Đánh giá hoạt tính kháng helicobacter pylori in vitro và phân lập một số chất từ cao chiết của cây rau mương (ludwigia hyssopifolia)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ HUỲNH THỊ THANH THỦY ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG HELICOBACTER PYLORI IN VITRO VÀ PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT TỪ CAO CHIẾT CỦA CÂY RAU MƢƠNG (Ludwigia hyssopifolia) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CẦN THƠ – 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ HUỲNH THỊ THANH THỦY HELICOBACTER PYLORI IN VITRO VÀ PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT TỪ CAO CHIẾT CỦA CÂY RAU MƢƠNG (Ludwigia hyssopifolia) Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1- TS Nguyễn Thị Thu Trâm 2- ThS.DS Nguyễn Ngọc Quỳnh CẦN THƠ – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu cá nhân tơi Tất số liệu, kết luận văn hoàn toàn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình nghiên cứu khác Cần thơ, ngày 15 tháng 10 năm 2020 Huỳnh Thị Thanh Thủy LỜI CÁM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc nhất, xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Thị Thu Trâm, TS Nguyễn Ngọc Quỳnh PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ, ngƣời kính mến trực tiếp hƣớng dẫn tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin gởi đến PGS.TS Vĩnh Định, PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn, PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Vân TS Châu Minh Vĩnh Thọ, thầy kính mến tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ suốt hai năm học niên khóa 2018 - 2020 Tơi xin gởi đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau Đại học trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ lời cảm ơn chân thành đạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận văn Tơi xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn đến thầy Liên Bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, thầy Khoa Dƣợc, tồn thể giảng viên trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ nhiệt tình giảng dạy, cung cấp cho kiến thức làm tảng để tơi hồn thành luận văn Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Ban Chủ nhiệm, đồng chí đồng đội đơn vị Kho Xƣởng dƣợc - Cục Hậu cần QK9 tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu đề tài Cuối cho phép đƣợc bày tỏ lòng biết ơn tới ngƣời thân gia đình, bạn bè ln quan tâm, cổ vũ suốt sống nghiệp Xin chân thành cảm ơn tất cả! Cần Thơ, tháng 10 năm 2020 i MỤC LỤC TRANG BÌA TRANG BÌA PHỤ LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ vii ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Ludwigia 1.1.1 Đặc điểm thực vật học 1.1.2 Công dụng 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Hoạt tính sinh học 1.2 Tổng quan rau mƣơng (L hyssopifolia) 1.2.1 Đặc điểm thực vật học 1.2.2 Công dụng 10 1.2.3 Thành phần hóa học 11 1.2.4 Hoạt tính sinh học 12 1.3 Một số hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính kháng H pylori 15 1.4 Tình hình nghiên cứu rau mƣơng (L hyssopifolia) Việt Nam 17 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tƣợng, địa điểm thời gian 18 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 18 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 ii 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 20 2.2.2 Cỡ mẫu 20 2.2.3 Phƣơng pháp chọn mẫu 20 2.2.4 Nội dung nghiên cứu 20 2.2.4.1 Đánh giá hoạt tính kháng H pylori (in vitro) cao chiết từ rau mƣơng (L hyssopifolia) 20 2.2.4.2 Phân lập hợp chất từ cao có hoạt tính kháng H pylori 23 Chƣơng KẾT QUẢ 32 3.1 Đánh giá hoạt tính kháng H pylori (in vitro) cao chiết từ rau mƣơng (L hyssopifolia) 32 3.1.1 Xác định độ ẩm 32 3.1.2 Chiết năm loại cao thử hoạt tính kháng H pylori 32 3.1.3 Khảo sát hoạt tính kháng H pylori năm loại cao chiết 34 3.2 Phân lập hợp chất từ cao có hoạt tính kháng H pylori 35 3.2.1 Chiết cao methanol toàn phần 35 3.2.2 Chiết tách phân đoạn từ cao methanol toàn phần 35 3.2.3 Phân lập hợp chất tinh khiết từ bốn phân đoạn cao 36 3.2.3.1 Khảo sát cao n-hexan 36 3.2.3.2 Khảo sát cao cloroform 39 3.2.3.3 Khảo sát cao ethyl acetat 40 3.2.3.4 Khảo sát cao methanol 44 3.3 Xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết 45 3.3.1.1 Đặc điểm hợp chất (1) 45 3.3.1.2 Đặc điểm hợp chất (4) 46 Chƣơng BÀN LUẬN 48 iii Đánh giá hoạt tính kháng H pylori (in vitro) cao chiết từ 4.1 rau mƣơng 48 4.1.1 Xác định độ ẩm 48 4.1.2 Chiết năm loại cao thử hoạt tính kháng H pylori 48 4.1.3 Khảo sát hoạt tính kháng H pylori năm loại cao chiết 49 Phân lập hợp chất từ cao có hoạt tính kháng H pylori 51 4.2 4.2.1 Chiết cao methanol toàn phần 51 4.2.2 Chiết tách phân đoạn từ cao methanol toàn phần 51 4.2.3 Phân lập chất tinh khiết từ bốn phân đoạn cao 51 4.2.3.1 Khảo sát cao n-hexan 51 4.2.3.2 Khảo sát cao cloroform 52 4.2.3.3 Khảo sát cao ethyl acetat 53 4.2.3.4 Khảo sát cao methanol 53 4.3 Xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết 54 4.3.1.1 Đặc điểm hợp chất (1) 54 4.3.1.2 Đặc điểm hợp chất (4) 56 KẾT LUẬN 60 KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt Ac Acetone Aceton brs Broad singlet Mũi đơn rộng Carbon-13 (13C) nuclear magnetic Phổ cộng hƣởng từ hạt resonance nhân 13C Cf Chloroform cloroform d Douplet Mũi đôi DAL Dalton’s Ascitic Lymphoma Hạch bạch huyết Dalton 13 C-NMR DĐVN DE DEPT Dƣợc điển Việt Nam Diethyl ether Diethyl eter Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DMSO Dimethyl sulfoxide EA Ethyl acetate Ethyl acetat Et Ethanol Ethanol Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hƣởng từ hạt proton 1H nhân proton 1H H-NMR H pylori Helicobacter pylori Hx n-hexane IC50 m MBC The half maximal inhibitory concentration n-hexan Nồng độ ức chế 50 % Multiplet Mũi đa Minimum bactericidal Nồng độ diệt khuẩn tối concentration thiểu v Từ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt Me Methanol MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu s Singlet Mũi đơn t Triplet Mũi ba TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng VLC Vacuum liquid chromatography Sắc ký lỏng chân không Thuốc thử vanillin – acid VS W Methanol Sulfuric Water Nƣớc vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học số loài chi Ludwigia Bảng 2.1 Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 2.2 Dung môi, hóa chất sử dụng chiết xuất khảo sát 19 Bảng 3.1 Độ ẩm rau mƣơng trƣớc chiết xuất 32 Bảng 3.2 Kết chiết năm cao thử hoạt tính H pylori 33 Bảng 3.3 Đƣờng kính vịng vơ khuẩn năm loại cao chiết từ rau mƣơng mẫu đối chứng 35 Bảng 3.4 Các hệ dung mơi thăm dị cho sắc ký cột cao n-hexan 37 Bảng 3.5 Kết sắc ký cột cao n-hexan 38 Bảng 3.6 Kết sắc ký cột cao phân đoạn RMH 38 Bảng 3.7 Các hệ dung môi thăm dò cho sắc ký cột cao ethyl acetat 40 Bảng 3.8 Kết sắc ký cột cao ethyl acetat 41 Bảng 3.9 Các hệ dung mơi thăm dị cho sắc ký cột cao phân đoạn RMEA 42 Bảng 3.10 Kết sắc ký cột cổ điển cao phân đoạn RMEA 43 Bảng 4.1 Phổ NMR hợp chất (1) so sánh với tài liệu tham khảo 55 Bảng 4.2 Phổ NMR hợp chất (4) so sánh với tài liệu tham khảo 57 PL-1 Phụ lục 2.4 Phổ 13C-NMR mũi giãn hợp chất (4) PL-1 Phụ lục 3.1 Phổ DEPT hợp chất (4) 10 PL-1 Phụ lục 3.2 Phổ DEPT hợp chất (4) 11 PL-1 Phụ lục 3.3 Phổ DEPT hợp chất (4) 12 PL-2 Phụ lục 4.1 Phổ 1H-NMR hợp chất (1) 13 PL-2 Phụ lục 4.2 Phổ 1H-NMR mũi giãn hợp chất (1) 14 PL-2 Phụ lục 4.3 Phổ 1H-NMR mũi giãn hợp chất (1) 15 PL-2 Phụ lục 5.1 Phổ 13C-NMR hợp chất (1) 16 PL-2 Phụ lục 5.2 Phổ 13C-NMR mũi giãn hợp chất (1) 17 PL-2 Phụ lục 5.3 Phổ 13C-NMR mũi giãn hợp chất (1) 18 PL-2 Phụ lục 6.1 Phổ DEPT hợp chất (1) 19 PL-2 Phụ lục 6.2 Phổ DEPT hợp chất (1) 20 PL-3 KẾT QUẢ ĐIỆN DI DNA DNA mẫu điện di gel Agarose 1% (Phụ lục 7.1) Đánh giá sơ mẫu đƣợc ly trích thu đƣợc DNA ngun vẹn khơng bị đứt gãy LH Phụ lục 7.1 Phổ điện di DNA mẫu gel Agarose 1% KẾT QUẢ ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR Sản phẩm điện di mẫu với cặp mồi RbcL đƣợc khuếch đại với kích thƣớc 600 bp (Phụ lục 7.2) M LH 1000 bp 600 bp 400 bp 200 bp Phụ lục 7.2 Phổ điện di sản phẩm PCR mẫu với cặp mồi RbcL gel Agarose 1,5% (M, thang chuẩn 2-log - BioLabs, UK) 21 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GENE Phụ lục 7.3 Mức độ tƣơng đồng mẫu BLAST NCBI Mẫu LH Kết BLAST với sở liệu NCBI Loài tƣơng đồng Ludwigia hyssopifolia Mã số % đồng MH050039.1 99 Tác giả Zhu S (2008) TRÌNH TỰ CỦA MẪU >LH TGTTTGTAAAATCCGTCCACCACGAAGACATTCATAACATGCTCTA CCGTAGTTCTTAGCGGATAACCCTAATTTAGGTTTAATAGTACATC CCAATAGGGGACGGCCATACTTGTTCAACTTATCTCTCTCAACTTG GATACCATGAGGCGGTCCTTGGAAAGTTTTAGTATATGAAGGAGG GATTCTCAGATCCTCCAGACGTAGAGCGCGCAGGGCTTTGAACCC AAATACATTACCCACAATGGAAGTAAACATATTAGTAACAGAACC TTCTTCAAAAAGGTCTAAAGGGTAAGCTACATAACAGATATATTG ATTTTCTTCTCCAGCAACAGGCTCGATGTGGTAGCATCTTCCTTTAT AACGATCAAGGCTGGTAAGCCCATCGGTCCACACAGTTGTCCAGG TACCAGTAGAAGATTCAGCAGCTACTGCAGCCCCTGCTTCCTCAGC CGGAACTCCAGGTTGAGGAGTTACTCGGAATGCTGCCAAGATATC ACTATCTTTGGTTTCATACTCAGGAGTATAATAAGTCAGTCTATAA TCTTTAACACCAGCTTTGAATCCAACACTTGCATTAGTCTCTGTTTG GGGTGACATAAAAACAC 22 TRÌNH TỰ CỦA CÁC MẪU ĐỐI CHỨNG >MH050039.1 Ludwigia hyssopifolia voucher RQHN01114 ribulose-1,5bisphosphate carboxylase large subunit (rbcL) gene, partial cds; chloroplast CAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGATT ATAGACTGACTTATTATACTCCTGAGTATGAAACCAAAGATAGTG ATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGGC TGAGGAAGCAGGGGCTGCAGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTAC CTGGACAACTGTGTGGACCGATGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTAT AAAGGAAGATGCTACCACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAGAAAAT CAATATATCTGTTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAG GTTCTGTTACTAATATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGG TTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAGGATCTGAGAATCCCTC CTTCATATACTAAAACTTTCCAAGGACCGCCTCATGGTATCCAAGT TGAGAGAGATAAGTTGAACAAGTATGGCCGTCCCCTATTGGGATG TACTATTAAACCTAAATTAGGGTTATCCGCTAAGAACTACGGTAGA GCATGTTATGAATGTCTTCGTGGTGGACTTGATTTTACCAAGGATG ATGAAAACGTGAACTCACAACCATTTATGCGTTGGAGAGACCGTT TCTTATTTTGTGCCGAAGCAATTTATAAATCACAGGCTGAAACTGG TGAAATCAAAGGGCATTACTTGAATGCTACTG Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/MH050039.1?report=genbank&log $=nuclalign&blast_rank=2&RID=DKXW61ST014 ... pylori in vitro phân lập số hợp chất từ cao chiết rau mƣơng (Ludwigia hyssopifolia)? ?? Đề tài đƣợc tiến hành với hai mục tiêu cụ thể: Đánh giá hoạt tính kháng H pylori (in vitro) cao chiết từ rau. .. cứu 20 2.2.4.1 Đánh giá hoạt tính kháng H pylori (in vitro) cao chiết từ rau mƣơng (L hyssopifolia) 20 2.2.4.2 Phân lập hợp chất từ cao có hoạt tính kháng H pylori 23 Chƣơng... sát hoạt tính kháng H pylori năm loại cao chiết 34 3.2 Phân lập hợp chất từ cao có hoạt tính kháng H pylori 35 3.2.1 Chiết cao methanol toàn phần 35 3.2.2 Chiết tách phân đoạn từ cao