môi trường nuôi cấy nấm men

kỹ thuật nuôi cấy nấm men

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương tiện thí nghiệm: 2.2.1 Địa điểm thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành phịng thí nghiệm lên men, Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Kỹ Thuật Môi Trường, Cơ Sở 1, Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm, TP.HCM 2.2.2 Thời gian thực hiện: Thời gian thực từ ngày 09/05/2011 2.2.3 Thiết bị dụng cụ: Các thiết bị dụng cụ cần thiết cho thí nghiệm: 2.2.3.1 Thiết bị: - Máy ép nho - Máy đo pH - Máy đo Bx - Thiết bị hấp khử trùng tự động - máy sấy 2.2.3.2 Dụng cụ: Cốc thủy tinh 500, Cốc thủy tinh 50, Thau nhựa, Rổ nhựa a Hóa chất sử dụng: - Cồn thực phẩm - Cồn cơng nghiệp - Hóa chất trùng: NaHSO3 - Tanin - Muối amon - Acid sobic - 5-Nitrofurylacrinlic (5-NFA) b Nguyên liệu: Nho, Đường, Nấm men Phương pháp thí nghiệm 2.1 Sơ đồ thí nghiệm Đề tài tổng hợp nghiên cứu nhà trước 2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm men a Nguyên tắc việc chế tạo môi trường: Dựa sở nhu cầu chất dinh dưỡng khả đồng hóa chất dinh dưỡng loại vi sinh vật Để đảm bảo cân áp suất thẩm thấu môi trường tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỉ lệ nồng độ chất thành phần môi trường Đảm bảo điều kiện lý hóa cần thiết cho hoạt động trao đổi chất vi sinh vật b Sơ đồ thực hiện: Bột môi trường Cân Bình tam giác Nước cất Nấu cách thủy Khử trùng (1210C, 15 phút Bảo quản kiểm tra môi trường Hình III.5 Sơ đồ chuẩn bị mơi trường ni cấy nấm men c Thuyết minh sơ đồ: Môi trường sử dụng ni cấy nấm men mơi trường Sabouraud, có công thức chế tạo sau: peptone 10g/l Glucose 40g Thạch 20g/l pH (250C) Nước lít 5.6-6.0 Lượng Nguyễn Đức,2002 - Cân mơi trường ni cấy hịa tan nước cất với hàm lượng xác định - Cho hỗn hợp vào bình tam giác nấu cách thủy để thành phần mơi trường hịa tan nước - Dùng bơng gịn bịt kín miệng bình tam giác - Rửa đĩa Petri, ống nghiệm, pipette Sau dùng giấy bịt kín để trùng - Tiệt trùng môi trường, dụng cụ nhiệt độ 1210C thời gian 15 phút - Lấy môi trường dụng cụ khỏi nồi tiệt trùng - Phân phối mơi trường từ bình tam giác dụng cụ Đối với đĩa petri lượng môi trường phân phối vào có độ dày khoảng 2mm Đối với ống nghiệm lượng môi trường cho vào 1/3 chiều cao ống - Q trình phân phối mơi trường vào dụng cụ chứa phải tuân thủ số nguyên tắc sau: + Môi trường phân phối phải trạng thái lỏng + Các thao tác phân phối cần phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không bị dính lên miệng hay thành dụng cụ chứa phải hồn thành trước mơi trường hóa rắn - Bảo quản kiểm tra môi trường; + Đối với môi trường chưa sử dụng, cần bảo quản chỗ mát, nhiệt độ thấp(khoảng 20-25 0C), hạn chế tác dụng ánh sáng không để môi trường bị khô + Trước sử dụng lại để kiểm tra độ vô khuẩn môi trường, ta thường đặt chúng vào chỗ ấm nhiệt độ 370C 42-48 giờ, sau lấy quan sát, loại bỏ ống có vi sinh vật phát triển 2.3 Bố trí thí nghiệm 2.3.1 Thí nghiệm 1: Phân lập kiểm tra hình thái tế bào đo kích thước Trong dịch lên men, vi sinh vật tồn dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn) Muốn nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa sử dụng lồi cần phải đưa chúng dạng khiết Phân lập nấm men trình tách riêng chủng nấm men từ quần thể ban đầu đưa dạng khiết Nấm men dạng khiết giống nấm men tạo từ tế bào ban đầu Đồng thời, xác định chủng nấm men có khả lên men tối ưu b Sơ đồ thực hiện: Hình III.6 Sơ đồ trình phân lập kiểm tra hình thái kích thước nấm men c.1 Thuyết minh sơ đồ: - Nho sau xử lí rửa sạch, dùng dao cắt đôi thành hai miếng - Để nửa trái bề mặt đĩa petri phân phối môi trường vào, lắc nhẹ cho nửa nho chạy bề mặt đĩa - Lấy nửa trái nho - Lật úp đĩa đặt vào tủ ủ vi sinh nhiệt độ 37 0C 24 đến 48 cho khuẩn lạc xuất - Xác định chủng nấm men cách quan sát; Để quan sát tế bào nấm men sử dụng phương pháp nhuộm tế bào có thuốc nhuộm : xanh methylen,lugol ,fucsin cacbolic Thành phần dung dịch logul: -Iot 2g -Iodua Kali 4g -Nước cất 100ml Thành phần dung dịch xanh methylen (loeffler’s) : Dung dịch A : - Xanh methylen 0.3 g - Cồn 95% 30 ml Dung dịch B : - KOH loãng (0.01% (w/v)) 100ml (khoảng 1viên KOH 1lít ) Trộn A B lại với Dùng que cấy lấy sinh khối nấm men nhỏ giọt nước để tạo huyền phù lên phiến kính Sau làm khơ, cố định nhuộm đơn xanh methylene dùng lamelle để quan sát tế bào nấm men Căn vào độ đậm nhạt để phân biệt tế bào sống chết Quan sát hạt glycogen tế bào nấm men nhuộm dung dịch lugol tế bào có màu vàng nhạt hạt glicogen có màu đỏ nâu + Hình dạng, kích thước màu sắc khuẩn lạc (bằng mắt thường) + Quan sát hình dạng kích thước tế bào nấm men kính hiển vi - Chọn giống nấm men tiêu biểu đem cấy vào ống nghiệm giống có khuẩn lạc trắng trong, tế bào hình trứng lớn Lưu ý : Mọi thao tác phải thực điều kiện vô trùng: + Tay bề mặt tiếp xúc tủ cấy khử trùng cồn + Khơng khí tủ khử trùng tia UV + Dụng cụ phải khử trùng lửa đèn cồn - Kiểm tra độ khiết giống vừa phân lập cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ chủng khuẩn lạc kiểm tra tế bào nấm men kính hiển vi - Cấy truyền để bảo tồn giống vừa phân lập: Tay trái cầm hai ống nghiệm (một ống giống ống môi trường), tay phải cầm que cấy khử trùng đèn cồn nóng đỏ que cấy Sau đó, dùng ngón ngón trỏ xoay nhẹ nút ống nghiệm Tiếp theo hơ nóng để khử trùng khơng khí miệng hai ống nghiệm Đợi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc ống nghiệm Kế tiếp rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm đưa vào ống nghiệm chứa môi trường, lướt que cấy mặt thạch theo kiểu hình chữ chi Cuối cùng, rút que cấy ra, khử trùng lại phần khơng khí nơi miệng hai ống nghiệm đậy nắp ống lại khử trùng lại que cấy sau sử dụng xong - Nhân giống ống nghiệm bình tam giác để phát triển thu sinh khối giống nấm men để giữ giống 2.3.1 Thí nghiệm 2: lên men giống Saccharomyces - Sơ đồ thí nghiệm - Phương pháp thực hiện: Chất lượng rượu nho, nói 60% nguyên liệu định, 40% công nghệ, nguyên liệu tốt cho sản phẩm tốt, nói chung muốn có ngun liệu tốt phải: • Chọn loại thích hợp • Tạo điều kiện thuận lơi để có chất lượng cao • Kiểm tra bổ sung thành phần nước trước lên men  Xử lý nguyên liệu a Tiếp nhận, phân loại: - Nguyên liệu nước có lẫn xác quả: vỏ, hạt, màng, xơ, có cuống nữa, khơng thể lên men ngun dạng có vỏ, màng bảo vệ phải phá huỷ enzyme dễ trộn vào nước - Trước hết phải chọn quả, loại bỏ thối, bệnh mang vào nước bào tử nấm, vi khuẩn cản trở hoạt động trình lên men Khác với trường hợp lên men nước quả, xác tham gia vào việc hình thành rượu Ở nhiều nho, mơ, táo, mùi thơm chủ yếu vỏ, muốn cho rượu vang có mùi thơm phải đợi cho chín tốt, vỏ chứa nhiều chất thơm Có dâu, nho cuống chứa nhiều tanin, muốn cho rượu vang có chất chát người ta để lại nước lượng cuống vừa đủ rượu có vị nồng đượm không chát - Nho phải thu hoạch thời điểm đạt độ chín kỹ thuật Tại thời điểm này, trái nho phải có hàm lượng đường acid theo tỷ lệ cân đối thích hợp cho mục đích xuất vang nho, loại bỏ thối, bệnh mang vào bào tử nấm, vi khuẩn cản trở hoạt động men b Rửa: Mục đích làm nho, bước tiến hành trước hay sau phân loại nguyên liệu c Tách cuống: Nho sau thu hái cuống cành Thường người ta tách rời thứ để rượu khỏi bị đắng chát d Làm dập, nghiền xé: Quá trình làm dập, nghiền xé cho phép lấy phần ép khác theo quy định nghiệm ngặt quy trình cơng nghệ Giai đoạn cần tiến hành cẩn thận, không làm dập hạt nho hạt nho dập chất độc có hạt nho ngồi người dùng bị ngộ độc, hạn chế gia tăng chất chát dịch nước nho Ngoài hạt cịn có tannin làm tủa protein, làm giảm chát lượng rượu vang Phần thịt phải xé nhuyễm Thu dịch cháo thực chất dịch chứa đường từ nho Để sản xuất rượu vang tốt trình nghiền phải tiến hành sau thu hoạch nho để tạo vị đặc trưng e Sulfit hóa: Sau làm nát nguyên liệu, người ta không tiến hành đun sôi dịch len men Để tiêu diệt vi sinh vật người ta dùng SO2 Lượng SO2 dịch lên men khơng q nhiều gây ức chế phát triển hoạt động chuyển hóa đường thành rượu, lượng sử dụng khoảng 30-120 mg/l Các nước sản xuất rượu vang thường dùng SO2 có tác dụng nhiều mặt: chống oxy hóa, làm giảm tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn có hại Tuy nhiên , dùng SO2 khơng liều lượng làm rượu vang có mùi khó chịu, tiêu diệt vi khuẩn có lợi, đồng thời tác nhân gây ngộ độc rượu vang f Ép: Ép xác với thiết bị thép không rỉ, thép inox không bị acid ăn mịn, khơng có vết sắt đồng g Lọc – Làm trong: lọc cuống với vang đỏ Ở giai đoạn thường xẩy trình lên men tự phát Một số kỹ thuật để ngăn ngừa tượng sử lý nước nho với SO (Sulfit hóa) kéo dài 12 – 24h, liều lượng 15 – 29g SO2/100 lít nho Tuy nhiên, dùng liều lượng cho phép, SO2 gây ngộ độc cho người tiêu dùng (lượng SO2 cho phép không vượt 450 mg/l)  Giai đoạn lên men h Lên men - ủ: Lên men rượu vang chia thành giai đoạn: Trong q trình lên men có bổ sung tannin 10g/100 lít dịch nước nho, nhằm kết tủa protein giúp nho Trong sản xuất rượu vang không dùng chất màu nhân tạo để tạo màu cho rượu vang, màu rượu phải hoàn toàn tự nhiên trái dùng để sản xuất rượu vang Lên men nhiệt độ 20-22 0C kéo dài 10-20 ngày, nhiệt độ cao 25-28 0C, khoảng 6-7 ngày Cuối giai đoạn lên men dịch lên men dần protein pectin lắng xuống, kết thúc trình lên men rượu đạt khoảng 8-10% cồn Để rượu đạt hài hòa ổn định mùi vị chất lượng rượu phải ủ nhằm làm cho khí ơxi tác động thật chậm Rượu vang ủ bồn thép lớn phải ủ lâu rượu vang để bồn thùng gỗ Ủ nhiệt độ – 100C để rượu vang hoàn thiện hương vị đặc trưng Thời gian ủ vài tháng, vài năm, chí hàng chục hàng trăm năm  Lên men phụ Giai đoạn cần làm cho độ cồn rượu đạt 12- 14 Nếu khơng đạt bổ sung thêm cồn, sau tồn trữ 100C 10 ngày, sau tách cặn tiếp tục trữ - Trường hợp sau lên men, lượng cồn tạo thành thấp sẻ xảy tượng chua rượu trình lên men axit axetic, người ta bổ sung thêm cồn để triệt tiêu trình lên men axit axetic tăng lượng cồn Cồn sử dụng phải cồn thực phẩm Lưu ý: Một số nơi cho loại cồn công nghiệp vào để tăng độ cồn rượu Cồn công nghiệp chứa lượng lớn methanol định có độc tính lớn uống từ – 10 ml methanol dẫn đến ngộ độc Nếu 10 ml gây mù, 30 ml gây tử vong Theo luật pháp nước sản xuất rượu vang, phép cho thêm đường, số chất kích thích xác định vào nước trước lên men, sau lên men xong gạn lọc ổn định rượu, không phép cho thêm chất vào (đường, cồn, axit, chất màu, chất thơm,…)  Một số điểm lưu ý trước tiến hành lên men: - Nghiền nho, nghiền kỹ giúp hòa tan chất màu, tannin, chất thơm triệt để lại làm cho rượu khó sau này, khuynh hướng nghiền nhẹ quả, khơng nát hết, đủ q trình lên men tốt rượu trong, không chát - Bổ sung đường: độ đường nước thường thay đổi giới hạn rộng, việc điều chỉnh độ đường cần thiết, độ đường 10-150 Bx dễ lên men, độ cồn hình thành khoảng 7-80, rượu lạt thường độ đường 20-220 Bx thích hợp - Điều chỉnh độ chua: pH tự nhiên nước thích hợp cho lên men 2,8-3,8, tối thích 3,2-3,5, pH thấp điều chỉnh cách them caxi cacbonat, độ chua chưa đủ bổ sung thêm acid tactric, acid xitric,… Trong sản xuất rượu vang theo kinh nghiệm trộn xanh chín với tỷ lệ thích hợp để đạt độ chua - Bổ sung chất kích thích lên men: đa số nhiệt đới nhiều nước, chín nhanh, việc bổ sung muối amon số vitamin B có tác dụng giúp trình lên men nhanh hơn, lượng cồn tạo thành nhiều hơn, muối amon liều lường dùng 0,05-0,1 g/l, cho hỗn hợp vitamin tốt, cịn khơng bổ sung vitamin B 0,5 mg/l Thiết bị lên men tránh thiết bị kim loại như: Fe, Cu,… Vì tannin acid dịch oxy hóa Fe, Cu tạo thành muối kim loại, gây mùi khó chịu gây ngộ độc, đặc biệt muối đồng (tình trạng thường xảy nơi sản xuất rượu quy mô nhỏ, thiết bị thiếu khơng đủ trình độ) Giai đoạn đầu q trình lên men nhiễm số loại nấm mốc: - Pichia oxy hóa rượu thành acid hữu - Zygopichia sinh acid citric acid axetic nhiều acid khác - Penicillin (mốc xanh) có khả tiết độc CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Phụ lục -hình thao tác lên men rv -1 số sản phẩm rv o - Tài liệu tham khảo ... liệu: Nho, Đường, Nấm men Phương pháp thí nghiệm 2.1 Sơ đồ thí nghiệm Đề tài tổng hợp nghiên cứu nhà trước 2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm men a Nguyên tắc việc chế tạo môi trường: Dựa sở... mơi trường Cân Bình tam giác Nước cất Nấu cách thủy Khử trùng (1210C, 15 phút Bảo quản kiểm tra mơi trường Hình III.5 Sơ đồ chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm men c Thuyết minh sơ đồ: Môi trường. .. men trình tách riêng chủng nấm men từ quần thể ban đầu đưa dạng khiết Nấm men dạng khiết giống nấm men tạo từ tế bào ban đầu Đồng thời, xác định chủng nấm men có khả lên men tối ưu b Sơ đồ thực