Luận án tiến sĩ HUS nghiên cứu chiết xuất, tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của một vài carotenoid từ cây cỏ việt nam dùng để sản xuất thực phẩm chức năng

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALT: Alanine aminotransferase (GPT: Glutamate pyruvate transaminase) AST: BCC: Aspartate aminotransferase (GOT: glutamate oxalate transaminase) Cơng ty phân tích thơng tin thị trường Massachusetts, Mỹ CNSH: COX-2: DMSO: Công nghệ sinh học Protein tiền viêm Dimethyl Sulfoxide ELISA: Enzyme - linked immunosorbent assay FDA: phẩm Mỹ) HPLC: Food and Drug Administration (Cục Quản lý thực phẩm dược High performent liquid chromatography (sắc kí lỏng hiệu cao) IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry (Liên hiệp Hóa học Thuần túy Ứng dụng Quốc tế) KB : Epidermic carcinoma (Ung thư biểu mô) LCMS: Liquid Chromatography Mass Spectrometry (sắc ký lỏng khối phổ) LDL: LNCap: liệt) Low Density Lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thấp) Hormone dependent human prostate carcinoma (Ung thư tuyến tiền LU: Lung carcinoma (ung thư phổi) MCF: Human breast carcinoma (ung thư vú) NCI: National Cancer Institute (Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ) NEI: National Eye Institue (Viện mắt Quốc gia Hoa Kỳ) NMR: Nuclear Magnetic Resonance spectrometry (cộng hưởng từ hạt nhân) nNOS: neuronal Nitric Oxyde Synthetase (enzyme tổng hợp oxit nitric não) OD: Optical density (mật độ quang học) OECD: Organization for Economic Cooperation and Development (Tổ chức hợp tác Phát triển Kinh tế) PBS Đệm PBS (đệm huyết phơi bị) SDS: Sodium Dodexyl Sulphate SRB: TCA: TEMED: Sulforhodamin B Trichlo acetic acid Tetramethylethylenediamine TPCN: UVA: UVB: Thực phẩm chức U violet A (tia cực tím A) Ultra violet B (tia cực tím B) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các nhóm chức phổ biến Bảng 1.2 Một số ví dụ nhóm chức carotenoid chứa chúng Bảng 2.1 Các mẫu thực vật sử dụng nghiên cứu Bảng 2.2 Các hệ dung môi sử dụng thí nghiệm tách chiết tinh carotenoid Bảng 2.3 Thành phần loại đệm, dung dịch sử dụng nghiên cứu hoạt tính sinh học Bảng 2.4 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu Bảng 3.1 Thành phần viên nang thực phẩm chức Ocpola LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc khung carbon carotenoid Hình 1.2 Cấu trúc chung carotenoid hydrocarbon Hình 1.3 Eschoscholtxanthin Hình 1.4 β-citraurin Hình 1.5 Peridinin Hình 1.6 Astacen Hình 1.7 Những tác hại gốc tự gây nên cho thể sống Hình 1.8 Các tác dụng sinh học carotenoid Hình 1.9 β-carotene Hình 1.10 Lycopene Hình 1.11 Lutein Hình 1.12 Sản lượng carotenoid năm 2004, dự kiến năm 2009 Hình 1.13 Một số sản phẩm thực phẩm chức chứa carotenoid Hình 1.14 Một số sản phẩm TPCN chứa carotenoid sử dụng Việt nam Hình 2.1 Đường chuẩn β-carotene Hình 2.2 Đường chuẩn lycopene Hình 2.3 Đường chuẩn lutein Hình 3.1 Ảnh hưởng β-carotene lên hoạt độ catalase máu người Hình 3.2 Ảnh hưởng lycopene lên hoạt độ catalase máu người Hình 3.3 Ảnh hưởng lutein lên hoạt độ catalase máu người Hình 3.4 Ảnh hưởng -carotene lên hoạt độ peroxidase máu người Hình 3.5 Ảnh hưởng lycopene lên hoạt độ peroxidase máu người Hình 3.6 Ảnh hưởng lutein lên hoạt độ peroxidase máu người Hình 3.7 Sự tăng khối lượng chuột lơ thí nghiệm Hình 3.8 Sự thay đổi hoạt độ catalase máu chuột lơ thí nghiệm Hình 3.9 Sự thay đổi hoạt độ catalase gan chuột lơ thí nghiệm Hình 3.10 Sự thay đổi hoạt độ peroxidase máu chuột lơ thí nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 3.11 Sự thay đổi hoạt độ peroxidase gan chuột lơ thí nghiệm Hình 12 Hàm lượng cytochrome b5 máu gan lơ thí nghiệm Hình 3.13 Các giá trị GOT, GPT máu lơ chuột thí nghiệm Hình 3.14 Các giá trị GOT, GPT gan lô chuột thí nghiệm Hình 3.15 Hình ảnh quan sát tiêu đúc cắt tế bào gan chuột 10 lô thí nghiệm Hình 3.16 Giá trị IC50 chế phẩm carotenoid TPCN Ocpola dòng tế bào KB LNCap Hình 3.17 Nồng độ chế phẩm carotenoid TPCN Ocpola giá trị IC 50 tế bào ung thư KB LNCap Hình 3.18 Hình ảnh tế bào KB, LNCap tác dụng lycopene nồng độ khác Hình 3.19 Hoạt độ caspase-3 dịng tế bào ung thư phổi tác động carotenoid tinh TPCN Ocpola Hình 3.20 Hoạt độ caspase-3 dòng tế bào ung thư vú tác động carotenoid tinh TPCN Ocpola Hình 3.21 Sản phẩm TPCN Ocpola LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CAROTENOID 1.1.1 Carotenoid 1.1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.1.2 Cấu trúc hóa học phân loại carotenoid 1.1.1.3 Tính chất vật lý 1.1.1.4 Tính chất hóa học 1.1.2 Vai trò carotenoid 1.1.2.1 Vai trò carotenoid thực vật 1.1.2.2 Chức carotenoit đời sống động vật sức khỏe ngƣời 1.1.3 Một số carotenoid điển hình 12 1.1.3.1 Beta-carotene 12 1.1.3.2 Lycopene 14 1.1.3.3 Lutein 16 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG, DƢỢC PHẨM PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG 18 1.2.1 Khái niệm thực phẩm chức 19 1.2.2 Vai trò thực phẩm chức sống đại 20 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 NGUYÊN LIỆU 24 2.1.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu 24 2.1.2 Hóa chất thiết bị thí nghiệm 29 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.2.1 Phương pháp chiết xuất tinh chế carotenoid 31 2.2.2 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa carotenoid tinh chế 36 2.2.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học carotenoid lên dòng tế bào ung thư in vitro 40 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.2.4 Nghiên cứu tác dụng sinh học carotenoid lên chuột thực nghiệm theo phương pháp Favari [50] 43 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 KẾT QUẢ THU VÀ CHỌN MẪU NGHIÊN CỨU ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 3.1.1 Kết thu mẫu khảo sát mẫu nghiên cứuError! Bookmark not defined 3.1.2 Kết nghiên cứu sắc ký lỏng hiệu cao Error! Bookmark not defined 3.1.3 Kết qủa tinh carotenoid 50 3.2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CAROTENOIT 53 3.2.1 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa điều kiện in vitro 53 3.2.1.1 Hoạt tính chống oxy hóa chế phẩm tinh carotenoid lên catalase 53 3.2.1.2 Hoạt tính chống oxy hóa chế phẩm tinh carotenoid lên peroxidase 55 3.2.1.3 Kết khả chống oxy hóa lên tế bào gan chuột in vitro 57 3.2.2 Hoạt tính chống oxy hoá  -carotene, lycopene lutein điều kiện in vivo chuột 58 3.2.2.1 Sự thay đổi trọng lƣợng trung bình chuột trƣớc sau thí nghiệm 59 3.2.2.2 Hoạt tính catalase máu chuột 60 3.2.2.3 Hoạt tính peroxidase máu gan chuột 61 3.2.2.4 Enzyme cytochrome b5 máuvà gan chuột 64 3.2.2.5 Các số GOT GPT máu gan chuột 64 3.2.2.6 Kết làm tiêu đúc cắt tế bào gan chuột 67 3.2.3 Kết thử nghiệm hoạt tính β-carotene, lycopene lutein lên dòng tế bào ung thư 69 3.2.3.1 Kết thử độ độc lên tế bào Error! Bookmark not defined 3.2.3.2 Kết cảm ứng enzyme Caspase của β-carotene, lycopene lutein lên LU1 MCF7 73 3.3 KẾT QUẢ ỨNG DỤNG VÀO THỰC TẾ 75 3.3.1.Thực phẩm chức TPCN Ocpola 77 3.3.2 Thực phẩm chức Kingpharocula 89 KẾT LUẬN 90 KIẾN NGHỊ 91 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 PHỤ LỤC Hình ảnh sắc ký mỏng mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Kết sắc ký mỏng carotenoid mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Hình ảnh sắc ký hiệu cao mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Kết sắc ký lỏng hiệu cao mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Các bảng số liệu nghiên cứu luận án PHỤ LỤC Khối phổ carotenoid PHỤ LỤC Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carotenoid PHỤ LỤC Chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm TPCNOcpola PHỤ LỤC Chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm Kingpharocula LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỞ ĐẦU Các carotenoid nhóm chất màu thiên nhiên có nhiều cỏ, vi sinh vật… tạo màu sắc khác cho loại hoa, lá, củ, quả… Trong y học đại, số carotenoid đƣợc sử dụng làm thuốc nhƣ  – carotene, lutein, lycopene, zeaxanthin…; bên cạnh carotenoid cịn đƣợc dùng làm mỹ phẩm, bảo vệ da, làm đẹp da nhƣ lycopene… Carotenoid đƣợc dùng rộng rãi làm phẩm màu thực phẩm Đặc biệt carotenoid đƣợc sử dụng rộng rãi ngành sản xuất thức ăn cho chăn nuôi gà, nuôi trồng thủy sản nhƣ tôm, cá hồi… Nguồn nguyên liệu sản xuất carotenoid thực vật vi sinh vật, số carotenoid đƣợc sản xuất tổng hợp hóa học nhƣ astaxanthin canthaxanthin Gần đây, carotenoid đƣợc sử dụng nhiều sản xuất thực phẩm chức bổ sung dinh dƣỡng chúng có hoạt tính chống oxy hóa mạnh có tác dụng phòng hỗ trợ điều trị số bệnh ung thƣ nhƣ  – carotene,  – carotene,  – carotene, lutein, zeaxanthin, lycopene… Trên thị trƣờng quốc tế,  - carotene đƣợc chiết xuất từ củ cà rốt, dầu cọ đỏ từ vi tảo Dunaliella salina…; lycopene đƣợc chiết xuất từ cà chua; lutein đƣợc chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ, zeaxanthin đƣợc chiết từ ngô vàng… Ở nƣớc ta có nguồn nguyên liệu carotenoid độc đáo đặc hiệu gấc chín Màng đỏ hạt gấc nguyên liệu giàu  - carotene lycopene, phần cùi thịt vàng gấc gấc chứa nhiều  - carotene Đất nƣớc ta với nhiều loại cỏ nguồn tài nguyên đa dạng phong phú để tìm kiếm thêm loại carotenoid dùng làm nguyên liệu để sản xuất carotenoid đƣợc sử dụng rộng rãi giới nhằm cung cấp cho nhu cầu sử dụng làm thuốc, mỹ phẩm, phẩm màu, phụ gia thức ăn gia cầm, cá, tơm… cịn có nhiều tiềm xuất Từ đó, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chiết xuất, tinh chế xác định hoạt tính sinh học vài carotenoid từ cỏ Việt Nam dùng để sản xuất thực phẩm chức năng” LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đề tài khơng có ý nghĩa khoa học mà cịn có ý nghĩa thực tiễn cho cơng bảo vệ nâng cao sức khỏe cộng đồng Mục tiêu đề tài: - Chiết xuất, tinh chế số carotenoid có cỏ Việt Nam xác định chất hóa học số carotenoid phƣơng pháp đại nhƣ sắc ký mỏng, sắc ký lỏng hiệu cao, khối phổ cộng hƣởng từ Qua sàng lọc, để tìm thực vật có chứa hàm lƣợng cao  - carotene, lycopene lutein - Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa  - carotene, lycopene, lutein, sản phẩm thực phẩm chức TPCN Ocpola điều kiện in vitro qua số enzyme oxy hóa nhƣ catalase, peroxidase, cytochrome b5, GOT, GPT, lên tế bào gan chuột Nghiên cứu khả gây độc lên dòng tế bào ung thƣ biểu mô miệng KB, ung thƣ tuyến tiền liệt LNCap, khảo sát khả cảm ứng caspase-3 lên dòng tế bào ung thƣ phổi LU-1, ung thƣ vú MCF-7, Nghiên cứu ảnh hƣởng hoạt chất carotenoid TPCN Ocpola điều kiện in vivo lên chuột bị gây độc CCl4 Dựa vào kết nghiên cứu hóa học số hoạt tính sinh học số carotenoid có cỏ Việt Nam, luận án đề xuất số kiến nghị sử dụng nguồn cỏ giàu carotenoid Việt Nam để góp phần sản xuất dƣợc phẩm, thực phẩm chức LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CAROTENOID 1.1.1 Carotenoid 1.1.1.1 Giới thiệu chung Thuật ngữ carotenoid dùng để nhóm gồm khoảng 600 sắc tố tồn lạp màu thực vật quan quang hợp số loài tảo, nấm chí số vi khuẩn, động vật Trong thực vật chúng có vai trị hấp thu lƣợng mặt trời để sử dụng quang hợp đồng thời bảo vệ chlorophyll khỏi tác hại photon Sắc tố carotene màu vàng, dạng tinh thể đƣợc tách thành công lần vào năm 1831 Wackenroder, cịn xanthophyll đƣợc tách chiết thành cơng lần vào năm 1837 Berzelius [55] Giả thuyết tồn sắc tố xanh lần đƣợc đƣa vào năm 1827 30 năm sau đƣợc chứng minh đầy đủ Fremy Stokes [54, 55] Tuy nhiên nghiên cứu carotene xanthophyll thực phát triển Tswett phát minh kỹ thuật sắc ký chúng thuộc nhóm carotenoid [55]; Zechmeister phát carotenoid polyen Sự phát triển nhanh chóng kỹ thuật quang phổ, cộng hƣởng từ hạt nhân kỹ thuật khối phổ tạo bƣớc nhảy vọt nghiên cứu đặc điểm hóa học carotenoid [55] Ngày có hiểu biết đầy đủ hóa học carotenoid Mặc dù thiên nhiên số lƣợng carotenoid nhiều nhƣ nhƣng có khoảng 50 loại carotenoid thực phẩm có 14 - 20 loại phát thấy máu ngƣời Nhƣ vậy, số carotenoid đƣợc hấp thu, cịn lại chúng theo đƣờng ruột thải ngồi 1.1.1.2 Cấu trúc hóa học phân loại carotenoid Carotenoid hợp chất thuộc nhóm tetra terpenoid, hợp chất hữu có 40 nguyên tử carbon Chúng cấu trúc thành chuỗi polyen, kết thúc vịng thơm, có cấu tạo gồm đơn vị isoprenoid (ip) liên kết với mà trung tâm phân tử nằm hai nhóm methyl vị trí 1, (hình 1.1) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 85 Lá rau dệu ++ + - 86 Lá rau má ++ + - 87 Lá rau muống + + - 88 Lá rau ngổ + + - 89 Lá rau ngót ++ + - 90 Lá rau răm + + - 91 Lá rau sam ++ + - 92 Lá su su bánh tẻ ++ + + 93 Lá tía tơ + + + 94 Lá tỏi tây + + - 95 Lá trầu không + + + 96 Màng hạt gấc chín +++ + ++ 97 Màng hạt mướp đắng chín ++ + + 98 Nhị sen trắng + + - 99 Rau cần tây + + - 100 Rau đay + ++ - 101 Rau dền cơm + + - 102 Rau dền gai ++ + + 103 Rau dền tía ++ + - 104 Rau diếp cá + + - 105 Rau húng - + - 106 Sâm đại hành - + - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 107 Súp lơ xanh + + - 108 Thịt bí ngơ ++ + + 109 Thịt đu đủ chín ++ + + 110 Thịt đu đủ xanh - + - 111 Thịt múi mít - + - 112 Thịt ớt đỏ + - ++ 113 Thịt ớt vàng + + ++ 114 Thịt bàng + + + 115 Thịt bơ + - + 116 Thịt cà chua + + +++ 117 Thịt đa + - + 118 Thịt dành dành + - + 119 Thịt đào + - + 120 Thịt dứa + - + 121 Thịt hồng trứng ++ - ++ 122 Thịt mận + + + 123 Thịt ớt đỏ + - + 124 Thịt ớt xanh + - + 125 Thịt sim + - + 126 Thịt trứng gà ++ - + 127 Thịt xoài ++ - + 128 Thịt vỏ hạt chanh leo + - + LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Sắc ký đồ HPLC số mẫu nghiên cứu Lutein (Rt: 3.631 phút) Lycopene (Rt: 6.541 phút) Beta carotene (Rt: 8.504 phút) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Hàm lượng carotenoid mẫu nghiên cứu HPLC STT Mẫu nghiên cứu Hàm lượng -carotene (mg/100g bột khô) Hàmlượng lutein Hàm lượng lycopene (mg/100gbột khô) (mg/100g bột khô) Cánh hoa bí ngơ 0,061 0,12 + Cánh hoa cải cúc 0,078 0,12 + Cánh hoa cúc chuồn chuồn 0,053 0,04 - Cánh hoa cúc vạn thọ 0,9 714 - Cánh hoa cúc vàng 0,064 0,1 + Cánh hoa điệp 0,3 0,81 0,16 Cánh hoa hồng tiểu muội - 0,14 0,59 Cánh hoa hồng vàng 0,28 0,33 0,67 Cánh hoa hướng dương 0,013 0,25 - 10 Cánh hoa keo tràm 0,41 0,02 - 11 Cánh hoa muồng 0,21 0,05 12 Cây cỏ xước - 0,002 - 13 Cây khỉ 0,13 0,08 - 14 Cây lô hội - 0,09 - 15 Cây râu mèo 0,82 0,19 - 0,095 0,42 - 0,315 0,049 0,012 0,095 0,032 0,001 0,243 0,19 0,001 0,196 0,01 - 16 17 18 19 20 Trà hoa vàng Cúc Phương Trà hoa vàng nhạt Trà hoa vàng Ginbéc Trà hoa vàng Hakoda Trà hoa vàng nhiều lông 21 Trà hoa vàng Petelo 0,015 0,10 0,007 22 Củ khoai lang 0,175 0,199 0,193 23 Cùi thịt vàng gấc chín 11,4 0,8 1,8 24 Cùi thịt mướp đắng chín 4,8 0,4 0,81 25 Lá bầu 4,73 0,5 1,16 26 Lá bi đao 9,4 0,28 1,8 27 Lá bí ngơ 0,189 0,75 0,114 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 28 Lá bồ công anh - 0,075 0,003 29 Lá cải soong 0,157 0,04 - 30 Lá cỏ bợ 0,35 0,97 - 31 Lá đinh lăng 1,37 0,42 0,51 32 Lá đỗ tương - 0,8 - 33 Lá đu đủ 0,14 - 0,37 34 Lá dưa chuột 0,066 0,014 0,073 35 Lá gấc 15 0,63 8.9 36 Lá hành 0,22 0,004 - 37 Lá khoai lang 0,459 0,001 - 38 Lá mã đề 1,5 0,38 0,003 39 Lá mùi tàu 0,397 0,004 - 40 Lá mướp đắng 0,58 0,35 0,13 41 Lá mướp thường 0,31 0,21 - 42 Lá ngải cứu 0,67 0,56 - 43 Lá rau dệu 6,9 0,55 - 44 Lá rau má 2,32 0,7 - 45 Lá rau ngổ 0,029 0,093 - 46 Lá rau ngót 12 1,86 - 47 Lá rau sam 0,56 0,91 - 48 Lá su su 0,54 0,16 - 49 Lá tía tô 0,63 1,45 3,02 50 Lá trầu không 0,68 0,93 - 51 Màng hạt gấc chín 22 0,48 16 52 Màng hạt mướp đắng chín 9,2 0,1 10,3 53 Nhị sen trắng - 0,24 - 54 Rau cần tây 0,63 0,95 - 55 Rau đay 0,55 0,84 - 56 Rau dền cơm 1,52 1,23 - 57 Rau dền gai 1,59 1,23 - 58 Rau dền tía 1,88 1,36 + 59 Rau diếp cá 0,81 0,97 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 60 Rau húng 0,92 0,017 - 61 Sâm đại hành - 0,066 - 62 Thịt bí đỏ 2,2 1,37 9,69 63 Thịt đu đủ chín 2,2 0,75 64 Thịt múi mít - 0,93 - 65 Thịt ớt vàng 0,73 - 2,3 66 Thịt bàng 0,12 0,368 0,458 67 Thịt cà chua 0,46 0,093 45 68 Thịt hồng trứng 1,903 0,1 6,7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Các bảng số liệu luận án Bảng 3.1 Ảnh hưởng chế phẩm -carotene lên hoạt độ catalase máu người Nồng độ Nhóm máu A Nhóm máu B Nhóm máu AB Nhóm máu carotene ±SD Hoạt ±SD ±SD Hoạt Hoạt ±SD Hoạt (ml) độ (%) (ml) độ (%) (ml) độ (%) (ml) độ (%) 1,60,2* 100 1,50,1** 100 1,50,1** 100 1,50,4* 100 2,10,3* 76,2 2,10,4* 71,4 2,40,2* 62,5 2,30,2* 65,2 2,50,1** 65 2,70,3* 55,5 2,80,3* 53,5 2,60,3* 57,7 2,80,2* 57,1 2,80,2* 53,5 30,3* 50 2,90,1** 51,7 3,00,3* 53,3 30,1** 50 3,40,1** 44,1 30,4* 50 10 3,20,3* 50 3,30,2* 45,5 3,50,3* 42,8 3,30,3* 45,5 15 60,2* 26,7 5,80,2* 25,8 6,10,4* 24,9 5,60,2* 26,8 20 70,1** 22,9 7,10,3* 21,1 7,80,2* 19,2 7,40,1** 20,1 30 8,30,2* 19,3 8,20,3* 18,3 80,1** 18,7 7,60,2* 19,7 40 9,10,4* 17,6 9,90,1** 15,1 100,1** 15 9,70,3* 15,5 (mg%) : Thể tích KMnO4 trung bình dùng để chuẩn độ (ml) SD : độ lệch chuẩn * p