Nghiên cứu chiết xuất, tinh chế, định lượng acid gallic từ cây rau mương (ludwigia hyssopifolia)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ PHẠM THÀNH TRỌNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ, ĐỊNH LƯỢNG ACID GALLIC TỪ CÂY RAU MƯƠNG (Ludwigia hyssopifolia) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Cần Thơ - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ PHẠM THÀNH TRỌNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ, ĐỊNH LƯỢNG ACID GALLIC TỪ CÂY RAU MƯƠNG (Ludwigia hyssopifolia) Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: Ts NGUYỄN THỊ THU TRÂM Ts HUỲNH THỊ MỸ DUYÊN CẦN THƠ - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan thành nghiên cứu tơi Những kết luận văn hồn tồn trung thực chưa công bố nghiên cứu Cần Thơ, ngày 24 tháng 01 năm 2022 Phạm Thành Trọng LỜI CẢM ƠN Em kính xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ts Nguyễn Thị Thu Trâm Ts Huỳnh Thị Mỹ Duyên suốt thời gian học tập nghiên cứu đề tài Các tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu, truyền cho em niềm đam mê nghiên cứu khoa học Em xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, thành viên phịng Hóa - Mỹ phẩm trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Cần Thơ, đặc biệt ThS Dương Ngọc Châu tạo điều kiện, nhiệt tình hỗ trợ em thời gian em thực luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy, Liên mơn Hóa Phân Tích - Kiểm Nghiệm - Độc chất: thầy PGs Ts Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, cô PGs Ts Nguyễn Thị Ngọc Vân, thầy Ths Lữ Thiện Phúc, thầy Ths Nguyễn Mạnh Quân, cô Nguyễn Thị Đặng thầy Đỗ Trung Hiền động viên, khích lệ tinh thần tạo điều kiện thuận lợi thời gian em Cuối em muốn gửi lời cảm ơn đến anh chị thành viên lớp Chuyên khoa I, Cao học Kiểm nghiệm thuốc Độc chất gia đình ln đồng hành, tiếp thêm cho em nhiều động lực để vượt qua khó khăn thử thách i MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục i Danh mục chữ viết tắt iii Danh mục hình, sơ đồ, đồ thị v Danh mục bảng vi MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan rau mương 1.2 Tổng quan acid gallic Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3 Đạo đức nghiên cứu 31 Chương KẾT QUẢ 32 3.1 Định danh loài thực vật rau mương thu hái Cần Thơ 32 3.2 Nghiên cứu quy trình chiết xuất, tinh chế acid gallic từ rau mương (Ludwigia hyssopifolia) 35 3.3 Xây dựng quy trình định lượng acid gallic rau mương (Ludwigia hyssopifolia) 41 Chương BÀN LUẬN 50 4.1 Định danh loài thực vật rau mương thu hái Cần Thơ 50 4.2 Nghiên cứu quy trình chiết xuất, tinh chế acid gallic từ rau mương (Ludwigia hyssopifolia) 51 ii 4.3 Xây dựng quy trình định lượng acid gallic rau mương (Ludwigia hyssopifolia) 55 KẾT LUẬN 63 KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt 13 C-NMR Chữ nguyên Ý nghĩa Carbon 13 nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân resonance spectroscopy cacbon 13 DĐVN Dược điển Việt Nam Proton magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân spectroscopy proton High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao H-NMR HPLC chromatography LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen PDA Photo diode array Dãy diod quang RMEA Phân đoạn cao chiết ethyl acetat rau mương RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối s singlet Mũi đơn TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng δC Carbon chemical shift Độ dịch chuyển hóa học carbon δH Proton chemical shift Độ dịch chuyển hóa học proton USP United States Pharmacopeia Dược điển Mỹ iv Chữ viết tắt UPLC Chữ nguyên Ultra Performance Liquid Ý nghĩa Sắc ký lỏng siêu hiệu Chromatoghraphy UV-Vis Ultraviolet-Visible Tử ngoại - khả kiến VLC Vacuum liquid Sắc ký cột chân không chromatography v DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Trang Danh mục hình Hình 1.1 Cây rau mương (Ludwigia hyssopifolia) Hình 1.2 Thành phần hóa học số hợp chất rau mương Hình 1.3 Cơng thức hóa học phổ UV acid gallic pH khác 10 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái rau mương 32 Hình 3.2 Vi phẫu thân rau mương 33 Hình 3.3 Vi phẫu rau mương 33 Hình 3.4 Đặc điểm bột rau mương 34 Hình 3.5 Phổ điện di ADN mẫu (a) sản phẩm PCR mẫu với cặp mồi RBCL (b) gel agarose 1,5 % 35 Hình 3.6 Kiểm tra TLC EA 2.3 hợp chất phân lập 38 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn acid gallic bước sóng 270 nm 39 Hình 3.8 Phổ UV độ tinh khiết pic acid gallic tinh chế 39 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu acid gallic tinh chế bước sóng 270 nm 40 Hình 3.10 Sắc ký đồ hệ pha động mẫu thử 41 Hình 3.11 Chồng sắc ký đồ đánh giá tính đặc hiệu 45 Hình 3.12 Phổ UV acid gallic mẫu chuẩn mẫu thử thêm chuẩn45 Hình 3.13 Chồng phổ sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn ngày 48 Hình 4.1 Cấu trúc hóa học hợp chất EA 2.3: Acid gallic 54 Danh mục sơ đồ Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết tách phân đoạn từ cao methanol toàn phần 22 Sơ đồ 3.1 Quy trình phân lập hợp chất từ cao ethyl acetat 37 Sơ đồ 3.2 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 44 Danh mục đồ thị Đồ thị 3.1 Đồ thị tương quan nồng độ diện tích pic acid gallic 46 vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 3.1 Mức độ tương đồng mẫu BLAST NCBI 35 Bảng 3.2 Độ ẩm rau mương trước chiết xuất 35 Bảng 3.3 Kết định lượng acid gallic tinh chế 40 Bảng 3.4 Chương trình gradient nghiên cứu 41 Bảng 3.5 Kết khảo sát dung môi chiết 42 Bảng 3.6 Kết khảo sát hỗn hợp dung môi methanol với nước 42 Bảng 3.7 Kết khảo sát tỷ lệ khối lượng mẫu thể tích dung môi chiết 42 Bảng 3.8 Kết khảo sát thời gian siêu âm 43 Bảng 3.9 Kết khảo sát số lần chiết 43 Bảng 3.10 Kết tính tương thích hệ thống hỗn hợp chuẩn 44 Bảng 3.11 Độ tinh khiết pic acid gallic mẫu thử thêm chuẩn 45 Bảng 3.12 Kết độ xác ngày 47 Bảng 3.13 Kết độ xác liên ngày (n = 18) 48 Bảng 3.14 Kết thẩm định độ 48 Bảng 3.15 Hàm lượng acid gallic số mẫu Cần Thơ 49 Bảng 4.1 Phổ NMR hợp chất EA 2.3 so sánh với tài liệu tham khảo 54 28 PL-3 Độ xác ngày mẫu thử 29 PL-3 Kết độ xác acid gallic Mẫu thử Diện tích pic (mAUs) Nồng độ (µg/mL) 1-1 642653 19,09 1-2 635238 18,81 1-3 634038 18,79 1-4 645092 19,14 1-5 640216 19,01 1-6 620681 18,38 2-1 670179 19,85 2-2 658863 19,50 2-3 667606 19,79 2-4 671876 19,91 2-5 671028 19,86 2-6 665593 19,71 3-1 648218 19,21 3-2 660346 19,58 3-3 656215 19,42 3-4 656304 19,46 3-5 651830 19,33 3-6 654542 19,43 30 PL-3 Phụ lục 3.17 Thẩm định độ Độ thực thêm chuẩn nồng độ 50 % 31 PL-3 Độ thực thêm chuẩn nồng độ 100 % 32 PL-3 Kết thẩm định độ quy trình Mức 150% 100% 50% Lượng chuẩn thêm vào (µg/mL) 30 20 10 Diện tích pic (mAU,s) Lượng chuẩn tìm thấy (µg/mL) Tỷ lệ phục hồi (%) 1583093 28,52 95,1% 1596020 29,06 96,9% 1567600 28,11 93,7% 1540537 27,31 91,0% 1601141 29,23 97,4% 1553154 27,72 92,4% 1245886 17,49 87,5% 1229526 17,10 85,5% 1269346 18,30 91,5% 1234558 17,29 86,5% 1263205 18,06 90,3% 1237714 17,39 87,0% 966217 9,28 92,8% 987360 9,90 99,0% 967839 9,37 93,7% 983607 9,78 97,8% 988295 9,91 99,1% 986229 9,82 98,2% T a0vrp cqNC I{$A Xe nqt cHU NCHIA Yt[A NAM Bdc ?Rtr-CNG B4r HCC Y EIISC CAN THC} llp - Tq'dc - Henh phtic Cdn'fho', tlgay thattg ndm 2A BIEN eAn c0a HQI BONG CHAn4 LUAN vAx Tr{Ac si Fio t8n hoc vi6n: PFI$M TI{A.NEI TRQNG DA tdi: "NgkiAn cri'u ckiil ,u&t, tinh clrA, t{inle iu'grcg acid m${r'ng (Ludwigia hys s opifcli a) " N-uuoi huc'ng d6n: TS Nguy6n Thi Thu Trirn TS Hulnh Thl N4y Duy6n Chu,v6n tgd:nh: Ki€ra nghiCm thu6c vd doc ch6t D'.ioc c6ng nh6n id irgc rziOn Th?c ngi.r, 25i09 DAIS cua HiQu tr-u'c'ng Tiud'ng L gallic t*' ciijt rau sI thec Quy€t dinh s6 1862/QD-DF{YDCT Dai hoc Y Duo-c Cin Tho Ii()I I)oI{G CI{AM LUAI\I \/AlY Cin cf'c6c quy dinh cua B0 Gi6o dric vd Ddo tao, Bg Y te v6 viec td chirc cXi6m lu.f.n vIn Thac sr, HiQu tru:ong Trud'ng Dai hqc Y Duo.'c C6n Tho Cnd ta quy6t dinh llrlirh lap Hrir d6r:g chAm iuAn vEn tO UqD-DHYDCT ngiy /20 '.'., -s6m cac tirailli vidn sau: 1-T Ho it A T l ta; vi Trfch nhiQrn HQi dOng t6n irGS.TS Duor-rg XuAn Chil GS.TS NguvSn Duc TuAn PGS.TS D6 Chau ll{ir* \zinh Tho l1CS.TS VO Thi Bach l{uQ rhi N c \/An PGS.]-S N Chu trcir Phan biQn I Phan bi6n U - \/1et-) U vi6n - Thu ky ,^ tsridi chArn li-r6n vri.n duoc tr0n hdnh rzao hic i gio J.0 phirt rga)/ ".1 Trudng Dai hoc Y Duqc Cin Thc; " j rv r:z=tr ft:lE'.a ii" 1\Lri I-Ftii\L-t nriu-D'itli\ n i t.rr}li.\: l **i diQn Plidng Elo tao sau dp.r hoc dqc.quy6t djnh thinh iQp ltQi doiig chArn iu6:: virr Tiiac si ctra f n.rdxg Eqi hqc Y Duc-c C2n'Ihs, c6ng b0 ttrrdiih phiu liQi dong ,.^ rii:i: biio di0u krQ;r d0 HOi d6ng ldm viQc Chtltich 'riQi ddng: pC"S"fS Duong XuAn Chfr'diAu tr