và năng lượng 20

2.2.3 Cạnh tranh chổ cư trú 20

2.2.4 Tăng cường các phản ứng miễn dịch 21

2.2.5 Cải thiện chất lượng nước 22

2.3 Vai trò của vi khuẩn phân hủy hữu cơ và chuyển hóa đạm 24

2.3.1 Quá trình ammon hóa 24

2.3.1.1 Đặc điểm và vai trò của vi khuẩn tham gia phân hũy hữu cơ 24

2.3.1.2 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus 26

2.3.2 Các quá trình chuyển hoá nitơ vô cơ và vai trò các nhóm vi khuẩn nitrate hóa 31

2.3.2.1 Quá trình nitrate hóa 32

2.3.2.2 Đặc điểm sinh học và vai trò của vi khuẩn Nitrosomonas 36

2.3.3 Kỹ thuật PCR và ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản 40

2.3.3.1 Kỹ thuật PCR 40

2.3.3.2 Kỹ thuật điện di ADN trên gel agarose 42

2.3.3.3 Kỹ thuật giải trình tự Nucleotid trong AND 42

2.3.3.4 Ứng dụng kỹ thuật PCR để định danh vi khuẩn trong NTTS .44

Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 47

3.2 Đối tượng nghiên cứu 47

3.3 Chu kỳ thu mẫu 47

3.4 Đặc điểm ao nuôi, chế độ chăm sóc tôm và bón vi sinh trong ao thu mẫu 47

3.5 Các bước chuẩn bị trước khi thu mẫu 49

3.6 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 49

3.6.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 49

3.6.2 Môi trường và hóa chất 51

3.7 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn trong ao 51

3.7.1 Phương pháp thu mẫu nền đáy 51

3.7.2 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn 52

3.7.2.1 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus sp 52

3.7.2.2 3.7.2.3

Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn Nitrosomonas sp

Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn Nitrobacter sp

58 60 3.8 Phương pháp xác định biến động chất lượng nước và vi khuẩn trong ao nuôi tôm sú 63

3.8.1 Phương pháp thu mẫu và xác định chất lượng nước và bùn đáy ao 63

3.8.1.1 Phương pháp thu mẫu .63

3.2.1.2 Phương pháp phân tích chất lượng nước 63

3.8.1.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn .64

3.9 Các thí nghiệm đánh giá hiệu quả xử lý nước của vi khuẩn chọn lọc 68

3.9.1 Thanh lọc vi khuẩn … 68

3.9.1.1 Bacillus 68

3.9.1.2 Nitrosomonas 68

3.9.1.3 Nitrobacter 69

3.9.2 Điều kiện bố trí thí nghiệm 69

3.9.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn B37, S8 và N10 lên ấu trùng tôm sú trong hệ thống ương tuần hoàn 69

3.9.3.1 Vật liệu thí nghiệm 69

3.9.3.2 Bố trí thí nghiệm 70

3.9.3.3 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn 71

3.9.3.4 Các chỉ tiêu theo dõi .72

3.9.3.5 Phương pháp thu và phân tích mẫu chất lượng nước 72

3.9.3.6 Phương pháp thu và phân tích mẫu vi khuẩn 72

3.9.3.7 Phương pháp phân tích mẫu tôm 72

3.9.4 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus B9, B41, B67 lên chất lượng nước bể nuôi tôm sú 73

3.9.4.1 Vật liệu thí nghiệm 73

3.9.4.2 Bố trí thí nghiệm 73

3.9.4.3 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn 74

3.9.4.4 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn 74

3.9.4.5 Phương pháp thu và phân tích chất lượng nước 74

3.9.4.6 Cách cho ăn và quản lý tôm nuôi thí nghiệm 74

3.9.4.7 Phương pháp phân tích mẫu tôm 75

3.9.5 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus B8, B37, B38 lên chất lượng nước bể nuôi tôm sú .75

3.9.5.1 Vật liệu thí nghiệm 75

3.9.5.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 76

3.9.5.3 Phương pháp xác định mật độ các nhóm vi khuẩn 76

3.9.6 Phương pháp xử lý số liệu 76

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 77

4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn chuyển hóa đạm từ bùn đáy ao nuôi tôm 77

4.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus 77

4.1.1.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus 77

4.1.1.2 Định danh vi khuẩn Bacillus .77

4.1.2 Phân lập và định danh vi khuẩn Nitrosomonas 89

4.1.2.1 Phân lập vi khuẩn Nitrosomonas 89

4.1.2.2 Định danh vi khuẩn Nitrosomonas 90

4.1.3 Phân lập và định danh vi khuẩn Nitrobacter 95

4.1.3.1 Phân lập vi khuẩn Nitrobacter 95

4.1.3.2 Định danh vi khuẩn Nitrobacter .96

4.2 Biến động các yếu tố môi trường và vi khuẩn trong ao nuôi 99

4.2.1 Biến động các yếu tố môi trường trong ao nuôi tôm thâm canh 99

4.2.1.1 Nhiệt độ 99

4.2.1.2 Độ mặn 100

4.2.1.3 pH .101

4.2.1.4 Tổng vật chất lơ lững TSS 102

4.2.1.5 Oxy hòa tan 103

4.2.1.6 Tổng đạm amon TAN-NH3/NH4+ 104

4.2.1.7 Nitrite 106 4.2.1.8 Nitrate 107

4.2.1.9 Khí độc H2S 108

4.2.1.10 Tổng đạm TN đáy ao 110

4.2.1.11 Sự tích lũy hữu cơ dưới đáy ao 111

4.2.2 Biến động mật độ vi khuẩn trong ao nuôi tôm thâm canh 112

4.2.2.1 Tổng vi khuẩn và Vibrio trong bùn đáy ao 113

4.2.2.2 Mật độ vi khuẩn Bacillus trong bùn đáy ao 113

4.2.2.3 Mật đọ vi khuản Nitrosomonas và Nitrobacter trong bùn đáy ao 113

4.3 Đánh giá khả năng chuyển hóa đạm của nhóm vi khuẩn phân lập và vai trò của chúng trong việc cải thiện chất lượng nước ở quy mô phòng thí nghiệm 115

4.3.1 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus chọn lọc B37, Nitrosomonas S8 và Nitrobacter N10 lên chất lượng nước trong hệ thống ương tôm sú tuần hoàn 115

4.3.1.1 Biến động các chỉ tiêu môi trường 116

4.3.1.2 Biến động mật số vi khuẩn trong nước và trong giá thể 123

4.3.1.3 Tỷ lệ sống của ấu trùng 126

4.3.2 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus chọn lọc B9, B41, B67 lên chất lượng nước bể nuôi tôm sú thương phẩm 127 4.3.2.1 Biến động các yếu tố môi trường 127

4.3.2.2 Biến động mật độ vi sinh 134

4.3.2.3 Chất lượng tôm nuôi 137

4.3.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus chọn lọc B8, B37 và B38 lên chất lượng nước trong bể nuôi tôm thương phẩm 139

4.3.3.1 Điều kiện thí nghiệm 139

4.3.3.2 Biến động các yếu tố môi trường 139

4.3.3.3 Biến động mật độ vi khuẩn trong bùn 146

4.3.3.4 Chất lượng tôm nuôi 149

4.4 Thảo luận chung 151

4.4.1 Thành phần loài vi khuẩn định danhtrong ao nuôi tôm 151

4.4.2 Ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn chọn lọc lên chất lượng 153

nước trong bể nuôi tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm

4.4.3 Nhận xét 155

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 156

5.1 Kết luận 156

5.2 ĐỀ XUẤT 157 TÀI LIỆU THAM KHẢO I-XXI

A-GG

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Tuổi và kích cỡ các giai đoạn ấu trùng tôm sú 9

Bảng 2.2 Một số dòng Bacillus trong chế phẩm sinh học và công dụng của chúng 25

Bảng 2.3 Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 16S rDNA và kết quả định lượng các vi khuẩn có trong các Probiotics sử dụng trong thủy sản .46

Bảng 3.1 Các chỉ tiêu môi trường và phương pháp phân tích 64

Bảng 4.1 Danh mục các chủng Bacillus chọn lọc 79

Bảng 4.2 Kết quả xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa vi khuẩn Bacillus 79

Bảng 4.3 Kết quả so sánh trình tự của các dòng vi khuẩn Bacillus đã phân lập 82

Bảng 4.4 So sánh trình tự của Bacillus B9 và B38 trên ngân hàng gen (DQ339674.1 - B cereus) sử dụng cặp mồi chung 16F8 và 16R1391 83

Bảng 4.5 So sánh trình tự của Bacillus B8 và B37 trên ngân hàng gen (DQ339674.1 - B cereus) sử dụng cặp mồi 16F và 16R 85

Bảng 4.6 So sánh trình tự của Bacillus B41 trên ngân hàng gen (AYO55219.1 - B.amyloliquefaciens) sử dụng cặp bắt mồi 16F và 16R

86 Bảng 4.7 So sánh trình tự của Bacillus B67 trên ngân hàng gen (JN585706.1-B.subtilis) sử dụng cặp bắt mồi 16F và 16R 87

Bảng 4.8 Danh mục các chủng vi khuẩn Nitrosomonas đã phân lập được và phép thử sinh hóa 91

Bảng 4.9 Kết quả so sánh trình tự của các dòng vi khuẩn Nitrosomonas phân lập 93

Bảng 4.10 So sánh trình tự của Nitrosomonas S6, S10 trên ngân hàng gen (AF272404.1-N nitrosa) sử dụng cặp mồi đặt hiệu AmoaA 1F và AmoA 94

Bảng 4.11 So sánh trình tự của Nitrosomonas S12 trên ngân hàng gen (AF272404.1-N nitrosa) sử dụng cặp mồi đặc hiệu AmoA 1F và AmoA 95

Bảng 4.12 Danh mục các chủng vi khuẩn Nitrobacter đã phân lập 96

Bảng 4.13 So sánh trình tự của Nitrobacter N10 và N12 trên ngân hàng gen sử dụng cặp mồi đặc hiệu PNTG 2R và PNTG 1F 99

Bảng 4.14 Tỉ lệ sống của tôm giai đoạn ấu trùng đến giai đoạn biến thái

postlarvae 127

Bảng 4.15 Tốc độ tăng trưởng của tôm sú 138

Bảng 4.16 Tỉ lệ sống của tôm sú vào cuối thí nghiệm 139

Bảng 4.17 Tốc độ tăng trưởng về khối lượng của tôm thí nghiệm 149

Bảng 4.18 Tỉ lệ sống của tôm vào cuối thí nghiệm 150

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu của đề tài 5

Hình 2.1 Vòng đời tôm biển 8

Hình 2.2 Hình dạng tế bào vi khuẩn Bacillus 26

Hình 2.3 Vòng tuần hoàn nitơ 32

Hình 2.4 Phương pháp Enzyme giải trình tự ADN 45

Hình 3.1 Ao thu mẫu và sản phẩm vi sinh 48

Hình 3.2 Kính hiển vi và các dụng cụ phan tích chất lượng nước 50

Hình 3.3 Một số thiết bị trích ADN 50

Hình 3.4 Một số thiết bị PCR, điện di và giải trình tự 50

Hình 3.5 Phương pháp thu mẫu bùn đáy ao 52

Hình 3.6 Sơ đồ hệ thống lọc tuần hoàn 70

Hình 3.7 Nuôi tăng sinh vi khuẩn và hệ thống thí nghiệm 74

Hình 4.1 Hình dạng vi khuẩn Bacillus .78

Hình 4.2 Bảng ứng thủy phân tinh bột, Gelatin và Casein 80

Hình 4.3a Kết quả điện di sản phẩm PCR ứng dụng qui trình PCR định danh vi khuẩn Bacillus B9 81

Hình 4.3b Kết quả điện di sản phẩm PCR ứng dụng qui trình PCR định danh vi khuẩn Bacillus B38 81

Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR ứng dụng qui trình PCR định danh Bacillus .81

Hình 4.5 Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa Nitrosomonas sp 92

Hình 4.6 Kết quả điện di PCR ứng dụng qui trình PCR 92

Hình 4.7 Kết quả nhuộm Gram và kiểm tra đặc điểm sinh hóa Nitrobacter 97

Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR ứng dụng qui trình PCR 98

Hình 4.9 Sự biến động nhiệt độ trong thời gian thu mẫu 100

Hình 4.10 Sự biến động độ mặn trong thời gian thu mẫu 101

Hình 4.11 Sự biến động pHtrong thời gian thu mẫu 102

Hình 4.12 Sự biến động tổng vật chất lơ lững (TSS) trong thời gian thu

mẫu 103

Hình 4.13 Sự biến động DO trong thời gian thu mẫu 104

Hình 4.14 Sự biến động TAN trong thời gian thu mẫu 105

Hình 4.15 Sự biến động NO2- trong thời gian thu mẫu 106

Hình 4.16 Sự biến động NO3- trong thời gian thu mẫu 108

Hình 4.17 Sự biến động H2S trong thời gian thu mẫu 109

Hình 4.18 Sự biến động TN trong bùn đáy ao 110

Hình 4.19 Sự tích lũy hữu cơ trong bùn đáy ao 111

Hình 4.20 Sự biến động tổng vi khuẩn và Vibrio trong bùn đáy ao 112

Hình 4.21 Mật độ vi khuẩn Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter trong bùn đáy ao 115

Hình 4.22 Biến động hàm lượng COD 117

Hình 4.23 Biến động hàm lượng TAN 118

Hình 4.24 Biến động hàm lượng NO2- 119

Hình 4.25 Biến động hàm lượng NO3- 120

Hình 4.26 Biến động hàm lượng TN 121

Hình 4.27 Biến động hàm lượng TSS 122

Hình 4.28 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus 124

Hình 4.29 Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio 124

Hình 4.30 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong nước 125

Hình 4.31 Biến động TSS trong quá trình thí nghiệm 128

Hình 4.32 Biến động Oxy hòa tan trong thời gian thí nghiệm 129

Hình 4.33 Biến động COD trong thời gian thí nghiệm 130

Hình 4.34 Biến động H2S trong thời gian thí nghiệm 131

Hình 4.35 Biến động TAN trong thời gian thu mẫu 132

Hình 4.36 Biến động NO2- trong thời gian thí nghiệm 133

Hình 4.37 Biến động NO3- trong thời gian thí nghiệm 133

Hình 4.38 Biến động TN trong thời gian thí nghiệm 134

Hình 4.39 Biến động mật độ Bacillus trong thời gian thí nghiệm 135

Hình 4.40 Biến động Vibrio trong thời gian thí nghiệm 136

Hình 4.41 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong thời gian thí nghiệm 137

Hình 4.42 Biến động oxy hòa tan trong thí nghiệm 140

Hình 4.43 Biến động COD trong thí nghiệm 141

Hình 4.44 Biến động H2S trong thí nghiệm 142

Hình 4.45 Biến động TAN trong thí nghiệm 143

Hình 4.46 Biến động NO2- trong thí nghiệm 144

Hình 4.47 Biến động NO3- trong thí nghiệm 144

Hình 4.48 Biến động TN ở bùn trong thí nghiệm 145

Hình 4.49 Tỉ lệ (%) vật chất hữu cơ trong bùn đáy bể thí nghiệm 146

Hình 4.50 Biến động mật độ Bacillus trong bùn 147

Hình 4.51 Biến động mật độ Vibrio trong bùn 147

Hình 4.52 Biến động mật độ Nitrosomonas trong bùn 148

Hình 4.53 Biến động mật độ Nitrobacter trong bùn 149

DO: Dissolved oxygen (oxy hòa tan)

FAO: Food and Agriculture Organization (tổ chức Lương thực và

Nông nghiệp Liên Hợp Quốc) MPN: Most Probable Number (số khả hữu)

NOB: Nitrite- oxidizing- bacteria (vi khuẩn oxy hóa nitrite)

NA: Nutrient Agar

NTTS: Nuôi trồng Thủy sản

NT: Nghiệm thức

LB: Luria - Bertani

OD: Optical Density (mật độ quang)

PCR: Polymerase Chain Reaction (phản ứng tổng hợp dây chuyền

nhờ polymerase) DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (điện di biến tính) OSS: Organic Suspended Solids (tổng vật chất hữu cơ lơ lửng) TAN: Total ammonia nitrogen (tổng đạm nitơ)

TCBS: Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar

TN: Total nitrogen (tổng đạm)

TOM: Total organic mater (tổng vật chất hữu cơ)

TSA: Tripticase Soya Agar

TSB: Tripticase Soya Broth

TSS: Total suspended solids (tổng vật chất lơ lửng)

Âu (FAO, 2010b) Tôm sú là loài tôm biển được ưa chuộng và được nuôi ở hơn

22 quốc gia trên thế giới (FAO, 2002) Năm 2008, tổng sản lượng tôm sú nuôi trên thế giới đạt 721.867 tấn, với giá trị gần 3,35 tỷ đô la Riêng ở Việt Nam, nghề nuôi tôm sú phát triển mạnh mẽ đặc biệt là các tỉnh ven biển thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) Theo Tổng cục Thống kê Việt Nam (2010), diện tích nuôi tôm biển của Việt Nam là 623.300 ha, chiếm hơn 88% tổng diện tích mặt nước mặn lợ của cả nước, với sản lượng tôm nuôi là 413,1 ngàntấn

và tổng giá trị xấp xỉ 1,5 tỉ USD vào năm 2009

Tuy nhiên, hệ lụy của tốc độ phát triển nuôi tôm công nghiệp đã dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh, do vậy nghề nuôi tôm biển ở các nước trên thế giới cũng như Việt Nam đã gặp những trở ngại lớn Sản lượng tôm nuôi của nhiều quốc gia suy giảm, ảnh hưởng lớn đến đời sống kinh tế của nhiều dân cư Trong đa số trường hợp, dịch bệnh xảy ra là kết quả của sự suy thoái môi trường và tôm bị sốc, bao gồm cả bệnh do vi khuẩn và bệnh do virus Để giải

quyết vấn đề này chất hoá học và kháng sinh đã được thường xuyên sử dụng

trong hoạt động nuôi tôm (Gomez-Gil et al., 2000; Gräslund và Bengtsson, 2001)

Việc sử dụng thuốc kháng sinh không đúng cách đã dẫn đến sự kháng thuốc của những dòng vi khuẩn này (Weston, 1996) Mặt khác sản phẩm thủy sản xuất khẩu không đạt tiêu chuẩn do dư lượng thuốc kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật và vi

sinh vật gây bệnh (Đặng Đình Kim và ctv., 2006)

Chính vì vậy giải pháp trong phòng trị bệnh đã và đang được đặt ra bao gồm việc quản lý bệnh, địch hại tổng hợp (Li, 2008), đặc biệt là việc sử dụng các

vi sinh vật hữu ích (Probiotics) nhằm cải thiện môi trường nuôi và tăng năng suất vật nuôi đã được thực hiện và đem lại nhiều kết quả đáng kể Sử dụng vi sinh vật hữu ích là một giải pháp tích cực, có nhiều triển vọng để quản lý vi sinh trong ao nuôi thâm canh, hạn chế tối đa thuốc kháng sinh để bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm, hạn chế đáng kể lượng chất hữu cơ thải ra môi trường góp phần phát triển nghề nuôi thủy sản một cách bền vững Theo Bao và Shen (2005) thì nuôi thủy sản bền vững đòi hỏi phải thiết lập các mô hình nuôi sạch bằng việc sử dụng vi sinh vật hữu ích không có độc tố, không có phản ứng phụ, không có dư lượng và không có sự kháng thuốc, đồng thời có hiệu quả trong việc cải thiện môi trường

và gia tăng sức đề kháng cho vật nuôi trong việc giảm bệnh và duy trì cân bằng sinh thái

Trong tình hình này nhiều quốc gia trên thế giới đã áp dụng các quy trình

sử dụng chế phẩm vi sinh như Hoa Kỳ, Nhật Bản, các nước trong Cộng đồng Châu Âu, Indonesia, Thái Lan với nhiều kết quả đạt được đáng khích lệ Probiotics ngày nay đã trở thành hàng hóa ở một số nước và đang hình thành ngành công nghiệp sản xuất vi sinh giống như các ngành công nghiệp khác phục

vụ cho nuôi trồng thủy sản (Zhou et al., 2009) Nhiều kết quả ứng dụng vi sinh

vật hữu ích rất có ý nghĩa về nhiều mặt như cải thiện chất lượng nước, nâng cao tỉ

lệ sống, tăng tăng trưởng và giảm hệ số chuyển hóa thức ăn FCR (Austin et al., 1995; Fuller, 1998; Rengpipat et al., 1998; Dalmin et al., 2001; Irianto và Austin,

2002; Wang, 2005) Một số kết quả nghiên cứu khác cũng đã chứng minh được hiệu quả sử dụng Probiotic mang lại các lợi ích về kinh tế, kỹ thuật, bảo vệ môi trường và đặc biệt trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm (Montes và Pugh, 1993)

Ở Việt Nam, nhất là vùng ĐBSCL, chế phẩm vi sinh cũng đã và đang được sử dụng rộng khắp trong nuôi thủy sản, nhất là tôm sú từ nhiều năm qua Tuy nhiên hiệu quả sử dụng chế phẩm vẫn chưa được đánh giá đầy đủ nhất là hiệu quả kinh tế khi sử dụng đại trà ngoài thực địa (Vũ Ngọc Út, 2011) Ngoài ra, hầu hết các chế phẩm vi sinh có mặt trên thị trường hiện nay ở Việt Nam nói chung và ĐBSCL nói riêng, có nguồn gốc nhập nội với chất lượng không ổn định

và nhất là giá bán rất cao Sự khác biệt về điều kiện sinh thái có thể là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến hiệu quả xử lý môi trường và tác động tích cực lên đối tượng nuôi của các chủng vi khuẩn hữu ích trong các chế phẩm vi

sinh nhập nội bị hạn chế Zhou et al (2009) cũng nhận định rằng ở Trung Quốc

việc sử dụng chế phẩm vi sinh trong các ao nuôi tôm, cua cũng gặp nhiều khó khăn và hiệu quả chưa cao do người sử dụng không nắm được nhu cầu về điều kiện sinh thái của các nhóm vi khuẩn có lợi khi đưa vào trong hệ thống nuôi Các tác giả này cũng đề xuất tốt nhất là cần phải phân lập các dòng vi khuẩn tại chỗ từ các vùng nuôi nước ngọt hoặc mặn để thích ứng với điều kiện sinh thái địa phương

Ngoài sự khác biệt về điều kiện sinh thái, các loại chế phẩm vi sinh nhập nội thường có giá bán cao nên càng ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi Việc phát triển các chế phẩm vi sinh “bản địa” từ các chủng vi khuẩn hữu ích được phân lập tại chỗ sẽ giúp giải quyết được những hạn chế nêu trên Vi khuẩn hữu ích có nguồn gốc từ vùng ĐBSCL sẽ thích nghi tốt với điều kiện sinh thái trong vùng và hiệu quả xử lý của chúng sẽ cao và ổn định khi được sử dụng trong môi trường có cùng điều kiện sinh thái Ngoài ra, giá thành của chế phẩm vi sinh được sản xuất tại chỗ thấp sẽ góp phần đáng kể trong việc tăng hiệu quả sản xuất cho người

nuôi, đáp ứng yêu cầu thân thiện môi trường và sản xuất thủy sản bền vững hiện nay

Mặc dù Bộ Thủy sản (2002) đã cho phép lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh trong nuôi thủy sản, tuy nhiên những chế phẩm lưu hành chủ yếu là những chủng loại nhập nội với giá bán cao, hiệu quả của các loại chế phẩm này chưa ổn định và chưa được đánh giá, nhất là hiệu quả kinh tế Việc nghiên cứu chọn lựa các dòng vi khuẩn hữu ích có nguồn gốc tại địa phương làm cơ sở cho việc sản xuất đại trà chế phẩm vi sinh là rất cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao trong giai đoạn hiện nay nhằm nâng cao hiệu quả nuôi thủy sản, hạn chế sự ô nhiễm môi trường thúc đẩy và tăng cường sự bền vững của nghề nuôi Từ những

nguyên nhân trên mà đề tài "Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hoá đạm

trong bùn đáy ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon)” đã được thực hiện

1.2 Mục tiêu của nghiên cứu

1.2.1 M ục tiêu tổng quát

Nghiên cứu thành lập bộ chủng vi khuẩn hữu ích có nguồn gốc từ các ao nuôi tôm sú thâm canh nhằm bổ sung bộ sưu tập vi khuẩn làm cơ sở khoa học trong việc chọn lựa các dòng vi khuẩn hữu ích để sản xuất chế phẩm vi sinh

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Sưu tập và định danh các nhóm vi khuẩn chuyển hoá đạm phân lập từ ao

nuôi tôm sú thâm canh qua một chu kỳ nuôi

- Xác định biến động các yếu tố môi trường và yếu tố vi sinh vật qua một chu kỳ nuôi

- Đánh giá khả năng cải thiện chất lượng nước của nhóm vi phân lập và vai trò của chúng trong ương nuôi tôm trong bể ở qui mô phòng thí nghiệm

Hình 1.1: Sơ đồ nội dung nghiên cứu của đề tài

Chọn lọc vi khuẩn

Vai trò của vi khuẩn

Bacillus Nitrosomonas Nitrobacter

r

Bùn đáy ao tôm sú

Phân lập vi khuẩn

Định danh vi khuẩn

Chọn được chủng vi khuẩn chuyển hóa đạm tốt nhất trong bùn đáy ao nuôi tôm sú

Ương tôm sú

giống

Nuôi tôm sú thương phẩm

Đánh giá vai trò của vi khuẩn trong thí nghiệm

Môi trường ao nuôi

Đánh giá biến động môi trường động vi khuẩn Đánh giá biến

1.4 Ý nghĩa của luận án

Luận án nhằm bổ sung bộ sưu tập những dòng vi khuẩn hữu ích có hiệu quả xử lý nước tốt nhất trong nuôi tôm và những kết luận khoa học về ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn này lên sự thay đổi các chỉ tiêu chất lượng nước và tăng trưởng của tôm sú vào nguồn cơ sở dữ liệu khoa học chung về ứng dụng vi khuẩn hữu ích, làm cơ sở để phục vụ cho nghề nuôi tôm sú phát triển bền vững

1.5 Điểm mới của luận án

Luận án đã phân lập, chọn lọc và đánh giá được hiệu quả cải thiện chất lượng nước của một số loài vi khuẩn hữu ích trong ao nuôi tôm sú thâm canh

Luận án đã xác định được mật độ bổ sung vi khuẩn Bacillus thích hợp vào hệ

thống nuôi đạt hiệu quả cải thiện chất lượng nước trong hệ thống ương tuần hoàn

và nuôi tôm thương phẩm Định danh được các dòng vi khuẩn phân hủy hữu cơ

và chuyển hóa đạm có hiệu quả cải thiện chất lượng nước tốt nhất trong hệ thống ương, nuôi tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm

Luận án đã đi sâu tìm hiểu động thái của quần thể vi khuẩn trong ao, cũng như các biến động chất lượng môi trường trong ao nuôi thâm canh thông qua một chu kỳ nuôi

Luận án đã xác định được các loài vi khuẩn trong ao nuôi tôm sú thâm

canh, trong đó loài vi khuẩn B cereus là loài chiếm ưu thế Loài chiếm ưu thế này không phải là loài có trong chế phẩm vi sinh (B subtilis và B licheniformis)

Luận án đã cho thấy rằng nếu bổ sung vi khuẩn Bacillus vào hệ thống

ương với mật độ 105 – 106 CFU/mL thì chất lượng nước cũng như sức khỏe tôm được cải thiện đáng kể Như vậy nếu sử dụng chế phẩm vi sinh thì hầu hết các chỉ tiêu môi trường đều nằm trong mức cho phép và quần thể vi khuẩn phân hủy hữu

cơ ổn định trong suốt quá trình nuôi Vi khuẩn Nitrate hóa ban đầu chưa xuất hiện, chỉ sau thời gian nuôi 3 tuần mới hiện diện và tăng dần mật số theo thời gian

nuôi Cuối cùng 6 dòng vi khuẩn là B subtilis (B41), B cereus (B8, B9, B37, B38) và B amyloliquefaciens (B67) có thể được sử dụng sản xuất chế phẩm vi

sinh

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Khái quát về tôm sú, hiện trạng môi trường và dịch bệnh trong nuôi tôm

2.1.1 Khái quát về tôm sú

2.1.1.1 Vị trí phân loại tôm sú

Theo hệ thống phân loại của ITIS, (Anderson, 2001) Tôm sú thuộc: Ngành: Arthopoda (Chân khớp) Ngành phụ: Crustacea (Giáp xác) Lớp: Malacostraca (Giáp xác lớn) Bộ: Decapoda (Bộ mười chân) Bộ phụ: Natantia

(Bơi lội) Họ: Penaeidae (Tôm he) Giống: Penaeus Loài: Penaeus monodon

2.1.1.2 Sơ lược về đặc điểm sinh học của tôm sú

Theo Motoh (1981), tôm sú phân bố rộng khắp các thủy vực vùng nhiệt đới, tập trung chủ yếu ở vùng Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương, Đông và Đông Nam Châu Phi, Pakistan, Nhật Bản, Bắc Úc, Trung Quốc Đặc biệt, tôm sú phân

bố nhiều nhất ở Đông Nam Châu Á (Đài Loan, Philippines, Indonesia, Thái Lan, Malaysia)

Vòng đời của tôm sú trãi qua các giai đoạn như trứng, ấu trùng, hậu ấu trùng, ấu niên (tiền trưởng thành) và trưởng thành (Motoh, 1981, Hình 2.1) Trong giai đoạn ấu trùng gồm các giai đoạn phụ như Nauplii có 6 giai đoạn, Zoea

có 3 giai đoạn và Mysis có 3 giai đoạn (Bảng 2.1; Kungvankij et al., 1986; Dall et

al., 1990, trích dẫn bởi Trần Ngọc Hải và Nguyễn Thanh Phương, 2009) Mỗi giai đoạn phân bố ở những vùng khác nhau như vùng cửa sông, biển ven bờ hay vùng biển khơi và có tính sống trôi nổi hay sống đáy Giai đoạn trứng và ấu trùng thì sống trôi nổi ở vùng biển khơi nhờ vào dòng chảy của thủy triều Khi chuyển sang giai đoạn hậu ấu trùng và tôm giống thì tôm sú hoàn thiện dần các cơ quan chức năng để thích nghi với đời sống ở đáy, lúc này gai chũy phát triển và hệ

thống mang phát triển hoàn chỉnh, ở giai đoạn này tôm sử dụng chân bò để đi lại

và bắt mồi, chân bơi để bơi lội, cơ quan sinh dục đực và cái đã xuất hiện và hoàn thiện dần Trong thời gian này tôm tìm đến vùng cửa sông và thường cư trú ở những nơi có độ mặn thích hợp từ 5 - 20‰ để tìm kiếm thức ăn, sinh trưởng và phát triển Trong suốt quá trình di cư này, tôm sú tích lũy vật chất dinh dưỡng liên tục để lột xác và lớn lên để bảo đảm chức năng duy trì nòi giống (Motoh, 1981) Cũng theo Motoh (1981), ở giai đoạn tiền trưởng thành tôm sú thường di

cư ngược lại, từ cửa sông hay rừng ngập mặn ra biển khơi, đây là thời kỳ thành thục sinh dục Trong quá trình di cư xảy ra quá trình bắt cặp giao vĩ giữa tôm đực

và tôm cái Ngược lại ở giai đoạn trưởng thành thì tôm sú di cư ra ngoài biển sâu

và đẻ trứng

Hình 2.1: Vòng đời tôm biển (Motoh, 1981)

Bảng 2.1: Tuổi và kích cỡ các giai đoạn ấu trùng tôm sú (Ngu ồn: Trần Ngọc Hải và Nguy ễn Thanh Phương, 2009)

Các yếu tố môi trường nước có ảnh hưởng rất lớn đến sự phân bố, sinh sống, bắt mồi, tăng trưởng và tỉ lệ sống của tôm Theo Boyd và Fast (1992, trích dẫn bởi Trần Ngọc Hải và Nguyễn Thanh Phương, 2009), trong các yếu tố lý, hóa, sinh của nước và đất có ảnh hưởng đến tôm thì đáng quan tâm là các yếu tố dưới đây:

a) Nhiệt độ, pH và độ mặn

Nhiệt độ là một trong những yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp đến tôm và các hoạt động của chúng, nhất là khả năng bắt mồi Nhiệt độ thay đổi đột ngột sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến tôm hơn là thay đổi từ từ và nếu nhiệt độ cao hơn 32 -

33 °C hay thấp hơn 25 °C thì mức bắt mồi có thể giảm 30 - 50% (Chanratchakool

et al., 2003) Theo báo cáo của Jackson và Wang (1998) thì nhiệt độ, nồng độ muối và oxy hòa tan là những yếu tố chính ảnh hưởng đến tỉ lệ sống và sự tăng trưởng của tôm nuôi thâm canh pH của nước cũng rất quan trọng, ảnh hưởng trực

tiếp tới sự sinh trưởng và phát triển của tôm (Chanratchakool et al., 1995) pH

thích hợp cho sự phát triển của tôm sú là 7.5 - 8.5 và khoảng dao động hằng ngày không vượt quá 0.5 đơn vị pH, pH dưới 4 hay trên 10 có thể gây chết tôm (Trần

Ngọc Hải, 2009; Nguyễn Trọng Nho và ctv., 2002) Theo Whetstone et al (2002)

tôm sú có thể sinh trưởng và phát triển bình thường trong môi trường có nồng độ muối từ 15 - 35‰ Độ mặn thấp thì khả năng đệm của nước thấp làm pH dễ biến động và các loài tảo và rong phát triển mạnh gây suy giảm chất lượng nước

b) Oxy hoà tan

Oxy hòa tan trong nuôi tôm chủ yếu từ không khí, quạt nước/sục khí và quang hợp của thực vật trong ao Trong nước hàm lượng oxy hòa tan có thể mất

đi do quá trình hô hấp của thủy sinh vật hay quá trình oxy hóa vật chất hữu cơ trong nước và trong nền đáy ao Hàm lượng oxy hòa tan tối ưu cho tôm sú là 5 - 6 mg/L, lý tưởng cho tôm là lớn hơn 5 mg/L và không vượt quá 15 mg/L

(Whetstone et al., 2002) Một nghiên cứu về hàm lượng oxy hòa tan trong ao nuôi tôm sú thâm canh của Trương Quốc Phú và ctv (2006) trung bình dao động

từ 4,4 - 5,0 mg/L vào lúc sáng sớm và từ 8,5 - 9,6 mg/L vào lúc xế chiều, nhưng vào cuối vụ nuôi hàm lượng oxy hòa tan tương đối thấp hơn (2,19 mg/L) làm cho

tôm thường bị nổi đầu vào mỗi buổi sáng Một nghiên cứu của Rengpipat et al

(2000), ghi nhận dao động của oxy hòa tan trong bể nuôi tôm sú từ 5 - 7,5 mg/L

và không gây ảnh hưởng đến tôm trong thí nghiệm

c) Nhu cầu oxy hóa học (COD)

COD là lượng oxy cần thiết cho quá trình oxy hóa toàn bộ các chất hữu cơ

có trong nước thành CO2 và H2O bằng một chất oxy hóa mạnh COD thích hợp trong nuôi tôm là <20 mg/L (Võ Thị Tứ, 2006) Trong ao nuôi, chỉ số COD càng giảm càng tốt vì chứng tỏ nước ít ô nhiễm hữu cơ, không cần tiêu hao lượng oxy hòa tan trong nước để oxy hóa các chất bẩn Vì vậy, khi COD giảm thì lượng oxy hòa tan trong nước tăng làm tăng chất lượng nước nuôi Theo QCVN 08-2008 thì nước trong nuôi trồng thủy sản phải có hàm lượng COD nhỏ hơn 35 mg/L, trên

35 mg/L được coi là ô nhiễm và dưới 10 mg/L được coi là nghèo dinh dưỡng Kết

quả thí nghiệm của Briggs và Funge-Smith (1994) khi nuôi tôm ở mật độ 10 con/m2; 30 con/m2; 50 con/m2 thì hàm lượng COD lần lượt là 18,7 mg/L; 27,6 mg/L; 39 mg/L tương ứng; hàm lượng COD càng về cuối vụ càng tăng lên, do sự tích lũy vật chất hữu cơ

d) Tổng đạm amon (TAN)

Theo Boyd (1998) và Chanratchakool (2003) thì hàm lượng TAN thích hợp cho ao nuôi tôm là 0,2 - 2 mg/L và hàm lượng NH3 phải nhỏ hơn 0,1 mg/L Kết quả của Nguyễn Thanh Long và Võ Thành Toàn (2008) cho thấy hàm lượng TAN trong ao tôm sú thâm canh dao động từ 0,03 - 4,3 mg/L và có xu hướng tích

lũy cao vào cuối vụ, phù hợp với kết quả nghiên cứu của Trương Quốc Phú và ctv (2006) Theo Whetston et al (2002) TAN có khuynh hướng tăng dần vào cuối vụ

đặc biệt là các mô hình nuôi không hay ít thay nước Trong một nghiên cứu khác

của Dương Thị Hoàng Oanh et al., (2008), cho thấy tổng đạm amon (TAN) trong

ao nuôi tôm sú thâm canh dao động từ 0,4-2,1 mg/L Mức độ tích lũy đạm amon tăng theo thời gian nuôi (Avnimelech và Ritvo, 2003)

e) Nitrate (NO 3 - )

NO3- trong thủy vực là sản phẩm của quá trình nitrate hóa nhờ hoạt động

của một số vi khuẩn hóa tự dưỡng như Nitrobacter, Nitrospina hay

Nitrosococcus NO3- còn được cung cấp từ nước mưa khi có sấm chớp NO3- là một loại muối dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của thực vật và không gây độc cho tôm cá, nhưng nếu hàm lượng NO3- quá cao sẽ làm thực vật phù du phát triển quá mức gây nở hoa làm biến động một số yếu tố hóa học như pH, oxy hòa tan và CO2 gây bất lợi cho tôm Theo Boyd (1998) hàm lượng NO3- cho phép trong ao nuôi thủy sản là nhỏ 10 mg/L, tốt nhất là nhỏ hơn 2 mg/L Trong nghiên

cứu của Dương Thị Hoàng Oanh et al., (2008), hàm lượng NO3- trong ao nuôi tôm

sú thâm canh dao động từ 0,058 - 0,080 mg/L, là mức khá phù hợp với ao nuôi thâm canh

2.1.2 Hiện trạng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh trong nuôi tôm thâm canh

Trong điều kiện nuôi tôm thâm canh, môi trường ao nuôi thường rất phú dưỡng, hầu hết nitơ tích lũy (khoảng 70%) trong ao có nguồn gốc từ thức ăn thừa

và sản phẩm thải của tôm, cá (Boyd, 1985; Gross et al., 2000) Ngoài ra, sự tích

lũy chất hữu cơ trong các ao nuôi thâm canh cũng rất cao, chất hữu cơ có nguồn gốc chủ yếu từ phân tôm, cá, thức ăn thừa và xác của phiêu sinh vật Hệ thống nuôi năng suất càng cao thì lượng chất hữu cơ tích luỹ càng nhiều, do đó đòi hỏi phải quản lý chặt chẽ về nước và chất thải Trong ao nuôi thâm canh, ranh giới giữa lớp bùn đáy trên và lớp bùn đáy ao là nơi vi sinh vật hoạt động mạnh nhất

bởi chính nơi đây tập trung nhiều vật chất hữu cơ (Yusoff et al., 2003) Trong

điều kiện kỵ khí, hàm lượng nitrit, ammonia, phosphorus và H2S được phóng thích trở lại tầng nước từ lớp bùn đáy Ngoài ra, nền đáy là nơi cư trú phần lớn

các vi khuẩn nhất là vi khuẩn gây bệnh (Burford et al., 1998) Kết quả nghiên cứu của Sharmila et al (1996) cho thấy khi kết thúc vụ nuôi tôm thâm canh và bán

thâm canh thì mật độ vi khuẩn trung bình trong nước là 1,8 – 4,5 × 103 CFU /mL, nhưng trong lớp bùn đáy, mật độ này lên đến 1,85 × 105 – 6,18 ×106 CFU/g, đặc biệt một số mẫu bùn đáy có số lượng vi khuẩn Gram âm chiếm hơn 50% và phần

lớn là vi khuẩn gây bệnh Burford et al (1998) nghiên cứu vi khuẩn bùn đáy ao

nuôi và cũng thấy rằng mật độ vi khuẩn rất cao (15,5 × 109 CFU/g) và tập trung cao nhất ở giữa ao

2.1.2.1 Hiện trạng ô nhiễm môi trường trong ao nuôi tôm thâm canh

Theo Briggs và Funge-Smith (1994) sự tích lũy vật chất hữu cơ trong ao nuôi tôm được tính với tốc độ 185 - 199 tấn khô/ha/vụ, chiếm 31% N, 84% P, 63% hợp chất hữu cơ và 93% chất thải rắn Lượng nước thải ra định kỳ trong lúc nuôi và lúc thu hoạch thường chứa tới 45% N và 22 % vật chất hữu cơ Việc thâm canh hóa nghề nuôi tôm đã tạo ra nhiều vấn đề về môi trường như sự tự ô nhiễm, mất cân đối sinh thái vùng ven biển Nhiễm bệnh là nguyên nhân gây thiệt hại

nặng nề nhất cho nghề nuôi tôm (FAO, 2003) Đa số các báo cáo về bệnh nhiễm khuẩn trên tôm đều gây ra bởi các loài vi khuẩn cơ hội chứ không phải bởi các loài gây bệnh bắt buộc, với tần số nhiễm bệnh tỉ lệ thuận với mức độ nuôi thâm canh và điều kiện môi trường bất lợi Alderman (1998)

Trong quá trình nuôi thâm canh, tôm thường xuyên tiếp xúc với sự thay đổi đột ngột các yếu tố môi trường về hóa học, vật lý và sinh học Số lượng lớn các chất hữu cơ và vi khuẩn được đưa vào cùng với thức ăn và mật độ cao của tôm sẽ dẫn đến sự tích lũy chất hữu cơ và vi khuẩn trong hệ thống nuôi (Vadstein 1997) Theo các nguyên lý về sinh thái học, việc cung cấp chất hữu cơ thường xuyên có khuynh hướng làm mất cân bằng hệ vi sinh theo hướng tăng tỉ lệ vi khuẩn cơ hội (Andrews, 1986) Những nguyên nhân này là điều kiện bất lợi đối với tôm nuôi Vì vậy, quản lý hệ vi sinh là vấn đề rất quan trọng trong nuôi trồng

thủy sản nhất là trong các hệ thống nuôi thâm canh (Vadstein et al.,1993) Phương pháp phổ biến nhất để kiểm soát bệnh Vibrio là sử dụng kháng sinh hoặc

các chất diệt khuẩn Tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh đã dẫn đến sự gia tăng các dòng vi khuẩn kháng thuốc và nguy cơ tồn dư kháng sinh trong cơ thể tôm (Holmstrom, 2003)

2.1.2.2 Các bệnh thường xảy ra cho tôm khi ao nuôi thâm canh bị nhiễm bẩn

Theo kết quả của nhiều công trình nghiên cứu, một trong những nguyên nhân quyết định làm tôm tăng trưởng chậm, giảm sức đề kháng, dễ bị bệnh tấn công là do lớp bùn cặn bã hữu cơ tích tụ lâu ngày ở bề mặt đáy ao bắt nguồn từ thức ăn dư thừa, từ các chất mùn, vỏ tôm, các cặn bã hữu cơ có sẵn trong nguồn nước… Mặt khác do lạm dụng việc sử dụng các loại thuốc và hóa chất làm mất đi

sự cân bằng sinh thái Do đó vấn đề cấp thiết hiện nay là đảm bảo tốt chất lượng nước ao nuôi tôm sú Xu thế ngày nay là nuôi tôm sạch, không kháng sinh, thân thiện với môi trường và sức khỏe cộng đồng, bằng cách sử dụng các loại vi sinh vật hữu ích Quần thể vi sinh vật trong các thủy vực nuôi thủy sản nước mặn rất

đa dạng, khả năng duy trì sự cân bằng thích hợp của hệ vi sinh vật là chìa khóa

thành công trong việc quản lý môi trường nuôi thủy sản (Schulze et al., 2006)

Khi ao bị nhiễm bẩn một số loại vi khuẩn từ bên ngoài xâm nhập vào trong

vỏ tôm gây bệnh cho tôm Bệnh thường gặp nhất là bệnh hoại tử do vỏ tôm bị tổn thương vì nhiễm khuẩn hay mềm vỏ Nhiều loại vi khuẩn ăn mòn lớp ki-tin của

vỏ gây ra lở loét làm cho vỏ bị nhăn nheo Ngoài vi khuẩn thì một số sinh vật khác cũng có thể xâm nhập qua vỏ như nấm hay động vật nguyên sinh Nấm có thể xâm nhập mang và vỏ tạo nên những khối đen trên tôm Động vật nguyên sinh xâm nhập qua vỏ không nhiều mà chỉ gây tổn thất cho mang tạo ra những đốm đen nhỏ, thường gọi là bệnh đen mang Bệnh đen mang thường do nhiễm khuẩn

Vibrio, nhiễm nấm Fuarium, động vật nguyên sinh Đôi khi cũng do nhiễm hoá

chất như kim loại nặng, hàm lượng nitrate cao hay nước có tính axit (Võ Thị Tứ, 2006)

Nhóm vi khuẩn Vibrio là nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội, chúng tồn tại

trong môi trường nước nuôi như một thành phần của quần thể vi sinh vật tự nhiên trong ao nuôi Khi gặp điều kiện môi trường bất lợi chúng trở thành vi khuẩn có khả năng gây bệnh Khi bị nhiễm vi khuẩn này tôm thay đổi tập tính như bơi ven

bờ hay gần mặt nước, lờ đờ, bỏ ăn, đổi màu đỏ hoặc xanh Nếu môi trường tiếp tục xấu đi, hay số lượng vi khuẩn phát triển mạnh, tôm sẽ chết trong một thời gian ngắn hoặc bệnh sẽ chuyển thành nhiễm khuẩn mãn tính Để ngăn ngừa bệnh này

thì phải chú ý đến việc cải thiện môi trường ao nuôi Ngoài bệnh đen mang Vibrio

cũng gây ra một số bệnh khác như bệnh phân trắng, bệnh phát sáng Các bệnh này cũng làm cho tôm chết hàng loạt (Võ Thị Tứ, 2006)

2.1.2.3 Các chất độc sinh ra từ quá trình phân hủy chất thải trong ao nuôi thâm canh

Trong ao nuôi thâm canh thường từ tháng 3 trở đi hàm lượng dinh dưỡng tăng lên, hàm lượng oxy giảm thấp là cơ hội cho vi khuẩn gia tăng về mật độ để tham gia vào quá trình phân hủy yếm khí sinh ra nhiều khí độc ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng của tôm, đồng thời làm cho ao nuôi tự thoái hóa nội tại

và khi chất thải này thoát ra môi trường, nhất là vùng cửa sông gây ô nhiễm vùng này, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến cả vùng nuôi (Green và Boyd, 1995)

Theo Briggs và Funge-Smith (1994) lớp nước giữa bùn đáy và nước ao nuôi là chất lắng từ nhiều nguồn khác nhau có khả năng tiềm tàng gây độc cho các loài thủy sản Sự tương tác giữa đất bùn đáy ao và nước ao rất quan trọng ảnh hưởng đến tính chất sinh hóa học của Nitơ (Hargreaves, 1998) Theo nghiên cứu

về chất thải của ao nuôi tôm sú thâm canh ở Thái Lan cho thấy lượng bùn sau một

vụ nuôi ước lượng khoảng 90 m3/ha với độ ẩm là 73,8%, độ khô là 26,2%, mỗi ha thải ra khoảng 99 tấn bùn ướt và 26 tấn bùn khô Một ha nuôi tôm thâm canh ở Thái Lan phóng thích mỗi ngày khoảng 46 kg chất hữu cơ, hầu hết chúng tồn tại trong ao dạng chất bồi lắng ở đáy ao (Briggs và Funge-Smith, 1994) nhưng hàng ngày có khoảng 1,2 kg N/ha và 0,1 kg P/ha ao nuôi thải vào môi trường nước biển

(Midlen và Redding, 1998)

a) NH 3 và H 2 S

Đất ao và các chất lắng tụ sinh ra hai sản phẩm chính hòa tan trong nước

và có tính độc cao đối với nuôi tôm là NH3 và H2S Các loại khí độc này hiện diện trong ao dưới 2 dạng dạng khí có tính độc cao và dạng ion ít độc hơn Tỉ lệ giữa dạng khí và ion bị ảnh hưởng bởi pH, khi pH cao, NH3 dạng khí nhiều và ít H2S

dạng khí (Chanratchakool et al., 1996) Khi pH thấp H2S dạng khí nhiều và ít

NH3 dạng khí Dao động pH thích hợp cho ao nuôi tôm là 7,5 - 8,5, và ở mức pH này thì NH3 và H2S ở dạng độc là thấp nhất NH3 là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ sống, sinh trưởng đối với thủy sinh vật Độ độc của NH3 đối với một số loài giáp xác cũng đã được nghiên cứu, ở nồng độ 0,09 mg/L NH3 làm giảm sự sinh trưởng của tôm, ở nồng độ 0,45 mg/L làm giảm 50% sự sinh trưởng của các loài tôm he Ngoài ra, LC50-24 giờ và LC50 - 96 giờ của NH3 đối với hậu

ấu trùng tôm sú là 5,71 mg/L và 1,26 mg/L (Chin và Chen, 1987)

Khí H2S chỉ sinh ra từ các hợp chất hữu cơ lắng tụ, chủ yếu là do quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh hay quá trình phản sulfate hóa với

sự tham gia của vi khuẩn yếm khí Trường hợp thứ nhất thường gặp ở hầu hết các thủy vực, trường hợp thứ hai thường gặp ở thủy vực nước lợ, mặn nơi có nhiều ion SO42- trong nước (Chanratchakool et al., 1996) Nếu H2S hiện diện trong ao ở nồng độ cao có mùi trứng thối đặc trưng nhưng khi phát hiện được mùi trong nước thì có lẽ đã vượt trên mức gây độc cho tôm

H2S là một chất khí cực độc đối với thủy sinh vật, tác dụng độc của nó là liên kết với sắt trong thành phần của hemoglobine, không có sắt thì hemoglobine không có khả năng vận chuyển oxy cung cấp cho các tế bào, thủy sinh vật sẽ chết

vì thiếu oxy Độ độc của H2S đối với cá phụ thuộc vào nhiều yếu tố như pH, nhiệt

độ của nước Theo Bonn và Follis (1957) (trích dẫn bởi Boyd, 1990) thì ở nhiệt

độ 25 - 30 °C, pH nước bằng 6,8 thì nồng độ H2S gây chết 50% cá sau 3 giờ thí nghiệm (LC50-3 giờ) là 0,8 mg/L Còn pH bằng 7 thì LC50-3 giờ của khí H2S đối với cá Nheo bột Mỹ là 1 mg/L; 1,3 mg/L đối với cá tiền trưởng thành và 1,4 mg/L đối với cá trưởng thành Ở những nồng độ thấp hơn, khí H2S không gây độc hại

mà làm tiêu hao nhiều oxy của môi trường Vì thế, độc tính của nitrite được gọi là methemoglobinemia Máu chứa số lượng đáng kể methemoglobin có màu nâu, vì thế tên gọi hiện tượng ngộ độc nitrite là “bệnh máu nâu” Giáp xác chứa hemocyanin, một hợp chất chứa đồng thay vì sắt tìm thấy trong hemoglobin Phản ứng của nitrite với hemocyanin chưa được hiểu nhiều nhưng nitrite có thể độc đối với giáp xác (Boyd, 1998) Trong mùa nắng thì khí H2S thường được hình thành nhiều ở nền đáy thủy vực, hạn chế sự phát triển của nhiều loại động vật đáy nhưng sang mùa lạnh sự tích lũy khí H2S ở đáy ao nhiều bùn gây nên hiện tượng thiếu oxy

b) Nitrite (NO 2 - )

Trong các thủy vực NO2- được tạo thành từ quá trình oxy hóa ammonia và

ammonium nhờ hoạt động của nhóm vi khuẩn hóa tổng hợp Nitrosomonas Trong

điều kiện không có oxy, nhiều loài vi sinh vật có thể sử dụng nitrate hoặc một dạng oxy hóa khác của nitrogen như một chất nhận điện tử trong quá trình hô hấp

Quá trình này còn được gọi là quá trình phản nitrate hóa, các hợp chất trung gian trong quá trình chuyển hóa thường là những dạng độc nên không có lợi cho thủy sinh vật

Ở các thủy vực nước lợ có hàm lượng Ca2+ và Cl- có khuynh hướng làm giảm tính độc của NO2- (Crawford và Allen, 1977; Perron và Meade, 1977; Russo

et al., 1981) (trích dẫn bởi Boyd, 1990) Giá trị LC50-24 giờ và 96 giờ của NO2đối với tôm sú và hậu ấu trùng là 204 và 45 mg/L (Chen và Chin, 1988) Nồng độ

-an toàn của NO2- đối với hậu ấu trùng tôm sú là 4,5 mg/L Tuy nhiên, nồng độ

NH3 cao sẽ làm tăng tính độc của NO2- đối với tôm sú Theo Schwedler et al

(1985) những nhân tố sau đây có ảnh hưởng đến độ độc của NO2-: hàm lượng Cl-,

pH, kích cỡ, tình trạng dinh dưỡng, sự nhiễm bệnh, hàm lượng oxy hòa tan do

đó, không thể xác định được nồng độ gây chết, nồng độ an toàn của NO2- trong nuôi trồng thủy sản Trong một số thí nghiệm trong nước lợ (có chứa Cl-) hàm lượng NO2- nhỏ hơn 1,5 mg/L, nên độc tính của NO2- thấp và không ảnh hưởng đến tôm Trong nuôi tôm thâm canh mật độ nuôi ảnh hưởng đến sự khác biệt hàm lượng NO2-, mật độ nuôi càng cao thì lượng chất thải càng nhiều và hàm lượng

NO2- càng cao NO2- được sinh ra từ quá trình oxy hóa NH4+ dưới tác động của vi

khuẩn Nitrosomonas, NO2- chỉ tăng lên khi có NH4+ và vi khuẩn nitrite hóa phát triển trong ao

2.1.3 Xử lý ô nhiễm môi trường bằng phương pháp sinh học

2.1.3.1 Sử dụng vi sinh vật hữu ích (probiotic)

Sử dụng probiotic là công nghệ thân thiện với môi trường và đang có xu hướng được ứng dụng rộng rãi trên thế giới và ở Việt Nam Thuật ngữ

“probiotics” được đề xuất năm 1965 để mô tả những chất sinh ra từ vi sinh vật có tác dụng tăng trưởng vi sinh vật hoặc các vi sinh vật khác Các khái niệm về

“probiotic” được hiểu khác nhau theo lịch sử phát triển Parker (1974) và Fuller (1989) định nghĩa “probiotic” là các sinh vật hay chế phẩm giúp cân bằng quần thể vi sinh vật trong ruột Havenaar và Huis in Veld (1992) định nghĩa

“probiotic” là nhóm một hay nhiều vi sinh vật nuôi, sống khi ăn vào cơ thể của động vật hay người sẽ có tác dụng tốt qua việc cải thiện quần thể sinh vật tiêu hoá trong ruột Tannock (1997) định nghĩa “probiotic” là tế bào các vi sinh vật sống được cho vào cơ thể qua đường thức ăn nhằm cải thiện sức khoẻ sinh vật Các tế bào vi sinh vật đưa vào cơ thể qua đường tiêu hoá và được giữ sống nhằm cải thiện sức khoẻ sinh vật nuôi (Gatesoupe 1999) Gần đây, định nghĩa này được mở rộng hơn: “probiotic” là hỗn hợp bổ sung có bản chất vi sinh vật sống có tác động

có lợi đối với vật chủ nhờ sự cải thiện hệ vi sinh liên kết với vật chủ hoặc sống tự

do trong môi trường, nhờ cải thiện việc sử dụng thức ăn hoặc tăng cường giá trị dinh dưỡng của thức ăn, nhờ vào sự gia tăng khả năng đề kháng của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc nhờ vào sự cải thiện chất lượng của môi trường sống

(Verschuere et al., 2000)

2.1.3.2 Các ứng dụng của vi sinh vật hữu ích trong nuôi tôm

Có nhiều nghiên cứu ứng dụng trong các trại tôm giống nhưng ít có những nghiên cứu sâu về vấn đề này Maeda và Liao (1992) đã công bố, khi sử dụng chủng vi khuẩn phân lập từ đất PM-4 đã ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của ấu

trùng P monodon, do chúng đóng vai trò như nguồn thức ăn Chủng vi khuẩn này cũng có tác dụng hạn chế được ảnh hưởng do vi khuẩn gây bệnh V Anguillarum

gây ra Một thí nghiệm khác của Maeda (1994), khi tác giả bổ sung tảo khuê và luân trùng vào bể thì tỉ lệ sống của ấu trùng đạt 57% sau 13 ngày ương, trong khi tất cả ấu trùng đều chết sau 5 ngày ở nghiệm thức đối chứng Maeda và Liao (1994) đã báo cáo một kết quả tương tự, nhưng chủng vi khuẩn được sử dụng là chủng NS-110

Rengpipat và Rukpratanporn (1998) kết luận rằng, chủng Bacillus S11 là

vi khuẩn hữu ích có thể giàu hoá Artemia trước khi cho ấu trùng tôm sú ăn Kết

quả cho thấy ấu trùng tôm phát triển nhanh hơn và ít bệnh hơn so với bể không có

vi khuẩn Bacillus S11 Sau 100 ngày bổ sung Bacillus S11, ấu trùng tôm sú được gây cảm nhiễm với V harveyi D331 bằng cách ngâm tôm vào bể Sau 10 ngày tất