chiết xuất, phân lập một số chất từ thân cây dây cóc (tinospora crispa (l ) miers)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN PHƯỚC THÀNH CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT TỪ THÂN CÂY DÂY CÓC (Tinospora crispa (L.) Miers) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2020 BỘ Y TẾ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN PHƯỚC THÀNH CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT TỪ THÂN CÂY DÂY CÓC (Tinospora crispa (L.) Miers) Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn: PGS TS Vĩnh Định TS Hà Minh Hiển Thành phố Hồ Chí Minh – 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Nguyễn Phước Thành ii Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2018 – 2020 Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất – Mã số:8720210 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT TỪ THÂN CÂY DÂY CÓC (Tinospora crispa (L.) Miers) Nguyễn Phước Thành Người hướng dẫn: PGS.TS Vĩnh Định, TS Hà Minh Hiển Từ khóa: Tinospora crispa, Dây cóc, chiết xuất, phân lập, tinh khiết hóa, cấu trúc Mở đầu: Tinospora crispa (Dây cóc) loại dây leo, tìm thấy khu rừng mưa nhiệt đới châu Á, điển hình Việt Nam mọc nhiều tỉnh miền núi phía Bắc Theo y học dân tộc Việt Nam, Dây cóc đưa vào thuốc chữa sốt rét, dùng đắp sắc lấy nước rửa vết loét, điều trị bệnh tiểu đường, tăng huyết áp, thấp khớp, Các nghiên cứu hóa thực vật dây cóc cho thấy diện alkaloid, flavonoid, flavon glycosid, triterpen, diterpen glycosid, furanoditerpenoid khung clerodan, lacton, sterol, lignan Hiện nay, giới có nhiều cơng trình nghiên cứu tác dụng sinh học phân lập hợp chất từ dây cóc Tuy nhiên, Việt Nam số lượng cơng trình nghiên cứu chưa nhiều Vì vậy, đề tài thực với mục tiêu chiết xuất, phân lập số chất từ thân Dây cóc xác định cấu trúc hợp chất phân lập Đối tượng & Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Thân Dây cóc Phương pháp nghiên cứu: Định danh dược liệu phương pháp giải trình tự ADN Khảo sát sơ thành phần hóa học Chiết xuất phân lập tinh khiết hóa hợp chất Xác định cấu trúc hợp chất phân lập Kết quả: Trình tự đoạn ADN so sánh với liệu trình tự ADN Tinospora crispa công bố trực tuyến BLAST SEARCH, kết cho thấy trùng khớp 99% Thân Dây có có chứa hợp chất nhóm Triterpen, Alkaloid, Chất khử Resin Từ khoảng 2,8 kg bột thân Dây cóc, chiết xuất 122,8651 g cao ethanol Từ cao thô ethanol phân tách thành phân đoạn: 27,7858 g cao n-Hexan, 9,0434 g cao Dicloromethan, 18,4596 g cao Ethyl acetat Phân đoạn nHexan phân tách thành hai phân đoạn có độ phân cực khác phân đoạn Cloroform (19,8962 g) phân đoạn Acetonitril (4,9126 g) Từ phân đoạn Cloroform, phân lập 05 hợp chất Ha (0,0895 g), Hb (0,5402 g), Hc (0,8351 g), Hd (0,0618 g), He (0,0894 g) Từ phân đoạn Acetonitril, phân lập 01 hợp chất Hf (0,0273 g) Xác định cấu trúc hợp chất Ha Cycloeucalenon (C30H48O), Hb Cycloeucalenyl dodecanoat (C42H72O2), He cấu trúc sơ tổ hợp đồng phân (Z) N-formylnornuciferin đồng phân (E) N-formylnornuciferin (C38H38N2O6) Kết luận: Đã chiết xuất, phân lập, tinh khiết hóa xác định cấu trúc hợp chất Ha Cycloeucalenon (C30H48O), Hb Cycloeucalenyl dodecanoat (C42H72O2), He cấu trúc sơ tổ hợp đồng phân (Z) N-formylnornuciferin đồng phân (E) N-formylnornuciferin (C38H38N2O6) iii Master’s Thesis – Academic course: 2018 - 2020 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code:8720210 EXTRACTION AND ISOLATION CONSTITUENTS OF THE STEMS OF Tinospora crispa (L.) Miers Nguyen Phuoc Thanh Supervisor: Assoc Prof Dr Vinh Dinh, Dr Ha Minh Hien Keywords: Tinospora crispa, extraction, isolation, purification, structure Introduction: Tinospora crispa is a type of vine, found in tropical rainforests of Asia, typically in Vietnam, and grows in the northern mountainous provinces According to Vietnamese traditional medicine, Tinospora crispa are included in all kinds of medicines to treat malaria, use topical or decoction to wash the sores, treat diabetes, hypertension, rheumatism, Phytochemistry studies showed the presence of alkaloids, flavonoids, flavone glycosides, triterpenes, diterpene glycosides, furanoditerpenoids clerodane, lactones, sterols, lignans Currently, the world has many studies on the biological effects and isolation of compounds from Tinospora crispa However, in Vietnam, the number of studies mentioned above is limited Therefore, this study was conducted with the purposes of extracting, isolating constituents from the stems of Tinospora crispa and determining the structure of the isolated compounds Materials and methods Objective:The stems of Tinospora crispa Methods: Identification of medicinal herbs by DNA sequencing method Preliminary investigation of chemical composition Extraction, isolation and purification of compounds Determination the structure of isolated compounds Results: The DNA sequence was compared with the DNA sequence data of Tinospora crispa published online on BLAST SEARCH, the results showed a 99% match The Stems of Tinospora crispa contain compounds of Triterpenes, Alkaloids, Reducing Agents and Resins From about 2,8 kg of stem powder, 122,8651 g of crude ethanol was extracted From crude ethanol separated into fractions: 27,7858 g of n-Hexane fraction, 9,0434 g of Dichloromethane fraction, 18,4596 g of Ethyl acetate The n-Hexane fraction was divided into two fractions with different polarization, the Cloroform fraction (19,8962 g) and the Acetonitril fraction (4,9126 g) From cloroform fraction, 05 compounds Ha (0,0895 g), Hb (0,5402 g), Hc (0,8351 g), Hd (0,0618 g), He (0,0894 g) were isolated From Acetonitril fraction, 01 compound Hf (0.0273 g) was isolated Determination of the compound structure of Ha is Cycloeucalenon (C30H48O), Hb Cycloeucalenyl dodecanoat (C42H72O2), He preliminary structure is combination of isomer (Z) N-formylnornuciferin and isomer (E) N-formylnornuciferin (C38H38N2O6) Conclusion: Extracted, isolated, purified and determined the structure of compounds Ha Cycloeucalenon (C30H48O), Hb Cycloeucalenyl dodecanoat (C42H72O2), The preliminary structure of He is a combination of isomer (Z) N-formylnornuciferin and isomer (E) N-formylnornuciferin (C38H38N2O6) iv MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 Tổng quan thực vật học 1.2 Thành phần hóa học số lồi chi Tinospora 1.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học Tinospora crispa 10 1.4 Các nghiên cứu Tinospora crispa Việt Nam 18 1.5 Định danh dược liệu phương pháp sinh học phân tử 20 1.6 Tổng quan phân đoạn nghiên cứu 21 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu .26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Định danh dược liệu 32 3.2 Khảo sát sơ thành phần hóa học 32 3.3 Chiết xuất, phân lập tinh khiết hóa hợp chất 35 3.4 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập .51 CHƯƠNG BÀN LUẬN 60 4.1 Định danh dược liệu 60 4.2 Khảo sát sơ thành phần hóa học 60 4.3 Chiết xuất, phân lập tinh khiết hóa hợp chất 60 4.4 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập .62 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic ATR Attenuated total reflection CD3OD Methanol deuteri hóa CDCl3 Cloroform deuteri hóa Cf Cloroform CH2Cl2 Dicloromethan 13 Carbon-13 C-NMR nuclear Phản xạ suy giảm toàn phần magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân resonance carbon 13 COSY Correlation Spectroscopy Phổ tương quan CTPT Công thức phân tử d doublet Đỉnh đôi dd doublet of doublets Đỉnh đôi kép ddd doublet of doublets of doublets Đỉnh đôi ba lần DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DU Degree of unsaturation Độ bất bảo hoà ESI-MS Electrospray Ionization-Mass Phổ khối lượng ion hóa phun mù Spectrometry điện EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence H-NMR Proton nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton HPLC High Performance Chromatography Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao vi HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence HRESI- High TOFMS Ionization-Time Electrospray Phổ kh ối lươ ̣ng thời gian bay Resolution Of Flight - Mass ion hóa phun mù điện phân giải Spectrometry cao IR Infrared Hồng ngoại IT-TOF Ion Trap-Time of Flight Bộ phận phát bẫy ion kết hợp thời gian bay J J-coupling kl/kl Khối lượng/khối lượng kl/tt Khối lượng/thể tích m multiplet MeOH Methanol MS Mass spectrometry Phổ khối lượng NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân PDA Photodiode Array Detector Đầu dò dãy diod quang q quartet Đỉnh bốn qd quartet of doublets Đỉnh đôi bốn lần Rf Relative to front Hệ số di chuyển s singlet Đỉnh đơn t triplet Đỉnh ba TT Thuốc thử UV-Vis Ultraviolet-Visible VLC Sắc ký lỏng chân không (Vacuum Liquid Chromatography) Hằng số ghép Đỉnh đa Tử ngoại khả kiến vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Vị trí phân loại Dây cóc hệ thống thực vật Bảng 1.2 Các hợp chất phân lập từ chi Tinospora (trên giới) Bảng 1.3 Các nghiên cứu tác dụng dược lý Tinospora crispa (trên giới) 11 Bảng 1.4 Các nghiên cứu Tinospora crispa chi Tinospora (tại Việt Nam) 19 Bảng 1.5 Phân đoạn phân lập hợp chất Akaloid 21 Bảng 1.6 Phân đoạn phân lập hợp chất Diterpenoid Diterpen glycosid 23 Bảng 1.7 Phân đoạn phân lập hợp chất Triterpen 25 Bảng 1.8 Phân đoạn phân lập hợp chất nhóm Flavonoid 25 Bảng 2.1 Dung môi dùng nghiên cứu .26 Bảng 2.2 Trang thiết bị dùng nghiên cứu .27 Bảng 3.1 Kết định tính chung khảo sát sơ thành phần hóa học 32 Bảng 3.2 Kết khảo sát sơ thành phần hóa học 33 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR hợp chất Ha (CDCl3, 400 MHz) so sánh với Cycloeucalenon (CDCl3) 51 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR hợp chất Hb (CDCl3, 400 MHz) so sánh với Cycloeucalenol (CD3OD) 53 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR hợp chất He (CDCl3, 400 MHz) so sánh với Nformylnornuciferin đồng phân dạng Z E (CDCl3) .56 Bảng 4.1 Các đỉnh đặc trưng phổ IR hợp chất Ha 62 Bảng 4.2 Các đỉnh đặc trưng phổ IR hợp chất Hb 62 Bảng 4.3 Các đỉnh đặc trưng phổ IR hợp chất He 63 viii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Dây cóc - Tinospora crispa (L.) Miers .2 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học hợp chất Alkaloid phân lập từ Tinospora crispa Hình 1.3 Cấu trúc hóa học hợp chất Diterpen Diterpen glycosid phân lập từ Tinospora crispa Hình 1.4 Cấu trúc hóa học hợp chất Triterpen phân lập từ Tinospora crispa 10 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học hợp chất Flavonoid phân lập từ Tinospora crispa 10 Hình 3.1 Kết giải trình tự ADN Tinospora crispa 32 Hình 3.2 Sắc ký lớp mỏng hợp kiểm tra Ha 39 Hình 3.3 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra tinh khiết Ha 40 Hình 3.4 Sắc ký lớp mỏng hợp kiểm tra Hb 41 Hình 3.5 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra tinh khiết Hb 42 Hình 3.6 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra tinh khiết Hc 44 Hình 3.7 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra tinh khiết Hd 45 Hình 3.8 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra tinh khiết He 47 Hình 3.9 Sắc ký lớp mỏng kiểm tra tinh khiết Hf 49 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học hợp chất Ha 52 Hình 3.11 Cấu trúc hóa học hợp chất Hb 55 Hình 3.12 Cấu tạo đồng phân (Z) (trái) (E) (phải) N-formylnornuciferin 58 Hình 4.1 Cấu trúc phân mảnh lần hợp chất He 64 Sơ đồ 2.1 Quy trình chuẩn bị dịch chiết khảo sát thành phần hóa học 28 Sơ đồ 2.2 Định hướng quy trình nghiên cứu phân lập hợp chất từ Tinospora crispa 30 Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết xuất phân đoạn 36 Sơ đồ 3.2 Quy trình xử lý cao n-Hexan 37 Sơ đồ 3.3 Quy trình phân lập hợp chất từ phân đoạn Cloroform 38 Sơ đồ 3.4 Quy trình phân lập hợp chất Ha từ phân đoạn Cloroform .39 Sơ đồ 3.5 Quy trình phân lập hợp chất Hb từ phân đoạn Cloroform .41 Sơ đồ 3.6 Quy trình phân lập hợp chất Hc từ phân đoạn Cloroform .43 PL - 88 PL - 89 Phụ lục 5.9 Phổ HMBC hợp chất He PL - 90 Phụ lục 5.9a Phổ HMBC giãn rộng hợp chất He PL - 91 PL - 92 PL - 93 Phụ lục 5.10 Phổ HSQC hợp chất He PL - 94 Phụ lục 5.10a Phổ HSQC giãn rộng hợp chất He PL - 95 PL - 96 PL - 97 PHỤ LỤC PHỔ IR VÀ MS CỦA HỢP CHẤT Hc Phụ lục 6.1 Phổ IR hợp chất Hc PL - 98 Phụ lục 6.2 Phổ MS hợp chất Hc PL - 99 PHỤ LỤC PHỔ IR VÀ MS CỦA HỢP CHẤT Hd Phụ lục 7.1 Phổ IR hợp chất Hd PL - 100 Phụ lục 7.2 Phổ MS hợp chất Hd PL - 101 PHỤ LỤC PHỔ IR VÀ MS CỦA HỢP CHẤT Hf Phụ lục 8.1 Phổ IR hợp chất Hf PL - 102 Phụ lục 8.2 Phổ MS hợp chất Hf ... PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT TỪ THÂN CÂY DÂY CÓC (Tinospora crispa (L. ) Miers) Nguyễn Phước Thành Người hướng dẫn: PGS.TS Vĩnh Định, TS Hà Minh Hiển Từ khóa: Tinospora crispa, Dây cóc, chiết xuất, phân lập, ... lập số chất từ thân Dây cóc (Tinospora crispa (L. ) Miers)" thực với hai mục tiêu sau: ( 1) Chiết xuất phân lập số chất từ thân Dây cóc; ( 2) Xác định cấu trúc hợp chất phân lập; CHƯƠNG TỔNG QUAN... PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN PHƯỚC THÀNH CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT TỪ THÂN CÂY DÂY CÓC (Tinospora crispa (L. ) Miers) Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC