Nghiên cứu: Chuyển hoá nh3 trong bể ươm tôm giống thành no3- nhờ nitrosomonas và nitrobacter cố định trên giá thể bc nhằm nâng cao năng suất thu hoạch

Con tôm ôm cây lúa” hiện là mô hình nông nghiệp sinh thái được đánh giá cao về hiệu quả kinh tế lẫn tác đ ộng tích cực lên môi trường, khi luân canh giữa vụ tôm và vụ lúa thì các chất dinh dưỡng trong vụ tôm sẽ được lúa hấ p thụ và do đó giảm bớt nhiều chi phí hoá chấ t bón phân. Ngoài ra, nuôi tôm thịt trong đi ều kiện quảng canh như vậy sẽ hạn chế dịch bệnh, đảm bảo tôm phát triển bình thường và tận dụng tốt ngu ồn nước đang bị xâm mặn như hiện nay. Bên cạnh mô hình nông nghiệp sinh thái nuôi trồng quảng canh, thì mô hình nuôi tôm công nghiệp với mật độ cao ở nước ta vẫn là nguồn cung cấp chính cho xu ất khẩu. Thái Lan là nư ớc có lượng tôm xuất khẩu lớn nhất thế giới, sản lượng lên đến 250.000 tấn/năm, theo sau đó là các nước trong khu vực Đông Nam Á với hệ thống nuôi tôm công nghiệp quy mô lớn, dẫn đến 80% lượng tôm trên thế giới đư ợc sản xuất từ khu vực này. Để đáp ứng nhu cầu về con giống, các trang trại nhân giống tôm đã áp dụng hình thức nuôi với mật độ rất dày đặc cả tôm giống lẫn lượng thức ăn, vì nuôi trong những bể cô lập (trung bình thể tích 4 m 3 ) nên thức ăn thừa tồn đ ọng trong bể là rất lớn, khi đó lượng thức ăn này bị phân hu ỷ ra các hợp chất thứ cấp và cuối cùng về ammonia do các nhóm vi khuẩn amon hoá thực hiện, chính lượng ammonia này sẽ gây ảnh hưởng xấu đến chất lư ợng tôm giống về sau [13]. Để tôm phát tri ển tốt, cần kiểm soát lượng ammonia (NH3) phải nhỏ hơn 0,1 ppm (1,33-1,53 mg/L ở pH 8,0 và nhiệt độ 28-30 0 C), nếu lượng ammonia tăng cao sẽ làm tôm bắt mồi kém, sinh trưởng chậm và dễ nhiễm bệnh. Thông thường người ta sẽ thường xuyên luân chuyển đến 40% lượng nước trong bể để giảm nồng độ các chất thải độc hại, việc làm này đã gây tình trạng phú dưỡng cho các ngu ồn nước lân cận, dẫn đ ến tăng nguy cơ xuất hiện tảo đ ộc và vi sinh vật gây bệnh. Do vậy, việc quản lý ngu ồn nước trong các trang trại nuôi tôm (tôm giống và tôm thương phẩm) là một yêu cầu tiên quyết trong việc nâng cao sản lượng và hạn chế thiệt hại đ ến môi trường xung quanh [10, 13]. Hiện có nhiều giải pháp kĩ thuật để kiểm soát nồng độ ammonia (TAN – total ammonia nitrogen) trong nước, phương pháp phổ biến là cho nước nuôi tôm chạy qua một lớp vật liệu đệm, vi khuẩn nitrate hoá sẽ được giữ trên lớp vật liệu đệm này sẽ tiến hành oxy hoá ammonia trong nư ớc thải, có thể tiến hành sục khí để tăng hi ệu quả, các nghiên cứu liên quan

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về Nitrosomonas sp 3

2.1.1 Phân lập, duy trì và nuôi cấy 3

2.1.2 Đặc điểm về giống 4

2.1.3 Nitrosomonas europaea 7

2.1.4 Nitrosomonas eutropha 8

2.1.5 Nitrosomonas marina 9

2.1.6 Nitrosomonas mobilis 10

2.2 Giới thiệu về Nitrobacter sp 11

2.2.1 Nitrobacter winogradsky 11

2.2.2 Nitrobacter alkalicus 12

2.2.3 Nitrobacter hamburgensis 14

2.2.4 Nitrobacter vulgaris 15

2.3 Quá trình nitrate hoá 15

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nitrate hoá 25

2.3.3 Khả năng bám dính 27

2.4 Thu sinh khối Nitrosomonas europaea theo mẻ (batch) và liên tục 28

2.4.1 Bố trí thí nghiệm 29

2.4.2 Kết quả thí nghiệm 30

2.5 Giới thiệu về Acetobacter xylinum và màng bacterial cellulose 34

2.5.1 Sơ lược vi khuẩn Acetobacter xylinum 35

2.5.2 Các đặc điểm cấu trúc của BC 36

2.5.3 Vai trò của bacterial cellulose đối với Acetobacter xylinum 37

2.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo BC 38

2.5.5 Các ứng dụng của bacterial cellulose 39

2.6 Nghiên cứu về hệ vi khuẩn nitrate hoá và ứng dụng 40

CHƯƠNG 3 NGHIÊN CỨU TÌNH HUỐNG 43

3.1 Qui trình thực hiện 43

3.2 Tạo chất mang BC 43

3.3 Lên men thu sinh khối hệ vi khuẩn nitrate hoá 46

3.4 Phương pháp xác định ammonia, nitrite và nitrate 47

3.4.1 Xác định hàm lượng ammonia NH3 theo TCVN 2662-78 và 4563-88 48

3.4.2 Xác định hàm lượng nitrite NO2 theo TCVN 2658-78 và 4561-88 50

3.4.3 Xác định hàm lượng nitrite NO3 theo TCVN 4562-88 52

3.5 Kết quả bước đầu 53

3.5.1 Cố định vi khuẩn lên BC 53

3.5.2 Thử nghiệm chế phẩm 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

ứng bởi Soriano và Walker (1968), Watson (1971) và Krinmel và Harms (1982) đối với vi khuẩn phân lập

từ đất, môi trường 4 đề xuất bởi Watson (1965) đối với vi khuẩn phân lập từ biển và môi trường 5 đề xuất bởi Koops và cộng sự (1976) đối với vi khuẩn phân lập từ nước lợ Tất cả các môi trường đều cần 5 g/l CaCO3 hoặc 4 g/l HEPES như chất đệm pH [7] 4 Bảng 2 Các đặc điểm phân loại giống vi khuẩn nitrite hoá [7] 5 Bảng 3 Năng lượng thu được từ quá trình oxi hoá các hợp chất vô cơ so với từ glucose (-686 kcal/mol) [11] 16

Hình 1 Hình thái tế bào Nitrosomonas dưới kính hiển vi quang học [7] 5

Hình 2 Hình thái tế bào Nitrosomonas dưới kính hiển vi điện tử cho thấy có sự khác nhau về hình dạng và kích thước tế bào giữa các loài trong cùng giống Nitrosomonas IM là màng bao tế bào chất (intracytoplasmic membrane), C là carboxysome [7] 5

Hình 3 Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosospira [7] 6

Hình 4 Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosovibrio [7] 6

Hình 5 Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosolobus [7] 7

Hình 6 Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosococcus [7] 7

Hình 7 Quan sát tế bào Nitrosomonas europaea dưới kính hiển vi quang học Bar = 5 μm [4] 8

Hình 8 Quan sát tế bào Nitrosomonas europaea dưới kính hiển vi điện tử Bar = 1 μm [4] 8

Hình 9 Quan sát tế bào Nitrosomonas eutropha dưới kính hiển vi điện tử Bar = 1 μm [4] 9

Hình 10 Quan sát tế bào Nitrosomonas marina dưới kính hiển vi điện tử quét Bar = 1 μm [4] 9

Hình 11 Quan sát tế bào Nitrosomonas marina dưới kính hiển vi điện tử Bar = 1 μm [4] 10

Hình 12 Cấu trúc tế bào Nitrosomonas mobilis dưới kính hiển vi điện tử quét Bar = 1μm [4] 10

Hình 13 Cấu trúc tế bào Nitrosomonas mobilis dưới kính hiển vi điện tử Bar = 1 μm [4] 11

Hình 14 Vi khuẩn Nitrobacter winogradsky được nhuộm Gram âm, có dạng quen ngắn Bar = 1 μm [4] 12

Hình 15 Khuẩn lạc Nitrobacter alkalicus sau 2 tháng nuôi cấy ở pH 10 Bar = 0,1 cm [15] 12

Hình 16 Tiên mao (F) ở Nitrobacter alkalicus dưới kính hiển vi Bar = 1 μm [15] 13

Hình 17 Cấu trúc tế bào Nitrobacter alkalicus dưới kính hiển vi điện tử Lớp vỏ bao bên ngoài (S) được cấu tạo gồm nhiều tiểu đơn vị protein ghép với nhau Bar = 1 μm [15] 13

Hình 18 Cấu trúc lớp vỏ bên ngoài tế bào vi khuẩn Nitrobacter alkalicus Bar = 0,5 μm [15] 13

Hình 19 Các bào quan ở Nitrobacter alkalicus (M) màng intracytoplasmic, (P) polyphosphate và (H) hạt polyhydroxybutyrate Bar = 1 μm [15] 14

Hình 20 Vi khuẩn Nitrobacter hamburgensis được nhuộm Gram âm, có dạng quả lê Bar = 250nm [4] 14 Hình 21 Cấu trúc tế bào Nitrobacter vulgaris gồm lớp màng introcytoplasmic và carboxysome Bar = 250 nm [4] 15

Hình 22 Hướng di chuyển electron dựa trên thế khử của các chất trong tế bào Những chất khử luôn là chất cho điện tử, và các chất oxi hoá luôn là chất nhận điện tử [11] 17

Hình 23 Hai giai đoạn của quá trình nitrate hoá 18

Hình 24 Cấu trúc carboxysome và các enzyme cấu tạo lớp vỏ [18] 20

Hình 25 Con đường vận chuyển điện tử ở Nitrosomonas [2-3, 8-9, 11] 23

Hình 26 Con đường vận chuyển điện tử ở Nitrobacter [3, 8-9, 11, 16] 24

Hình 27 Sự tạo thành nitrite trong quá trình sinh trưởng của N europaea trên môi trường được cấy 4% dịch giống và hàm lượng ammonia ban đầu là 7,8 mM [12] 28

Hình 28 Thiết bị fermenter dùng nuôi cấy theo mẻ và liên tục để xác định các yếu tố sinh trưởng tối ưu cho Nitrosomonas [14] 30

Hình 29 Tác động của sắt đến sự phát triển của Nitrosomonas trong nuôi cấy theo mẻ (A): đường cong sinh trưởng ở mẫu đối chứng, không có sắt (B): đường cong sinh trưởng ở mẫu thí nghiệm có hàm lượng sắt là 0,5ppm [14] 32

Hình 30 Sự sinh trưởng của Nitrosomonas trong chế độ nuôi cấy liên tục Đường cong phía trên là mật

thước mẫu 300-500µm C và D: kích thước mẫu 500-710µm [10] 41

Hình 35 Chế phẩm sau khi cố định, kích thước 300-1500µm Thời gian cố định lần lượt là A: 6h, B: 12h, C: 24h và D: 72h [10] 42

Hình 36 Thiết bị cố định dạng khuấy đảo, dung tích 50L Sau 4 ngày cố định, khả năng nitrate hoá của chế phẩm đạt cao nhất [10] 42

Hình 37 Đồ thị thể hiện hoạt lực nitrate hoá của chế phẩm theo thời gian Tiến hành thí nghiệm lặp lại 3 lần [10] 42

Hình 38 Quan sát tế bào Acetobacter xylinum dưới kính hiển vi để kiểm tra các đặc điểm vi thể 44

Hình 39 Khuẩn lạc Acetobacter xylinum 44

Hình 40 Sau khi đảm bảo chắc chắn giống đang có là Acetobacter xylium thì từ ống giống gốc (A) ta cấy chuyền qua ống thạch nghiêng (B), nếu thao tác không đúng sẽ dẫn đến tạp nhiễm (C) 45

Hình 41 Cùng với việc cấy chuyền, ta sẽ tiến hành nhân giống cấp 1 trong ống nghiệm (1+2) lớp màng BC tạo ra sau 5 ngày nhân giống, (3) các tế bào kết thành dải màu nâu nhạt 45

Hình 42 Tiến hành nhân giống cáp 2, sau khi cấy giống vào erlen chứa môi trường ở bình (A), để yên erlen ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 5 ngày sẽ thấy xuất hiện lớp màng mỏng phía trên (B), nếu để đến 1 tuần thì lớp màng sẽ càng dày (C) 45

Hình 43 Tiến hành lên men thu BC bằng cách cấy vào khay nhựa chứa môi trường lên men (A), sau 7 ngày ta sẽ thu được sản phẩm (B) 46

Hình 44 Trong quá trình lên men, nếu nguyên liệu nước dừa già đã bị nhiễm bào tử nấm mốc thì khả năng mốc mọc lên khi lên men là rất cao Ngoài ra, nguyên nhân tạp nhiễm còn do rửa dụng cụ không sạch và khay bị hở nắp nên bào tử nấm lọt vào 46

Hình 45 (A) Dịch giống Nitrobacter sp., (B) Dịch giống Nitrosomonas sp 47

Hình 46 Hình thái tế bào Nitrobacter (bên trái) và Nitrosomonas (bên phải) dưới kính hiển vi 47

Hình 47 Đường chuẩn NH3 49

Hình 48 Đường chuẩn NO2- 51

Hình 49 Đường chuẩn NO3- 53

Hình 50 BC sau khi xử lý và hấp tiệt trùng, ở pH trung tính được sử dụng làm chất mang 54

Hình 51 Chế phẩm BC thu được sau 24, 48, 72 giờ cố định 54

Hình 52 Chế phẩm BC ở các chế độ bẫy-hấp phụ khác nhau được đem thử nghiệm trên nước biển 54

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Trước tình hình biến đổi khí hậu diễn ra ngày một gay gắt như hiện nay, việc hướng đến những quy trình chăn nuôi, trồng trọt theo hướng sinh thái, thân thiện với môi trường là một đòi hỏi nóng bỏng của xã hội, đặc biệt là ở Việt Nam, khi mà nông nghiệp vừa là truyền thống lâu đời vừa là đòn bẩy kinh tế đưa cả nước thoát nghèo và thoát khủng hoảng như lịch

sử đã minh chứng Thời điểm tháng 4/2010, các tỉnh khu vực ven biển và đồng bằng sông Cửu Long đang gánh chịu sự hạn hán, nhiễm mặn nghiêm trọng gây nguy hại đến an ninh lương thực của cả nước và trên thế giới Bài toán cho một nền nông nghiệp bền vững hiện đang đặt ra cho các nhà khoa học, nhà quản lý ở Việt Nam phải giải quyết nhanh, mạnh và kịp thời, nếu không những hệ luỵ tiếp theo từ sự suy giảm nông nghiệp sẽ rất khó lường

“Con tôm ôm cây lúa” hiện là mô hình nông nghiệp sinh thái được đánh giá cao về hiệu quả kinh tế lẫn tác động tích cực lên môi trường, khi luân canh giữa vụ tôm và vụ lúa thì các chất dinh dưỡng trong vụ tôm sẽ được lúa hấp thụ và do đó giảm bớt nhiều chi phí hoá chất bón phân Ngoài ra, nuôi tôm thịt trong điều kiện quảng canh như vậy sẽ hạn chế dịch bệnh, đảm bảo tôm phát triển bình thường và tận dụng tốt nguồn nước đang bị xâm mặn như hiện nay

Bên cạnh mô hình nông nghiệp sinh thái nuôi trồng quảng canh, thì mô hình nuôi tôm công nghiệp với mật độ cao ở nước ta vẫn là nguồn cung cấp chính cho xuất khẩu Thái Lan

là nước có lượng tôm xuất khẩu lớn nhất thế giới, sản lượng lên đến 250.000 tấn/năm, theo sau đó là các nước trong khu vực Đông Nam Á với hệ thống nuôi tôm công nghiệp quy mô lớn, dẫn đến 80% lượng tôm trên thế giới được sản xuất từ khu vực này Để đáp ứng nhu cầu

về con giống, các trang trại nhân giống tôm đã áp dụng hình thức nuôi với mật độ rất dày đặc

cả tôm giống lẫn lượng thức ăn, vì nuôi trong những bể cô lập (trung bình thể tích 4 m3) nên thức ăn thừa tồn đọng trong bể là rất lớn, khi đó lượng thức ăn này bị phân huỷ ra các hợp chất thứ cấp và cuối cùng về ammonia do các nhóm vi khuẩn amon hoá thực hiện, chính lượng ammonia này sẽ gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng tôm giống về sau [13]

Để tôm phát triển tốt, cần kiểm soát lượng ammonia (NH3) phải nhỏ hơn 0,1 ppm (1,33-1,53 mg/L ở pH 8,0 và nhiệt độ 28-300C), nếu lượng ammonia tăng cao sẽ làm tôm bắt mồi kém, sinh trưởng chậm và dễ nhiễm bệnh Thông thường người ta sẽ thường xuyên luân chuyển đến 40% lượng nước trong bể để giảm nồng độ các chất thải độc hại, việc làm này đã gây tình trạng phú dưỡng cho các nguồn nước lân cận, dẫn đến tăng nguy cơ xuất hiện tảo độc

và vi sinh vật gây bệnh Do vậy, việc quản lý nguồn nước trong các trang trại nuôi tôm (tôm giống và tôm thương phẩm) là một yêu cầu tiên quyết trong việc nâng cao sản lượng và hạn chế thiệt hại đến môi trường xung quanh [10, 13]

Hiện có nhiều giải pháp kĩ thuật để kiểm soát nồng độ ammonia (TAN – total ammonia nitrogen) trong nước, phương pháp phổ biến là cho nước nuôi tôm chạy qua một lớp vật liệu đệm, vi khuẩn nitrate hoá sẽ được giữ trên lớp vật liệu đệm này sẽ tiến hành oxy hoá ammonia trong nước thải, có thể tiến hành sục khí để tăng hiệu quả, các nghiên cứu liên quan

đã được áp dụng như phương pháp dòng chảy chìm (submerged flow biofilter) (Abeysinghe et

al 1996), nitrate hoá hiệu suất cao qua lớp đệm (high-rate linear-path trickling nitrification filter) (Twarowska et al 1997) [17], bench-scale fluidized bed bioreactor (Ng et al 1996), hệ thống xử lý liên tục với vật liệu đệm là gel alginate cố định vi khuẩn nitrate hoá (Kim et al 2000)… các nghiêu cứu này đã tiến hành ở qui mô pilot và đạt được những thành công nhất định Cụ thể, hệ thống xử lý nước thải dùng phương pháp này đã làm giảm đến 25% lượng ammonia theo nghiên cứu tiến hành bởi Chin và Ong (1997) ở trang trại nuôi tôm thương phẩm Tuy vậy, nhược điểm lớn của các phương pháp trên chính là chi phí đầu tư ban đầu lớn, tốn kém trong quá trình bảo trì-vận hành, hơn nữa, công nghệ sử dụng khá phức tạp nên khó ứng dụng đối với những hộ nuôi tôm có quy vừa và nhỏ vốn là thành phần chủ lực trong sản xuất tôm giống ở những nước Đông Nam Á

1 Phương pháp dòng chảy qua lớp đệm

Giải pháp sử dụng trực tiếp chế phẩm vi sinh để xử lý ammonia hiện đang được ứng dụng nhằm khắc phục nhược điểm của phương pháp vật liệu đệm 2 hệ vi khuẩn được sử dụng

trong chế phẩm vi sinh thuộc nhóm hoá tự dưỡng, Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp., đây là

những chủng có tốc độ sinh trưởng chậm, thường có sẵn trong nước nuôi tôm nhưng vì việc thay nước thường xuyên đã làm rửa trôi hệ vi khuẩn có lợi này, kết quả là hoạt lực nitrate hoá

tự nhiên trong bể nuôi tôm bị giảm đáng kể Các chế phẩm thương mại thì hiện trên thị trường rất nhiều nhưng hiệu quả thật sự thì vẫn chưa rõ ràng bởi các nhà sản xuất thường nói quá hiệu quả của chế phẩm Các nguyên nhân dẫn đến sự kém hiệu quả khi sử dụng chế phẩm vi sinh tự do này (dạng lỏng, dạng bột) là chúng có khả năng thích nghi kém với môi trường nước nuôi tôm từng địa phương, khu vực, sự cạnh tranh cơ chất với chủng vi sinh vật nội tại trong bể nuôi tôm Trở ngại lớn nhất là việc duy trì mật độ tế bào vi khuẩn nitrate hoá phải ở mức cao thì mới có khả năng phân giải ammonia một cách rõ ràng, điều này rất khó đảm bảo khi vi khuẩn nitrate hoá cũng bị rửa trôi trong quá trình thay nước

Chính vì thế, mục tiêu nghiên cứu của tôi là kết hợp giữa 2 phương pháp trên lại với nhau, làm thế nào tạo ra một chế phẩm có khả năng nitrate hoá vừa rẻ tiền, thích hợp cho các

hộ nuôi trồng vừa và nhỏ, tiết kiệm chi phí đầu tư, bảo dưỡng trang thiết bị, vừa có hoạt lực nitrate hoá cao, hệ vi sinh vật ít bị rửa trôi và giảm tỉ lệ thay nước thường xuyên Chất mang

BC (bacterial cellulose) có thể là một giải pháp trọn vẹn cho các tiêu chí trên

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về Nitrosomonas sp

Winogradsky là người đặt nền tảng nghiên cứu về các loại vi khuẩn oxi hoá ammonia (vi khuẩn nitrite hoá) vào năm 1892 Tuy vậy, việc phân lập và nghiên cứu sâu hơn về các loại vi khuẩn này đã không được tiếp nối nên trong một thời gian dài, người ta chỉ biết đến

chủng Nitrosomonas europaea Bắt đầu từ năm 1960, Watson và cộng sự đã mở ra một kỉ

nguyên mới trong việc phân lập và nuôi cấy loại vi khuẩn này, họ đã phát hiện và đặt tên cho hơn 16 chủng vi khuẩn oxi hoá ammonia khác Từ đó đến nay, kiến thức về loại vi khuẩn này liên tục được cập nhập, người ta đã dùng kỹ thuật PCR để xác định đoạn gen amoA (mã hoá cho trung tâm hoạt động của enzyme chìa khoá trong quá trình nitrite hoá là ammonia monooxygenase-AOB) và phương pháp phát hiện trực tiếp vi khuẩn này bằng kỹ thuật FISH (fluorescence in situ hybridization) Với các thành tựu này, việc kiểm soát các loại vi khuẩn oxi hoá ammonia trong thực tế trở nên dễ dàng hơn rất nhiều

2.1.1 Phân lập, duy trì và nuôi cấy

Để phân lập một loại vi khuẩn nào đó, ta nắm vững nguyên tắc “cơ chất nào thì sẽ có

vi sinh vật loại đó phân huỷ”, vì vậy cần lấy mẫu ở những nơi mà vi khuẩn nitrite hoá tập trung cao Tiếp theo, sử dụng phương pháp MPN ứng với một loạt các loại môi trường nuôi cấy khác nhau nhằm phản ánh tác động của yếu tố môi trường lên quá trình nghiên cứu Chẳng hạn, trong quá trình tăng sinh khối từ môi trường acid, pH thấp và thêm vào urea như nguồn cơ chất sinh năng lượng duy nhất, người ta có thể phân lập được những chủng trội của

vi khuẩn nitrite hoá, có thể thích nghi trong điều kiện khắt nghiệt Về tổng quát, hai yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất là ammonia (NH3) và nồng độ muối, tiếp đến là nhiệt độ và pH môi trường

Sau khi có được công thức môi trường thích hợp nhất cho vi khuẩn nitrite hoá phát triển, ta sẽ dùng một trong hai cách sau để phân lập vi khuẩn nitrite hoá là: phương pháp MPN (số lượng tế bào chắc chắn có thể) dựa trên phân phối Poisson khi phân tích một loạt mẫu pha loãng theo nhiều tỉ lệ khác nhau vào các ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho vi khuẩn nitrite hoá phát triển; phương pháp trãi đĩa petri từ mẫu ban đầu Cần lưu ý là vi khuẩn nitrite hoá phát triển cực kì chậm, nên đối với phương pháp MPN thì có thể xác định mẫu có chứa tế bào vi khuẩn sau 2-3 tuần nuôi cấy (dựa trên sự thay đổi màu sắc cho chất chỉ thị pH gây ra), phương pháp trãi đĩa thì cần chờ đến 6-8 tuần mới thu được khuẩn lạc

Các môi trường chuẩn để nhân giống được liệt kê bên dưới, đối với môi trường giữ giống, thì CaCO3 (5 g/l) hoặc N-2-hydroxyethyl-piperarine-N’-2’ethanesulfonic acid (HEPES, 4,77 g/l) được dùng như một chất đệm pH Khi nuôi cấy, thì pH luôn được chỉnh bằng NaHCO3 10% Giá trị pH tối ưu phụ thuộc vào nồng độ các muối ammonium thêm vào

10 mM muối ammonium thêm vào ở pH 8.0 được xem là tạo điều kiện rất tốt cho quá trình phát triển của vi khuẩn Nếu nuôi cấy ở thể tích lớn thì cần phải khuấy hoặc sục oxy vào Nhiệt độ 300 là thích hợp với quá trình phát triển của vi khuẩn Thời gian cấy chuyền trong

khoảng 3-4 tháng, có thể trữ vi khuẩn nitrite hoá ở dạng dịch lỏng chứ không nhất thiết ở dạng thạch nghiêng Việc lưu trữ bằng phương pháp lạnh sâu về cơ bản tỏ ra không thành công

Bảng 1 Các môi trường khác nhau dùng nuôi cấy vi khuẩn nitrite hoá Môi trường 1, 2 và 3

đề xuất tương ứng bởi Soriano và Walker (1968), Watson (1971) và Krinmel và Harms (1982) đối với vi khuẩn phân lập từ đất, môi trường 4 đề xuất bởi Watson (1965) đối với vi khuẩn phân lập từ biển và môi trường 5 đề xuất bởi Koops và cộng sự (1976) đối với vi khuẩn phân lập từ nước lợ Tất cả các môi trường đều cần 5 g/l CaCO3 hoặc 4 g/l HEPES như chất đệm

Bảng 2 Các đặc điểm phân loại giống vi khuẩn nitrite hoá [7]

Đặc điểm Nitrosococcus Nitrosolobus Nitrosomonas Nitrosospira Nitrosovibrio

Hình dạng Dạng tròn đến

ellipse

Dạng thuỳ đa hình

Dạng que

Dạng que mảnh, hơi cong

Kích thước

(μm) 1,5-1,8x1,7-2,5

2,5

1,0-1,5x1,0-2,4

Có lỗ xuất hiện rải rác

Gấp cuộn vào bên trong

Gấp cuộn vào bên trong

Giống Nitrosomonas (Winogradsky, 1982): tế bào về cơ bản là hình que, màng bao tế

bào chất có các lỗ nằm rải rác, đôi khi lớp màng này gấp cuộn vào bên trong tế bào chất

Hình 3 Hình thái tế bào Nitrosomonas dưới kính hiển vi quang học [7]

Hình 4 Hình thái tế bào Nitrosomonas dưới kính hiển vi điện tử cho thấy có sự khác nhau về hình dạng và kích thước tế bào giữa các loài trong cùng giống Nitrosomonas IM là màng bao

tế bào chất (intracytoplasmic membrane), C là carboxysome [7]

Giống Nitrosospira (Winogradsky, 1933): tế bào là dạng que xoắn, đôi khi có dạng

dấu phẩy Không quan sát thấy màng bao tế bào chất

Hình 5 Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosospira [7]

Giống Nitrosovibrio (Harms và cộng sự, 1976): tế bào dạng dấu phẩy Không quan sát

thấy màng bao tế bào chất Màng trong tế bào gấp cuộn vào bên trong tế bào chất đã được ghi nhận

Hình 6 Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosovibrio [7]

Giống Nitrosolobus (Watson và cộng sự, 1971): tế bào có dạng thuỳ đa hình, chia

thành ngăn bởi màng tế bào chất

Hình 7 Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosolobus [7]

Giống Nitrosococcus (Winogradsky, 1892): đại diện cho phân lớp proteobacterial của vi khuẩn nitrite hoá Có hai loài tiêu biểu là N oceani và N halophilus với dạng cầu cho đến ellipse, được ghi nhận có màng bao tế bào chất với

gamma-các lỗ tập trung thành từng cụm

Hình 8 Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosococcus [7]

2.1.3 Nitrosomonas europaea

Vi khuẩn này được đặt tên là europaea vì được phân lập lần đầu tiên ở châu Âu

(1892), có dạng hình que, hai cực tế bào có dạng hình tròn, kích thước từ 0,8-1,1 x 1,0-1,7

μm, về cơ bản thì tồn tại từng tế bào riêng lẽ, Gram âm Khả năng di động thì chưa được ghi nhận Carboxysome cũng không có trong tế bào chất Không có hoạt tính urease Ở pH khoảng 7,8 thì tế bào chịu được nồng độ muối ammonium lên đến 400 mM Hằng số Ks oxi hoá NH3 nằm trong khoảng 30-56 μM Tuy không đòi hỏi phải có muối trong môi trường,

nhưng tế bào có thể chịu được nồng độ muối NaCl lên đến 500 mM Vi khuẩn phân bố ở các

hệ thống xử lý rác, nguồn nước bị phú dưỡng hoá và thỉnh thoảng tồn tại trong đất [4]

Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 50,6-51,4 Dòng điển hình: ATCC 25978 GenBank accesion number (16S rRNA): M96399

Hình 9 Quan sát tế bào Nitrosomonas europaea dưới kính hiển vi quang học Bar = 5 μm [4]

Hình 10 Quan sát tế bào Nitrosomonas europaea dưới kính hiển vi điện tử Bar = 1 μm [4]

2.1.4 Nitrosomonas eutropha

Vi khuẩn này có tên eutropha có nghĩa là sống ở nơi có hàm lượng dinh dưỡng cao, có

nhiều hình dạng từ hình que đến hình trái lê, kích thước 1,0-1,3 x 1,6-2,3 μm, thỉnh thoảng kết thành chuỗi ngắn Cấu trúc thành tế bào Gram âm Hầu hết các dòng đều có thể di động được Carboxysome nằm trong tế bào chất Tế bào không có hoạt tính urease Ở pH 7,8 thì khả năng chịu nồng độ muối ammonium lên đến 600 mM và hằng số Ks oxi hoá NH3 là 35-36 μM Không đòi hỏi phải có muối trong môi trường, nhưng tế bào vẫn sống được khi nồng độ NaCl lên đến 500 mM Rất thường thấy ở số lượng nhiều trong các cống rãnh, nguồn nước phú dưỡng và thỉnh thoảng ở trong đất [4]

Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 47,9-48,5 Dòng điển hình: C-91, Nm 57 GenBank accesion number (16S rRNA): AJ298739, AY 23795, M96402

Hình 11 Quan sát tế bào Nitrosomonas eutropha dưới kính hiển vi điện tử Bar = 1 μm [4]

2.1.5 Nitrosomonas marina

Vi khuẩn này có tên marina vì thường gặp ở biển Tế bào dạng que dài, ở 2 đầu có

dạng hình tròn, kích thước 0,7-0,9 x 1,4-2,3 μm Cấu tạo thành tế bào Gram âm, có thêm một lớp bổ sung bên ngoài được cấu tạo bởi một dãy các đại phân tử Khả năng di động chưa được ghi nhân Không có carboxysome Cần phải có muối trong môi trường nuôi cấy, nồng độ NaCl tối ưu cho vi khuẩn nằm trong khoảng 400 mM, tế bào có thể chịu đến nồng độ 800

mM Ngoài ra, tế bào có thể chịu được nồng độ muối ammonium đến 200 mM ở pH 7,8 Hoạt tính urease dương tính Phân bố phổ biến ở biển và các khu vực ven biển [4]

Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 47,4-48 Dòng điển hình: Nm 22 GenBank accesion number (16S rRNA): Z46990

Hình 12 Quan sát tế bào Nitrosomonas marina dưới kính hiển vi điện tử quét Bar = 1 μm [4]

Hình 13 Quan sát tế bào Nitrosomonas marina dưới kính hiển vi điện tử Bar = 1 μm [4]

2.1.6 Nitrosomonas mobilis

Vi khuẩn có tên mobilis nghĩa là di động được Về cơ bản, tế bào có dạng hình cầu,

đường kính từ 1,5 đến 1,7 μm Tuy nhiên, một số dòng có dạng hình que, kích thước 1,5-1,7 x 1,7-2,5 μm Tế bào thường ở dạng đơn hoặc cặp đôi, thỉnh thoảng kết thành chuỗi ngắn Cấu trúc thành tế bào Gram âm Tế bào di động nhờ một bó sợi gồm từ 1 đến 22 tiên mao, có chiều ngang khoảng 12 nm và chiều dài 3-5 μm Không có carboxysome trong tế bào chất Tế bào sống ở nơi có độ mặn vừa, với nồng độ NaCl tối ưu khoảng 100 mM, tuy nhiên khi tăng nồng độ lên đến 600 mM thì tế bào vẫn sống được Ở pH 7,8 thì tế bào chịu được nồng độ các hợp chất ammonium đến 300 mM Hoạt tính urease âm tính Dòng vi khuẩn này được phân lập ở khu vực nước lợ và các hệ thống xử lý nước thải [4]

Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 49,3 Dòng điển hình: Nc 2 GenBank accesion number (16S rRNA): AF287287, AJ298728, M96403

Hình 14 Cấu trúc tế bào Nitrosomonas mobilis dưới kính hiển vi điện tử quét Bar = 1μm [4]

Hình 15 Cấu trúc tế bào Nitrosomonas mobilis dưới kính hiển vi điện tử Bar = 1 μm [4]

2.2 Giới thiệu về Nitrobacter sp

2.2.1 Nitrobacter winogradsky

Tên dòng vi khuẩn này được đặt theo tên nhà sinh vật học Winogradsky là người đầu tiên phân lập được nó Vi khuẩn có dạng que ngắn, hình quả lê, thỉnh thoảng có dạng cầu, kích thước 0,6-0,8 x 1,0-2,0 μm Carboxysome thường xuất hiện ở dạng thể vùi trong nguyên sinh chất Tế bào có thể di động nhờ tiên mao ở gần cực và bên hông Nhiều dòng vi khuẩn nitrite hoá này là loại hoá tự dưỡng không bắt buộc Khi nuôi trên môi trường có nhiều loại dinh dưỡng, vi khuẩn nitrite hoá sẽ ưu tiên dùng nitrite trước, sau đó mới oxi hoá các hợp chất hữu cơ còn lại Vi khuẩn cũng có thể sử dụng pyruvate, acetate và glycerol như nguồn sinh năng lượng, cùng với dịch chiết nấm men, casamino acid, peptone, NH3 và nitrate như nguồn cung cấp nitơ Dưới điều kiện môi trường gồm các chất khoáng vô cơ hay môi trường hỗn hợp nhiều loại dinh dưỡng, thời gian thế hệ dao động từ 8 đến 14 giờ Trong khi ở môi trường giàu chất hữu cơ thì vi khuẩn phát triển chậm nên thời gian thế hệ từ 70 đến 100 giờ Vi khuẩn có khả năng sống trong điều kiện kị khí với nitrate là chất nhận điện tử và tạo ra các dạng nitrite, nitric oxide (NO), nitrous oxide (N2O) Tế bào ít nhạy cảm với oxy khi được chuyển từ điều kiện kị khí sang điều kiện hiếu khí NO có thể là nguồn cơ chất thay thế nitrite cho vi khuẩn oxi hoá trong điều kiện hiếu khí thành nitrate Những dòng vi khuẩn điển hình chủ yếu được phân lập từ đất Ngoài ra, vi khuẩn này còn phân bố ở nước ngọt, biển, cống rãnh, hệ thống xử lý nước thải và phân bón [4]

Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 61,7 Dòng điển hình: ATCC 25391

Hình 16 Vi khuẩn Nitrobacter winogradsky được nhuộm Gram âm, có dạng quen ngắn Bar =

1 μm [4]

2.2.2 Nitrobacter alkalicus

Vi khuẩn này có tên alkalicus nghĩa là alkaline, độ kiềm vì khả năng sống trong pH kiềm khá cao từ 6,5 đến 10,2 và pH tối thích là 9,5 Vi khuẩn có dạng quả lê, kích thước từ 0,6-0,8 x 1,2-1,8 μm Vách tế bào có thêm một lớp bọc bên ngoài được cấu trúc bởi các tiểu đơn vị protein theo một trật tự nhất định Nitrite là nguồn sinh năng lượng cho vi khuẩn ở điều kiện môi trường khoáng vô cơ, trong khi môi trường hữu cơ thì người ta không ghi nhận được

sự phát triển của vi khuẩn Đối lập với các loại vi khuẩn nitrite hoá khác, người ta không phát hiện thấy carboxysome trong vi khuẩn này, do đó để sinh trưởng thì vi khuẩn bắt buộc phải dùng nguồn carbon ở dạng ion carbonate Vi khuẩn này được phân lập ở lớp bùn trong các hồ nước khoáng có hàm lượng Na2CO3 cao (soda lake) hoặc từ đá vôi, đá khoáng (soda soil) ở Siberia và Kenya [4]

Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 62 GenBank accesion number (16S rRNA): AF

069956

Hình 17 Khuẩn lạc Nitrobacter alkalicus sau 2 tháng nuôi cấy ở pH 10 Bar = 0,1 cm [15]

Hình 18 Tiên mao (F) ở Nitrobacter alkalicus dưới kính hiển vi Bar = 1 μm [15]

Hình 19 Cấu trúc tế bào Nitrobacter alkalicus dưới kính hiển vi điện tử Lớp vỏ bao bên

ngoài (S) được cấu tạo gồm nhiều tiểu đơn vị protein ghép với nhau Bar = 1 μm [15]

Hình 20 Cấu trúc lớp vỏ bên ngoài tế bào vi khuẩn Nitrobacter alkalicus Bar = 0,5 μm [15]

Hình 21 Các bào quan ở Nitrobacter alkalicus (M) màng intracytoplasmic, (P) polyphosphate

và (H) hạt polyhydroxybutyrate Bar = 1 μm [15]

2.2.3 Nitrobacter hamburgensis

Vi khuẩn được phân lập đầu tiên ở thành phố Hamburg, Đức, và để tưởng nhớ sự kiện

đó người ta đã đặt tên thành phố cho dòng vi khuẩn này Hình thái và cấu trúc tế bào tương tự như các dòng vi khuẩn nitrite hoá khác Carboxysome hiện diện ở tế bào chất Khả năng di động nhờ tiên mao ở đuôi và bên hông Phát triển kém trên môi trường khoáng vô cơ nhưng lại có khả năng phát triển tốt ở môi trường hỗn hợp Khi môi trường có nitrite, pyruvate, dịch chiết nấm men và peptone thì tốc độ sinh trưởng đạt cao nhất Đây là dòng duy nhất có thể phát triển tốt trong môi trường có chất hữu cơ Cả nirtite và chất hữu cơ đều được sử dụng trong quá trình biến dưỡng của tế bào Tế bào còn có thể khử nitrate để phục vụ quá trình sinh trưởng Vi khuẩn khá nhạy cảm với oxy khi chuyển từ điều kiện kị khí sang hiếu khí Dòng vi khuẩn này được phân lập từ đất ở Hamburg (Đức), Yucatan (Mexico) và Corse (Pháp) [4]

Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 61,6 Dòng điển hình là X 14 GenBank accesion number (16S rRNA): L11663

Hình 22 Vi khuẩn Nitrobacter hamburgensis được nhuộm Gram âm, có dạng quả lê Bar =

250nm [4]

2.2.4 Nitrobacter vulgaris

Vulgaris trong tiếng La tinh nghĩa là phổ biến Đặc điểm hình thái và cấu trúc tương tự như các dòng nitrite hoá khác Carboxysome hiện diện trong tế bào chất Phần lớn tế bào trong dòng này có 2 pha sinh trưởng, pha đầu tiên sẽ oxi hoá nitrite thường, pha thứ hai oxi hoá các hợp chất hữu cơ khác Mức độ sinh trưởng trong pha đầu tiên (hoá tự dưỡng) thường chậm hơn pha thứ hai (hoá dị dưỡng) Tế bào ở dòng Z có thời gian nhân đôi là 140 giờ ở pha đầu tiên và 25 giờ ở pha thứ hai Cả nitrate và oxy đều là chất nhận điện tử và acetate hoặc pyruvate là chất cho điện tử khi tế bào sử dụng hợp chất hữu cơ Tế bào sản sinh ra những polymer ngoại bào giúp liên kết những tế bào xung quanh lại tạo thành cụm, màng (biofilm)

Điểm khác biệt với các dòng nitrite hoá khác là vi khuẩn Nitrobacter vulgaris không nhạy

cảm với oxy chuyển từ môi trường kị khí sang môi trường hiếu khí Trên màng nguyên sinh

chất ở Nitrobacter vulgaris thì chỉ có duy nhất một loại cytochrome c 32 kDa trong khi ở N winogradsky và N hamburgensis thì có cả loại cytochrome 30 kDa Dòng vi khuẩn này được phân lập từ đất, nước ngầm, nước ngọt hoặc nước lợ, cống rãnh và cả trong tổ mối N

vulgaris là loài phổ biến nhất trong loài Nitrobacter, thậm chí nó có xuất hiện trong bê tông

và những toà nhà xây dựng từ đá, gạch [4]

Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 59,4 Dòng điển hình là Z

Hình 23 Cấu trúc tế bào Nitrobacter vulgaris gồm lớp màng introcytoplasmic và

carboxysome Bar = 250 nm [4]

2.3 Quá trình nitrate hoá

Các loại vi khuẩn hoá năng vô cơ (chemolithotrophic) thường là loại tự dưỡng, đều sử dụng chu trình Calvin để cố định CO2 như nguồn carbon duy nhất Ở vi khuẩn nitrate hoá, được xếp vào loại hoá tự dưỡng (chemoautotrophic) sẽ sử dụng năng lượng thu được từ quá trình oxi hoá ammonia hay nitrite để phục vụ cho việc khử CO2 thành carbohydrate Khi một phân tử CO2 đi vào chu trình Calvin, nó cần đến 3 phân tử ATP và 2 phân tử NADPH Điều khó khăn là năng lượng thu từ quá trình oxi hoá các phân tử vô cơ (nói chung) của vi khuẩn nitrate hoá lại nhỏ hơn rất nhiều so với việc oxi hoá hoàn toàn glucose ở loại vi khuẩn thông

thường Tỉ lệ P/O trong quá trình oxi hoá phosphoryl hoá ở vi khuẩn nitrate hoá thường bằng

1, chính vì tỉ lệ quá thấp như vậy, nên vi khuẩn nitrate hoá nói riêng và các loại vi khuẩn hoá năng vô cơ khác nói chung, cần oxi hoá một lượng lớn các hợp chất vô cơ để sinh trưởng và sinh sản, điều này nói lên tác động của hệ vi khuẩn này đối với môi trường rất sâu sắc

Bảng 3 Năng lượng thu được từ quá trình oxi hoá các hợp chất vô cơ so với từ glucose (-686

Ở vi khuẩn nitrate hoá, năng lượng giải phóng từ quá trình oxi hoá ammonia lẫn nitrite được sử dụng để tổng hợp nên ATP (hoạt hoá các enzyme, cơ chất, là hợp chất dự trữ năng lượng) và NAD(P)H (nguồn cung cấp electron trong chuỗi vạn chuyển điện tử, cung cấp H+ dùng để khử các hợp chất khác, là hợp chất chứa năng lượng khử) Chính 2 hợp chất quan trọng này, mà vi khuẩn nitrate hoá sử dụng để khử CO2 và các hợp chất khác phục vụ cho quá trình biến dưỡng của tế bào

Quá trình tổng hợp ATP ở vi khuẩn nitrate hoá về nguyên tắc rất giống với hoạt động tổng hợp ATP của ti thể ở các vi sinh vật có nhân thật Con đường chính để tạo ATP là thông qua các hoạt động oxi hoá ammonia và phân ly nước (ở vi khuẩn nitrite hoá) và oxi hoá nitrite (ở vi khuẩn nitrate hoá), H+ được tạo ra và đẩy vào periplasm (là khoảng không gian giữa màng trong và màng ngoài của tế bào vi khuẩn), từ đó tạo nên gradient H+ làm cho H+ chạy qua phức ATPase vào trong cytoplasm (nguyên sinh chất) giúp tái tạo ADP thành ATP Con

đường phụ (diễn ra ở Nitrobacter sp., trong khi ở Nitrosomonas sp thì không hiện diện) để

tạo ATP là thông qua hoạt động của chất khử NADH và hoạt động của phức vận chuyển điện

tử trên màng, giúp tổng hợp ATP

Quá trình tổng hợp NADH thì khó khăn hơn nhiều và hiện chưa được lý giải rõ hoàn toàn, vì nó liên quan đến quá trình vận chuyển electron theo chiều ngược lại (reverse electron transport – RET) Lý do chính vì những phân tử như ammonia, nitrite thì có thế khử cao (E’0

NO3-/NO2- = 0,421 V) hơn so với NAD+ (E’0 NAD+/NADH = -0,32) nên VI KHUẨN nitrate hoá không thể cung cấp electron trực tiếp từ quá trình oxi hoá ammonia và nitrite để tổng hợp nên NAD(P)H qua hệ enzyme NADH-oxidoreductase Bởi vì electron chỉ có thể di chuyển từ chất cho (donor) có thế khử thấp hơn đến chất nhận (acceptor) có thế khử cao hơn Để giải quyết khó khăn này, vi khuẩn nitrate hoá đã sử dụng lực đẩy proton (proton motive force – PMF) để đảo lại chiều di chuyển electron, qua các chất vận chuyển điện tử, nhằm khử NAD+

về NADH Ngoài ra PMF còn dùng cho sự chuyển động của tiên mao, các hoạt động trao đổi chất trong tế bào

Có thể thấy nếu so sánh với quá trình tạo nên NADH và ATP qua con đường đường phân hay chu trình Krebs ở các vi sinh vật khác, thì quá trình tạo NADH và ATP ở vi khuẩn nitrate hoá tiêu tốn nhiều năng lượng hơn và lượng sản phẩm tạo ra ít hơn Nhưng vì nguồn cơ chất ammonia, nitrite mà vi khuẩn nitrate hoá sử dụng lại không bị cạnh tranh như các nguồn

cơ chất khác (glucose, lipid, protein), nên vi khuẩn nitrate hoá vẫn thích nghi được với con đường biến dưỡng bằng các hợp chất này

Hình 24 Hướng di chuyển electron dựa trên thế khử của các chất trong tế bào Những chất khử luôn là chất cho điện tử, và các chất oxi hoá luôn là chất nhận điện tử [11]

Quá trình nitrate hoá là quá trình chuyển hoá ammonium (NH4+) thành nitrate (NO3-) bởi tác động của vi sinh vật trong điều kiện hiếu khí Quá trình này được thực hiện bởi hai nhóm vi khuẩn tuần tự nối tiếp nhau, gồm 2 bước: giai đoạn nitrite hoá (nitrition) chuyển

NH4+ thành nitrite (NO2-) và giai đoạn nitrate hoá (nitration) từ nitrite thành nitrate (NO3-) Chuyển NH4+ thành NO2-

Nhóm vi khuẩn chuyển ammonium thành nitrite là Nitrosomonas (N europaea, N aligocarbogenes) oxi NH4+ thành NO2- qua sản phẩm trung gian là hydroxylamine (NH2OH)

2NH4+ + O2  2NH2OH + 2H+

NH2OH + O2  NO2- + 2H+ + H2O + 275 kJ

ammonia-nitrogen

-3:

Gram (-)

o Carboxysome: là những vi bào (microcompartment) có chứa enzyme liên quan đến quá trình cố định carbon Cấu tạo của carboxysome do polyhedral protein bao bọc bên ngoài, có đường kính từ 80 đến 140 nm Chức năng của carboxysome được nhìn nhận

là nơi tập trung hàm lượng CO2 cao nhằm tăng cường hiệu quả hoạt động và tỉ lệ enzyme RuBisCo trong chu trình Calvin, giúp khởi đầu chu trình Calvin được thuận lợi Những bào quan này được tìm thấy ở các loại vi khuẩn sử dụng CO2 như nguồn carbonhydrate như vi khuẩn lam (cyanobacteria) và rất nhiều loài vi khuẩn hoá dưỡng khác Carboxysome là một ví dụ cho rất nhiều nhóm protein tuy có cấu tạo giống nhau nhưng thực hiện chức năng không tương đồng, nguyên nhân do khác nhau dựa trên cấu tạo hình thái của lớp vỏ được hình thành bởi protein đó

Hình 28 Cấu trúc carboxysome và các enzyme cấu tạo lớp vỏ [18]

2.3.1.3 Quá trình nitrite hoá ở Nitrosomonas sp

Hai enzyme chìa khoá ở đây là ammonia monooxygenase - AMO (oxi hoá NH3 thành

NH2OH và H2O) và hydroxylamine oxidoreductase (oxi hoá NH2OH thành NO2-) Trong tế bào vi khuẩn nitrite hoá, cơ chế chung như sau: đầu tiên, enzyme ammonia monooxygenase xúc tác chuyển NH3 ngoài môi trường thành NH2OH theo phản ứng:

NH3 + O2 + 2e- + 2H+  NH2OH + H2O + 0,7 kcal/mol (1)

(1)

Hydroxylamine (NH2

Điều cần lưu ý là trong quá trình nitrite hoá, cơ chất của ammonia monooxygenase là

NH3 chứ không phải NH4+, vì vậy quá trình nitrite hoá diễn ra mạnh nhất ở pH trung tính hoặc

kiềm (pH 7,5-8,5) Vi khuẩn nitrite hoá thuộc loại hiếu khí tuỳ tiện, trong điều kiện thiếu oxy chúng sẽ oxi hoá tiếp ra N2O và NO [6]

VI KHUẨN không có hệ vận chuyển điện tử như vậy, nên

NADH2 được tổng hợp ra sẽ

ammonia (AMO-catalyzed), ½ còn lại sẽ dùng cho chu trình Calvin

ủ(vì quá trình phân ly nước diễn ra ở enzyme này, cung cấp cho tế bào H+

và e2

-2)

Hình 29 Con đường vận chuyển điện tử ở Nitrosomonas [2-3, 8-9, 11]

Hình 30 Con đường vận chuyển điện tử ở Nitrobacter [3, 8-9, 11, 16]

2.3.1.4 Quá trình nitrate hoá ở Nitrobacter sp

Enzyme chìa khoá ở đây là nitritoxydase (nitrite oxydase, nitrite oxidoreductase, NO2OR), là một enzyme có chứa nhân Fe-S và trung tâm hoạt động chứa Mo Trong tế bào vi khuẩn nitrate hoá, cơ chế chung như sau:

-NO2- + H2O  NO3- + 2[H+ + e-] + 17,8 kcal/mol

Khác với quá trình nitrite hoá, nguyên tử oxy dùng để oxi hoá NO2- được lấy từ H2O thay vì phân tử O2 Hai electron sinh ra từ quá trình oxi hoá NO3- được chuyển đến cytochrome c rồi đến cytochrome aa3 và kết hợp với oxy từ phân tử O2 để tạo thành nước trong nguyên sinh chất Điều cần lưu ý là cytochrome aa3 còn hoạt động như một bơm proton, khi nó thực hiện khử O2 về nước thì cũng bơm H+ ra periplasm

Ngoài ra, từ enzyme NO2- OR, 2 electron còn được chuyển qua cytochrome c550 và đến phức cytochrome bc1 Electron sau khi qua phức này sẽ kết hợp với ubiquinone để tạo thành ubiquinol, và đến lượt mình ubiquinol sẽ nhả điện tử và proton cho NAD+

để chuyển NAD+ thành NADH Con đường này là ngược so với chiều vận chuyển điện tử thông thường của cytochrome bc1, để electron di chuyển được thì cần phải có tỉ lệ cyt c550 (dạng khử)/cyt

c550 (dạng oxi hoá) và ubiquinol/ubiquinone đủ cao để đẩy H+ chuyển từ periplasm và cytoplasm thông qua phức cytochrome bc1, nhờ đó sẽ hút electron chuyển từ cytochrome c550

về phía ubiquinone Tương tự như vậy, để electron chuyển từ ubiquinol đến enzyme NADH oxidoreductase (NADH dehydrogenase) thì cần có tỉ lệ ubiquinol/ubiquinone và NAD+/NADH đủ cao để dẫn H+

từ periplasm và tạo nên dòng điện tử từ ubiquinol chuyển qua enzyme NADH dehydrogenase, kết quả là sản sinh ra NADH Tế bào sẽ sử dụng NADH sinh

ra cho các hoạt động oxi hoá phosphoryl hoá ở chuỗi vận chuyển điện tử từ FMN đến cytochrome o560 đển tái tạo ATP, và dùng NADH cho chu trình Calvin nhằm cố định CO2

Mặt khác, nếu so sánh với chiều di chuyển thông thường điện tử ở các vi khuẩn hoá năng vô cơ khác, thì sự chênh lệch mức điện thế giữa NADH/NAD+

Ngoài ra, thế điện hoá H+ ở hai bên màng không phải lúc nào cũng ổn định vì H+ ở periplasm vẫn bị thấm vào bên trong qua các lỗ nhỏ ở trên màng, điều này làm giảm gradient nồng độ H+ và tăng mật độ H+ bên trong tế bào chất, vi khuẩn nitrate hoá giải quyết khó khăn này bằng cách đảo lại chiều tổng hợp ATP từ bên trong ra bên ngoài nhằm phục hồi lại gradient H+ ở periplasm luôn cao hơn cytoplasm [9]

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nitrate hoá

Các vi khuẩn hoá năng vô cơ nói chung sở hữu những cơ chế hoá sinh đặc biệt giúp chúng tồn tại và phân bố trong một khoảng không gian rất rộng ở mặt đất và dưới nước

Người ta cũng phân lập được chúng trong cát và nước mưa Do là vi sinh vật tự dưỡng, nên chúng có khả năng tự tổng hợp sinh khối nhờ có cơ chế sinh hoá chứa đủ hệ enzyme phân giải các chất vô cơ, ví dụ như một số loài có thể đồng thời oxi hoá urea và methane cùng lúc với dị hoá rất nhiều loại hydrocarbon khác nhau Hơn nữa, các tế bào này có khả năng duy trì sự sống trong điều kiện thiếu nguồn cơ chất bằng nhờ giảm hoạt động hô hấp nội bào và đồng hoá xuống mức thấp nhất Đối với, vi khuẩn nitrate hoá thì chúng bị ức chế bởi ánh sáng và đặc biệt nhạy cảm với sự xáo động khỏi pH kiềm tối ưu và nhiệt độ ấm (~25-300

C) Ta sẽ xem xét các yếu tố ảnh hưởng cụ thể như sau:

Nồng độ ammonia

Theo nghiên cứu của Anthonisen và cộng sự (1976) thì khi hàm lượng ammonia vượt quá từ 10 đến 150 mg/l thì sẽ ức chế quá trình nitrite hoá Quá trình nitrate hoá nhạy cảm hơn, nếu ammonia vượt hơn mức 0,1 đến 1 mg/l thì vi khuẩn nitrate hoá đã bị ức chế Đối với nồng độ ion NO2- thì từ 0,22 đến 2,8 mg/l sẽ ức chế quá trình nitrate hoá Hiện chưa có nghiên cứu nào ghi nhận nồng độ NO3- ở mức nào sẽ ức chế quá trình nitrate hoá

Nồng độ oxy hoà tan (DO)

Tuy vi khuẩn nitrate hoá là loài hiếu khí bắt buộc nhưng chúng có thể sống trong thời gian dài ở điều kiện thiếu oxy dưới các tầng nước phía đáy hồ, trong các bể xử lý nước thải và bùn hoạt tính Người ta đã ghi nhận được mật độ 102 tế bào/ml vi khuẩn nitrite hoá trong một bể xử lý kị khí có nồng độ TAN 52 mg/l Ở các bể xử lý nước thải liên tục thì nồng độ vi khuẩn nitrite hoá đạt tối ưu ở nồng độ oxi hoà tan khoảng 0,2 mg/l Quá trình nitrite hoá vẫn xảy ra ở mức độ oxi hoà tan thấp 0,05 mg/l mà vẫn phân giải được một lượng đáng kể ammonia Đối với vi khuẩn nitrate hoá thì có sức sống tương

tự như vậy, trong một số trường hợp mật độ tế bào còn nhiều hơn vi khuẩn nitrite hoá vài lần Việc phát triển các bể xử lý hiếu khí kín có một vài khu vực kị khí cục bộ đã cho phép tiến hành đồng thời quá trình nitrate hoá và phản nitrate hoá, chuyển từ ammonia ra đến N2 (Davidson và cộng sự, 1986) Nồng độ oxi hoà tan tối ưu cho hệ vi khuẩn nitrate hoá phát triển tốt là 3-4 mg/l O2 (Prosser, 1989)

Nhiệt độ

Vi khuẩn nitrate hoá là loại vi khuẩn ưa ấm, nhiệt độ tối thích cho chúng phát triển trong khoảng 25-300C Đối với quá trình nitrite hoá vẫn diễn ra ở nhiệt độ từ 7-350

C trong khi quá trình nitrate hoá thì nhiệt độ diễn ra rộng hơn từ 5-420C