NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN VI SINH BẰNG KỸ THUẬT 16S RDNA SEQUENCING VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ VIÊM PHÚC MẠC Ở BỆNH NHÂN LỌC MÀNG BỤNG LIÊN TỤC NGOẠI TRÚ

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh thận giai đoạn cuối vấn đề sức khỏe mang tính tồn cầu Đây tình trạng bệnh lý có tần suất ngày tăng nhanh đòi hỏi chi phí điều trị khổng lồ Vì bệnh thận mạn tính giai đoạn phải điều trị thay thực gánh nặng bệnh tật xã hội Khi bệnh nhân chẩn đốn bệnh thận giai đoạn cuối thận khơng đảm bảo chức cân nội môi thể, cần phải có biện pháp điều trị thay thận suy có phương pháp lọc màng bụng liên tục ngoại trú Một mục tiêu quan trọng điều trị chăm sóc bệnh nhân lọc màng bụng phòng ngừa phát sớm biến chứng phương pháp nhằm đảm bảo hiệu phương pháp nâng cao chất lượng sống bệnh nhân Trong số biến chứng lọc màng bụng biến chứng nhiễm trùng, đặc biệt viêm phúc mạc biến chứng nguy hiểm thường gặp Bệnh nhân lọc màng bụng bị viêm phúc mạc phải nhập viện điều trị nội trú, làm tăng chi phí điều trị, giảm chất lượng sống bệnh nhân; mặt khác viêm phúc mạc gây tình trạng màng bụng bị xơ hóa, dẫn đến tình trạng suy siêu lọc, suy dinh dưỡng, làm giảm chất lượng lọc, chí phải rời bỏ phương pháp điều trị khơng hiệu tình trạng viêm phúc mạc tái phát nhiều lần Mặt khác bệnh nhân lọc màng bụng thường có chống định với phương pháp thận nhân tạo chu kỳ.Vì phòng ngừa biến chứng viêm phúc mạc bệnh nhân lọc màng bụng quan trọng Khi bệnh nhân bị viêm phúc mạc việc phát sớm điều trị sớm nhằm bảo tồn màng bụng có ý nghĩa quan trọng mang tính sống phương pháp, có vai trò chẩn đốn sớm xác tác nhân vi sinh gây viêm phúc mạc [1],[4],[7],[8] [9],[10],[12],[15] Trên giới có nhiều nghiên cứu viêm phúc mạc bệnh nhân lọc màng bụng Tại Việt Nam, nghiên cứu biến chứng viêm phúc mạc chủ yếu nằm việc đánh giá chung hiệu phương pháp lọc màng bụng, phương pháp ni cấy tìm vi khuẩn chủ yếu phương pháp nuôi cấy thông thường nên bị nhiều yếu tố ảnh hưởng tỷ lệ tìm nguyên vi sinh chưa cao triệu chứng lâm sàng xét nghiệm viêm phúc mạc rõ rệt, nên phần lớn số bệnh nhân không xác định nguyên nhân gây nhiễm trùng Vì việc điều trị có hiệu viêm phúc mạc bệnh nhân lọc màng bụng bị cản trở nhiều lý đặc biệt việc chẩn đốn xác vi khuẩn gây bệnh loại tác nhân vi sinh đáp ứng với loại kháng sinh điều trị khác Chính từ thực tế lâm sàng đòi hỏi phải có phương pháp chẩn đốn xác nhanh chóng cho người bệnh [7],[8],[9],[12] Các nghiên cứu cho thấy kỹ thuật đại có sức thuyết phục mạnh mẽ để giải bất cập cho bệnh nhiễm khuẩn đưa kỹ thuật metagenomics (di truyền học sinh thái), kỹ thuật giải trình tự phân tích DNA vi sinh vật lấy từ môi trường mà không cần phải nuôi cấy chúng Trong kỹ thuật này, toàn hệ gen vi sinh vật mẫu bệnh phẩm xác định rõ Điều có tính ưu việt công cụ PCR (Polymerase chain reaction – phản ứng khuếch đại gen) bắt buộc phải có dấu sinh học cụ thể xác định vi sinh vật [27],[28] Tại Việt Nam, phương pháp lọc màng bụng bắt đầu phát triển nhanh từ năm 2004 có Bệnh viện Bạch Mai Hiện nay, Bệnh viện Bạch Mai trung tâm lọc màng bụng lớn thứ hai nước với khoảng 260 bệnh nhân áp dụng phương pháp Tuy nhiên khó khăn lớn điều trị viêm phúc mạc Bệnh viện Bạch Mai tỷ lệ nuôi cấy định danh vi khuẩn thấp, gây nhiều khó khăn cho cơng tác điều trị Vì vậy, nhằm góp phần vào đánh giá xác tác nhân vi sinh gây biến chứng viêm phúc mạc kết điều trị bệnh nhân lọc màng bụng liên tục ngoại trú tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác nhân vi sinh kỹ thuật 16S rDNA Sequencing đánh giá kết điều trị viêm phúc mạc bệnh nhân lọc màng bụng liên tục ngoại trú” nhằm mục tiêu: Mô tả đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng viêm phúc mạc bệnh nhân lọc màng bụng liên tục ngoại trú Bệnh viện Bạch Mai Xác định tác nhân vi sinh gây viêm phúc mạc bệnh nhân lọc màng bụng kỹ thuật 16S rDNA Sequencing có đối chiếu với phương pháp định danh vi khuẩn áp dụng Đánh giá kết điều trị viêm phúc mạc bệnh nhân nêu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát triển phương pháp lọc màng bụng [2],[3],[4],[5],[7], [8],[9],[10],[12] 1.1.1 Trên giới Năm 1987, Wegner người tiến hành thí nghiệm nghiên cứu tính chất màng bụng động vật Năm 1918, Blackfan Maxy áp dụng phương pháp truyền dung dịch natriclorua 0,9% vào màng bụng để điều trị cho trẻ em bị nước nặng Năm 1923, Ganter Putman nghiên cứu ứng dụng phương pháp LMB thực nghiệm vật gây ngộ độc chất tan máu Năm 1940 có 14 trường hợp lọc màng bụng thông báo Năm 1946 tác giả W.E Abbott cộng sáng chế dịch thẩm phân màng bụng ứng dụng số bệnh nhân suy thận có hiệu Năm 1948 Odel cộng tập hợp 101 trường hợp lọc màng bụng điều trị suy thận 38 cơng trình nghiên cứu Từ năm 1950 phương pháp LMB nhiều tác giả nghiên cứu ứng dụng lâm sàng song song với phương pháp thận nhân tạo Năm 1959 người ta sử dụng catheter cứng chất dẻo, catheter đưa vào ổ bụng qua trocar có đường kính lớn với kỹ thuật dịch lọc màng bụng dễ dò ngồi Năm 1960 Fred Boen điều trị cho bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối phương pháp LMB Năm 1963 Tenckhoff cải tiến catheter (catheter thẳng, đầu cong Dacron cuff) để cải thiện chất lượng LMB Năm1975 Robert Popovich cộng áp dụng LMB liên tục ngoại trú (Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis - CAPD) cách thay dịch 4-6 lần ngày điều trị suy thận mạn hiệu quả, đơn giản dễ thực Từ năm 1978 phương pháp LMB liên tục ngoại trú trở nên phổ biến áp dụng nhiều nước Năm 1979 FDA, Mỹ công nhận CAPD biện pháp điều trị thay thận hiệu cho bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối Ở Mỹ từ năm 1997 – 2003 áp dụng phổ biến máy thẩm phân phúc mạc mang lại kết tốt Năm 2006 Mujais Holmes dùng dung dịch thẩm phân carbonat/lactat làm giảm tỷ lệ viêm phúc mạc rõ rệt Trong năm gần phương pháp LMB liên tục ngoại trú áp dụng phổ biến nhiều nước giới để điều trị suy thận mạn giai đoạn cuối Hơn 150.000 bệnh nhân làm CAPD giới phần lớn Mexico, Anh, Canada, Hồng Kông …Tỷ lệ người tham gia điều trị suy thận mạn giai đoạn cuối phương pháp LMB không ngừng tăng cao số nước Tại Mỹ, năm 2003 25.000 bệnh nhân điều trị thay thận LMB Phương pháp có nhiều tiến kỹ thuật, chất lượng dịch lọc, chất lượng catheter, phòng ngừa biến chứng có phòng ngừa biến chứng viêm phúc mạc 1.1.2 Ở Việt Nam Từ cuối năm 1970 phương pháp lọc màng bụng áp dụng Khoa Thận – Tiết niệu Bệnh viện Bạch Mai để điều trị cho bệnh nhân suy thận cấp Từ năm 1988 Khoa Cấp cứu Bệnh viện Bạch Mai, Nguyễn Văn Lượng áp dụng kỹ thuật lọc màng bụng dung dịch tiêm truyền thông thường để điều trị cho bệnh nhân suy thận cấp đem lại kết tốt Những năm 1991 – 1992 Bệnh viện Chợ Rẫy (Thành phố Hồ Chính Minh), Trịnh Kim Ảnh cộng áp dụng phương pháp LMB để điều trị cho 69 bệnh nhân suy thận cấp sốt rét ác tính cho tỷ lệ thành công cao Năm 1992 – 1993 Bệnh viện Quảng Nam – Đà Nẵng áp dụng phương pháp LMB để điều trị cho 40 bệnh nhân suy thận cấp sốt rét ác tính cho kết tỷ lệ tử vong giảm 10% Những năm 1990 – 1994 Bệnh viện Đa khoa tỉnh Thái Bình áp dụng phương pháp LMB để điều trị cho 16 bệnh nhân suy thận cấp nguyên nhân khác nhau, kết cho thấy tỷ lệ tử vong giảm từ 36% xuống 19% Năm 2000 lọc màng bụng liên tục ngoại trú (CAPD) bắt đầu với hệ thống catheter thẳng Bệnh viện Nhân Dân 115, Bệnh viện Nguyễn Tri Phương (Thành phố Hồ Chí Minh) nhiên tỷ lệ nhiễm trùng (viêm phúc mạc) cao Từ 2004 phương pháp CAPD liên tục phát triển nhanh áp dụng hệ thống túi đôi (Twin-bags) Baxter, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Nhân Dân 115 (Thành phố Hồ Chí Minh) Bệnh viện Bạch Mai (Hà Nội) Trong năm gần đây, phương pháp LMB đặc biệt lọc màng bụng liên tục ngoại trú để điều trị bệnh nhân mắc bệnh thận giai đoạn cuối phát triển nhanh chóng quy mơ chất lượng thành phố lớn Hà Nội, Huế, Đà Nẵng thành phố Hồ Chí Minh số bệnh viện tuyến tỉnh Hiện nước có 30 đơn vị lọc màng bụng với khoảng 1.700 bệnh nhân thực phương pháp 1.2 Nguyên lý kỹ thuật lọc màng bụng [1],[4],[10],[11],[13] 1.2.1 Nhắc lại giải phẫu, mô học sinh lý màng bụng 1.2.1.1 Giải phẫu Màng bụng (phúc mạc) màng mạc lót tồn bên ổ bụng, gồm thành tạng Lá thành bao phủ mặt thành bụng, chậu hơng hồnh Lá tạng bao bọc tạng ổ bụng tiểu khung Diện tích màng bụng người trưởng thành khoảng 2,2 m 2, lớn diện tích lọc cầu thận (khoảng 1,8 m2) màng bụng tạng mạc treo chiếm khoảng 90% diện tích trao đổi Hình 1.1 Giải phẫu phúc mạc 1.2.1.2 Mơ học sinh lý Độ dày màng bụng từ 0,1 – mm, cấu tạo gồm lớp tế bào trung biểu mơ, lớp tổ chức collagen có độ dày – 20 micron có chứa số nguyên bào sợi mạch máu Màng bụng quan trong vận chuyển giàu mạch máu lưới tân dịch Lưu lượng máu lưới mao mạch màng bụng khoảng 50 – 80 ml/phút Màng bụng có lỗ lọc to lỗ màng bán thấm nhân tạo nên để lọt qua chất có trọng lượng phân tử > 300 dalton 1.2.2 Nguyên lý Lọc màng bụng phương pháp sử dụng màng bụng (phúc mạc) bệnh nhân làm màng lọc để đào thải sản phẩm chuyển hóa ngồi thơng qua dịch lọc Các chất chuyển hóa dịch dư thừa qua màng bụng bệnh nhân thải thay dịch lọc Màng bụng thực lọc chất theo chế - Sự khuếch tán: Sự khuếch tán xảy có chênh lệch nồng độ chất máu dịch lọc khoang phúc mạc Các chất máu có nồng độ cao có khả khuếch tán qua màng bụng dịch chuyển từ máu vào dịch lọc ổ bụng (ure, creatinin, acid uric, kali, gardenal…) Ngược lại, chất dịch lọc có nồng độ cao dịch chuyển vào máu (glucose, chất điện giải, chất đệm, calci…) Màng bụng màng bán thấm nên cho chất phân tử nhỏ không cho phân tử lớn (protein, hồng cầu, vi khuẩn) qua Đây chế đào thải cặn bã q trình giáng hóa protid, đào thải chất độc, thăng điện giải thăng toan kiềm - Sự siêu lọc: Siêu lọc (sự hút nước) xảy nhờ chênh lệch áp lực thẩm thấu tạo nhờ nồng độ glucose cao dịch lọc dẫn đến rút nước từ huyết tương vào ổ bụng Đây chế rút nước cho bệnh nhân có phù Sự vận chuyển glucose từ dịch lọc vào máu xảy chậm chất điện giải, dịch thẩm phân giữ ưu trương nhiều so với máu nên cho phép kéo nước từ máu vào dịch LMB Độ chênh lệch nồng độ thẩm thấu tạo glcuose vào lúc đầu buổi lọc cao so với cuối buổi lọc hiệu siêu lọc giảm dần liên quan tới thời gian lọc màng bụng 1.2.3 Chỉ định chống định 1.2.3.1 Chỉ định - Suy thận cấp chống định không thực phương pháp thận nhân tạo - Bệnh thận giai đoạn cuối (Mức lọc cầu thận < 15 ml/phút/1,73m2) - Trẻ em: Là đối tượng thường khó tạo đường vào mạch máu - Người lớn: Khó khăn tạo đường vào mạch máu (không làm thông động – tĩnh mạch bệnh nhân đái tháo đường, thông động – tĩnh mạch bị tắc hẹp không đủ lưu lượng để lọc máu thận nhân tạo…) - Sự lựa chọn phương pháp LMB phụ thuộc vào tuổi, nghề nghiệp, điều kiện địa lý (xa hay gần trung tâm thận nhân tạo), điều kiện kinh tế - văn hóa – xã hội, mơi trường gia đình nơi làm việc, hỗ trợ từ gia đình, tình trạng tim mạch, bệnh lý kèm theo… 1.2.3.2 Chống định - Chống định tuyệt đối: + Màng bụng khơng chức lọc bị kết dính diện rộng gây cản trở dòng chảy dịch lọc: Xơ hóa phúc mạc, viêm dính phúc mạc phẫu thuật ổ bụng cũ, + Một số trường hợp bất thường màng bụng thành bụng khắc phục: Thoát vị rốn, thoát vị cạnh rốn bẩm sinh, vị hồnh, rò bàng quang + Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính nặng - Chống định tương đối: + Nhiễm trùng da hay thành bụng + Thể tích khoang màng bụng bị hạn chế: Gan to, lách to, thận đa nang + Mới mổ ghép động mạch chủ bụng + Đã phẫu thuật cắt đại tràng, ruột non, thận… + Có shunt não thất - ổ bụng (dẫn lưu não thất não úng thủy) + Không dung nạp với dịch lọc chứa ổ bụng + Thị lực kém, có bệnh lý thần kinh, bệnh khớp tự làm LMB khơng có người giúp đỡ + Rối loạn tâm thần + Suy dinh dưỡng nặng + Bệnh lý đại tràng mạn tính nặng, viêm ruột + Đau lưng mạn tính bệnh lý cột sống, béo phì 1.2.4 Ưu nhược điểm phương pháp lọc màng bụng 1.2.4.1 Ưu điểm a Về y học - Quá trình lọc máu xảy liên tục + Thích hợp với tim mạch huyết động ổn định, giảm rối loạn nhịp tim, kiểm sốt tốt huyết áp + Tình trạng sinh hoá máu bệnh nhân ổn định hơn, tránh hội chứng cân - Còn tồn chức thận dự trữ - Kiểm soát tốt thiếu máu - Khơng cần dùng chống đơng tồn thân - Không cần làm thông động tĩnh mạch - Không cần tiếp xúc vật liệu lạ - Tránh lây nhiễm chéo (HIV, viêm gan virus B, viêm gan virus C ) bệnh nhân 10 - Được định ưu tiên bệnh nhân có suy tim, rối loạn nhịp, tình trạng mạch máu khó khăn làm thông động tĩnh mạch, bệnh nhân tiểu đường b Về xã hội - So với thận nhân tạo, LMB mang lại cho bệnh nhân nhiều tự hơn, BN tự thực nhà, không cần đến trung tâm thận nhân tạo nên không phụ thuộc nhiều vào bệnh viện - Bệnh nhân trì sinh hoạt hàng ngày suốt trình điều trị - Tự quản, dễ di động - Kỹ thuật đơn giản, đào tạo nhanh - Giá thành không cao so với lọc máu 1.2.4.2 Nhược điểm a Về y học - Tồn ống thông ổ bụng, dễ có biến chứng màng bụng bị tổn thương (xơ hóa màng bụng), viêm phúc mạc, tăng áp lực ổ bụng, thoát vị… - Nguy thiểu dưỡng cao - Dễ bị ứ trệ nước điện giải - Có nguy lọc không đầy đủ sau vài năm - Hiệu suất (bằng ¼ so với lọc máu thận nhân tạo) - Không thay chức thận nội tiết (kiểm sốt tạo hồng cầu, lỗng xương) b Về xã hội - Bắt buộc phải thực hàng ngày ngày nhiều lần (thời gian kéo dài hơn) 30 Mẫu dịch lọc huyết bệnh nhân gửi khoa Sinh hóa, Bệnh viện Bạch Mai, sau chuyển đến bệnh viện Karolinska, Stockholm, Thụy Điển để xác định tác nhân vi sinh vật kỹ thuật 16S rDNA Sequencing Một đoạn 1000 bp thuộc gen 16S rRNA vi khuẩn khuếch đại phương pháp PCR giải trình tự DNA mô tả trước Pettersson B cộng Semi-nested PCR sử dụng để khuếch đại 16S rRNA DNA sau chuỗi dideoxy nucleotide tiêu chuẩn Sử dụng JETquick PCR purification kit (Saveen, Malmö, Sweden) Và cho giải trình tự DNA sequencing sử dụng Big-Dye terminator v3.1-kit (Applied Biosystems) Máy phân tích sử dụng ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) Primernamn PCR- och sekvensprimers: iSentio 16SF iSentio 16SR Primersekvens 5´>CGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCA GCA GCGTGGACTACCAGGGTATCTAAT CC