Ngoài thực vật, nấm và tảo có cellulose là thành phần cấu trúc cơ bản hình thành nên vách tế bào, cellulose còn được tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn, được gọi là cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC). Con đường tổng hợp và cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở các loài giống nhau, nhưng cấu trúc BC ở mỗi loài thì khác nhau. Có các điểm khác biệt đáng kể về thuộc tính vật lý của các sản phẩm cellulose, chủ yếu là chiều dài của chuỗi glucan (được đặc trưng bởi mức độ polymer hóa), tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó. Tùy thuộc vào mỗi loại mà trạng thái kết tinh của cellulose khác nhau. Từ đó tính chất vật lý của sản phẩm như độ bền, độ hòa tan trong các dung môi, tính chịu ảnh hưởng của các tác nhân biến tính cũng khác nhau.
35
Acetobacter xylinum (A.aceti ssp. xylinum, A. xylinus), là vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu nhất. Gần đây, nó được xếp vào giống mới Gluconacetobacter, bao gồm các loài là G. xylinus, G. hansenii, G. europaeus, G. oboediens và G. intermedius. Những nghiên cứu về cellulose vi khuẩn tập trung vào đối tượng A. xylinum cả về nghiên cứu cơ bản và các ứng dụng rộng rãi.
2.5.1 Sơ lƣợc vi khuẩn Acetobacter xylinum
Phân loại
Theo Bergey, A. xylinum thuộc hệ thống phân loại sau: Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadieae
Họ: Pseudomonadaceae
Loài: Acetobacter xylinum
Đặc điểm hình thái
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc không di động và không sinh bào tử. Tế bào A. xylinum đứng riêng lẽ hoặc kết thành chuỗi dài, có khả năng tạo váng dày trên môi trường nuôi cấy.
Đặc điểm sinh lý và sinh hóa
A. xylinum là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm Gram của chúng có thể bị biến đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. A. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nên chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí. Chúng không sử dụng muối NH4+ làm nguồn N duy nhất, đồng thời trên bề mặt môi trường dịch thể tạo thành màng dày nhầy, có chứa cellulose. Ngoài ra, A. xylinum tạo: (1) phản ứng catalase dương tính, (2) oxy hóa ethanol thành CO2 và H2O, (3) không tăng trưởng trên môi trường Hoyer, (4) không tạo sắc tố nâu, (5) tổng hợp cellulose.
A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chúng có thể chuyển glucose thành acid gluconic, điều này làm cho pH môi trường giảm từ 1 đến 2 đơn vị. Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là từ 25 đến 300C và pH từ 5,4 đến 6,3. Theo Hestrin (1947), pH tối ưu của A. xylinum là 5,5 và chúng không phát triển ở nhiệt độ 370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Khi nuôi trên môi trường đặc, lúc tế bào còn non, khuẩn lạc mọc riêng rẽ, nhầy và trong suốt,
36
xuất hiện sau 3 đến 5 ngày. Khi già, tế bào mọc dính nhau thành từng cụm và khuẩn lạc mọc theo đường nuôi cấy.
2.5.2 Các đặc điểm cấu trúc của BC
Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi nối β-1,4. Các nghiên cứu cơ bản cho thấy BC có cấu trúc hóa học giống với PC (plant cellulose – cellulose thực vật). Tuy nhiên, cấu trúc đa phân và thuộc tính của BC khác với PC. Các sợi mới sinh ra của BC kết lại với nhau để hình thành nên các sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng khoảng 1,5 nm, là những sợi mảnh nhất có nguồn gốc tự nhiên. Các sợi cơ bản kết lại thành các vi sợi (microfibril). Các vi sợi nằm trong các bó (bundle), và cuối cùng hình thành các dải (ribbon). Trong khi chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30.000-75.000 nm hay gỗ bulô (Betula) là 14.000- 40.000 nm. Những dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài thay đổi từ 1-9 μm làm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các nối hydrogen. BC khác PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa. BC có mức độ polymer hóa từ 2.000-6.000; một vài trường hợp đạt tới 16.000-20.000, trong khi mức polymer hóa ở thực vật là 13.000-14.000. So với PC, BC có độ kết tinh cao hơn, thấm nước tốt hơn, sức bền cơ học ở trạng thái ẩm cao hơn và dễ uốn nắn hơn. BC được hình thành qua một quá trình phức tạp gồm nhiều giai đoạn, cho sản phẩm có kích thước khác nhau theo sơ đồ sau:
Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Ở điều kiện nuôi cấy tĩnh. Vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề mặt của dịch nuôi cấy, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy. Các miếng BC này được gọi là BC trên môi trường tĩnh (S-BC: Static BC). Các sợi cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ những lỗ được xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi, và đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng. Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song nhưng không tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào A. xylinum. Các sợi BC kế nhau được tạo ra từ môi trường tĩnh nối với nhau và bẻ nhánh ít hơn các sợi BC được tạo từ môi trường lắc (A-BC: Agitated-BC). A-BC được tạo ra dưới dạng các hạt nhỏ, các hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường. Các sợi đan lưới với nhau trong môi trường lắc giống như mô hình kẻ ô, có cả hai hướng song song và vuông góc. Sự khác nhau về cấu trúc không gian ba chiều của hai dạng S-BC và A-BC được quan sát rõ ràng hơn bằng kính hiển vi điện tử. Những sợi S-BC kéo dài và chồng trên các sợi khác theo chiều đan chéo nhau. Những sợi A-BC thì rối rắm và cong. Ngoài ra, bề mặt cắt ngang của sợi A-BC (0,1- 0,2μm) lớn hơn sợi S-BC (0.05 – 0.10μm). Sự khác nhau về hình thái giữa hai loại BC này làm mức độ kết tinh, kích cỡ kết tinh của chúng khác nhau [1].
37
Hình 36. BC được tạo từ môi trường tĩnh (a) và môi trường lắc (b)
Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là I và II, được phân biệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ, và tia hồng ngoại. Cellulose I có thể được chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II thì không thể chuyển thành cellulose I.
Cellulose I được tổng hợp bởi đa số thực vật và A. xylinum ở môi trường tĩnh. Các chuỗi β-1,4-glucan ở cellulose I được sắp xếp song song với nhau theo một trục. Trong khi đó, các chuỗi β-1,4-glucan ở cellulose II thì xếp một cách ngẫu nhiên, hầu như không song song và nối với nhau bởi một số lượng lớn nối hydrogen, làm cho cellulose II có độ bền về nhiệt. Rất ít tế bào Eukaryote tổng hợp cellulose II trong khi A. xylinum thì tổng hợp được cả 2 loại cellulose I và II. Trong phân tử cellulose I có sự hiện diện của Iα và Iβ, do được cấu tạo bởi glucose dạng α hay dạng β. Dạng Iβ bền về nhiệt động học hơn. Glucose dạng α và glucose dạng β là hai dạng đồng phân không gian của nhau. Hai dạng đồng phân này chỉ khác nhau ở sự định hướng của nhóm hydroxyl. Hai dạng này có ở các cellulose có nguồn gốc từ tảo, vi khuẩn , thực vật. BC có dạng Iα nhiều hơn PC. S-BC có nhiều dạng Iα hơn A-BC. Sự khác nhau về tỉ lệ Iα giữa hai loại S-BC và A-BC làm phóng đại các chỉ số kết tinh, chỉ số Iα tỉ lệ thuận với kích cỡ kết tinh. A-BC có chỉ số kết tinh thấp hơn và kích cỡ kết tinh nhỏ hơn S- BC. Một phần đáng kể cellulose II có ở A-BC. Trong tự nhiên, cellulose II chỉ được tổng hợp ở một vài vi sinh vật (một số tảo, mốc, và vi khuẩn như Sarcina ventriculi, A. xylinum). Hiện nay, sản phẩm công nghiệp của cellulose II chủ yếu có được là dựa trên sự biến đổi hóa học cellulose thực vật.
2.5.3 Vai trò của bacterial cellulose đối với Acetobacter xylinum
A. xylinum là vi khuẩn không có khả năng quang hợp. Trong môi trường tự nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bao quanh tế bào, màng BC là một ví dụ. Những tế bào vi khuẩn sản xuất cellulose được bẫy bên trong mạng lưới polymer. Mạng lưới này là vật chống đỡ cho quần thể vi sinh vật luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không khí. Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và làm tế bào thâu nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose. Một vài tác giả
38
cho rằng, cellulose được tổng hợp bởi A. xylinum còn đóng vai trò tích trữ và có thể được sử dụng khi vi sinh vật này bị thiếu nguồn dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo-glucanase hay endo-glucanase, sự hiện diện cả hai loại enzyme này được phát hiện trong dịch nuôi cấy một vài chủng A. xylinum sản xuất cellulose. Nhờ vào tính dẻo và tính thấm nước của các lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi bất lợi trong môi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc, và các vi sinh vật gây bệnh. Các vi khuẩn A. xylinum có thể tăng trưởng và phát triển bên trong lớp vỏ bao. Cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% tế bào A. xylinum được bao BC sống sót sau 1 giờ xử lý tia cực tím. Tách BC khỏi tế bào, khả năng sống của tế bào giảm đáng kể, chỉ còn 3%.
2.5.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men tạo BC
Phƣơng pháp lên men: Ngày nay, sản xuất BC được thực hiện bằng nhiều phương pháp lên men khác nhau như nuôi cấy lắc, nuôi cấy tĩnh trên khay… Việc lựa chọn phương pháp nào để thực hiện là tùy thuộc vào định hướng ứng dụng vì sản phẩm BC sẽ có đặc tính hóa lý và cấu trúc khác nhau ứng với từng phương pháp khác nhau. Khi nuôi cấy tĩnh hay bề mặt, màng BC (S-BC) được tích lũy trên bề mặt môi trường nuôi. S-BC thương mại thông dụng như Nata-de Coco, màng rung truyền âm thanh, làm màng trị bỏng… Còn khi nuôi cấy lắc thì BC (A-BC) sẽ có dạng sợi huyền phù, hay dạng khối không đồng nhất (dạng hột nhỏ, hoặc hình cầu, hình elip). Kiểu nuôi này thích hợp hơn cho sản xuất BC công nghiệp và cho các ứng dụng khác của A-BC như: mỹ phẩm, vật liệu, chất nhũ hóa… Kiểu lên men BC này chưa được nghiên cứu và tiến hành ở Việt Nam. Theo các nhà nghiên cứu thì phương pháp nuôi cấy chìm cho hiệu suất sinh tổng hợp BC cao hơn vì các thiết bị lên men chìm có thể cung cấp tốt lượng oxy cho tế bào hoạt động. Đồng thời BC này còn có khả năng giữ nước cao hơn từ phương pháp tĩnh. Tuy nhiên, trở ngại ở đây là thường phát sinh các chủng đột biến
Cel- một cách ngẫu nhiên sau thời gian lên men. Các chủng Cel- này sẽ không còn khả
năng sản sinh BC nữa, vì thế làm hiệu suất BC giảm đáng kể.
Nhiệt độ: Nhiệt độ tối ưu cho sản sinh cellulose là 25-300C.
Giá trị pH: Nhìn chung, khoảng pH tối ưu để sản sinh BC là 4-7. Theo Hestrin và Schramm (1954) cho rằng pH dưới 7 là quan trọng hơn cả. Còn Fiedler và cộng sự thì cho pH từ 5-7 thì tối ưu. Hầu hết pH bằng 5 hay 6 được dùng trong các nghiên cứu. Nhưng để sản xuất cellulose công nghiệp thì pH từ 4-4,5 thì cho kết quả ưu thế hơn do giảm sự tạp nhiễm. A. xylinum đồng thời cũng sản xuất ra 2 loại: enzyme cellulase và bacterial cellulose. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, tuy đồng thời cùng sản xuất 2 loại: cellulose và cellulase nhưng có thể khống chế độ pH của môi trường dinh dưỡng để điều chỉnh mức độ sản sinh ra 1 trong 2 loại này. Khi pH ở mức từ 4 - 4,5 thì lượng BC được sản sinh ra nhiều nhất, còn pH ở mức từ 5 – 5,5 thì lượng enzyme cellulase được sản sinh cao hơn. Theo S. Hestrin và M. Schramm (1954), HCl và NaOH thích hợp dùng để điều chỉnh pH môi trường.
Nồng độ oxy: Nồng độ O2 liên quan trực tiếp đến việc sinh tổng hợp BC. Khi không khí giàu O2 (duy trì nồng độ lớn hơn 39%) được cho vào tại thời điểm 8h sau khi nuôi
39
cấy thì sản lượng BC tăng lên 1,5 lần và năng suất BC tăng từ 11% lên đến 18%. Tuy nhiên, với nồng độ O2 như thế, nhưng cho vào từ khi bắt đầu nuôi cấy thì số lượng tế bào suy giảm một cách nhanh chóng và hầu như vi khuẩn không sản sinh BC nữa. Điều này tác giả giải thích vì số lượng tế bào sống sót tại thời điểm bắt đầu nuôi cấy quá thấp nên không thể tìm thấy BC trong điều kiện nồng độ O2 hòa tan cao (vì trong điều kiện này đã làm ức chế vi khuẩn). Trong môi trường nuôi cấy tĩnh, tại nồng độ O2 10% và 15% một vài chủng A. xylinum cho sản lượng BC cao hơn ở nồng độ O2 là 20%. Khi nồng độ O2 tăng đến 30% sẽ làm giảm đáng kể sản lượng BC trong khi sự tăng trưởng của tế bào vẫn tiếp tục duy trì.
Nguồn dinh dƣỡng carbon: Những cơ chất được đánh giá là cho sản lượng BC cao, bao gồm: glucose, sorbitol và manitol. Glycerol, galactose, lactose, sucrose và maltose được xem là cơ chất thích hợp. Những cơ chất mà vi khuẩn này không có khả năng sử dụng để tạo màng cellulose là sorbose, mannose, cellobiose, erythritol, ethanol và acetate. Nguồn carbon từ glucose được cho là thích hợp trong việc tăng hiệu suất khả năng sản sinh BC.
Nguồn dinh dƣỡng nitrogen: Môi trường được dùng để nghiên cứu là môi trường có 0,5% cao nấm men và 0,5% pepton. Đối với một số dòng A. xylinum lại cho thêm tryptophan, dịch chiết ngô vào trong môi trường. Tuy nhiên dịch chiết ngô cho hiệu quả hơn cả. Các acid amin như methionin, glutamate thì luôn cần phải có trong môi trường vì những acid amin này có ảnh hưởng quan trọng đến sự phát triển của tế bào và sự tổng hợp cellulose. Người ta tìm ra ammonium dihydrogen phosphate có thể được sử dụng thay cho cao nấm men như một nguồn cung cấp nitơ và thêm vào một lượng nhỏ dịch chiết bột bắp (từ 0,125 tới 0,5 ml/l) thì gia tăng sản lượng BC.
2.5.5 Các ứng dụng của bacterial cellulose
Vì bacterial cellulose có những đặc tính như mức độ tinh khiết cao, độ kết tinh cao, mật độ dày, khả năng giữ cấu trúc tốt, khả năng hút nước và chứa nước mạnh và diện tích bề mặt riêng lớn khi so sánh với các loại cellulose thực vật, nên người ta đã áp dụng nó trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp dệt nhuộm, giấy, thực phẩm, y dược, xử lý chất thải, truyền thông, hầm mỏ và tinh sạch hoá chất. Ta có thể liệt kê một số ứng dụng phổ biến như sau:
Thực phẩm: về mặt hoá học, cellulose được sử dụng trong các quy trình chế biến thực phẩm với chức năng làm đông đặc và ổn định cấu trúc. Ứng dụng đầu tiên phải kể đến là làm thạch dừa (nata de coco). Do thạch dừa có cấu trúc giống như gel và hoàn toàn không tiêu trong đường tiêu hoá, nên nó có tác dụng tương tự các chất xơ, rất hữu ích cho hệ tiêu hoá. Ở Philippine và nhiều nước khác, người ta còn chế biến bacterial cellulose thành dạng bánh snack rất được ưa chuộng. Kể từ năm 1970, khi phát hiện ra hợp chất monacolin K (mevinolin) từ loài nấm Monascus có khả năng kìm hãm quá trình sinh tổng hợp cholesterol, người ta đã kết hợp giữa thạch dừa và monacolin K thành một loại thực phẩm chức năng có tên là monascus-nata. Ngoài ra, vì đặc tính vượt trội về bề mặt mềm mại và hệ sợi cao nên bacterial cellulose còn được ứng dụng rộng rãi trong các quy trình chế biến thực phẩm khác. Đến năm 1992,