Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm men moniliella có khả năng sinh tổng hợp đường erythritol

Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mờ Hà Nội LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập nghiên cứu Trung tâm Hóa sinh cơng nghiệp Môi trường, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ, động viên cùa thầy cô, gia đình bạn bè Lời tơi xin bày tớ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Minh Khanh, người tận tình hướng dan tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành đê tài Viện Công nghiệp thực phẩm Tôi xin gửi lời căm cm chân thành tới tập thê cán Trung tâm Hóa sinh cơng nghiệp Mơi trường, Viện cơng nghiệp thực phẩm ln nhiệt tình giúp đỡ, tạo điêu kiện đê tơi hồn thành tot cơng việc Tơi xin bày tó lịng biết ơn tới Ban Giám hiệu Viện Đại học Mờ Hà Nội, Ban Chú nhiệm khoa Công nghệ sinh học thầy cô giáo Bộ mơn động viên chì dẫn, đóng góp ý kiến tạo điều kiện thuận lọi đế tơi hồn thành luận văn Cuối xin dành lời căm ơn chân thành tới gia đình, người thân, bạn bè ln động viên khích lệ tơi đường học tập, làm quen với công tác nghiên cứu khoa /ỉJ4nr viện Viện Đại học Mở Hà Nội Hà Nội, Ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên Bùi Thị Thương ■S'V: Bùi Thị Thương K18-LỚP ll.03-KS.CNSH Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mờ Hà Nội MỤC LỤC MỚ ĐẦU PHẦN I TÔNG QUAN 1.1 Nấm men đen Moniliella 1.1.1 Giới thiệu chung nấm men đen Moniliella 1.1.2 Lịch sử tìm kiếm phân loại 1.1.3 Đặc điêm hình thái sinh sản cúa Moniliella 1.1.4 Uu điếm ứng nấm men đen Moniliellatrong sân xuấtErythritol .7 1.2 Sự ảnh hường yếu tố dinh dưỡng nhữngyếutốkhác cùa môi trường đến trình phát triển cũa nấm men đen Moniliella 1.2.1 Nguồn dinh dưỡng cacbon 1.2.2 Nguồn dinh dường nitơ 1.2.3 Nguồn khoáng chat[6] 1.2.4 Nguồn vitamin 10 1.2.5 Ánh hưởng cúa nhiệt độ 10 1.2.6 Anh hương cua pH 1.2.7 Thời gian lên men 1.2.8 Nồng độ đường 12 1.2.9 Cường độ khơng khí lắc trộn .12 1.3 Tntr viện Viện Đại hộc Mở ỉ lả Nội Đường chức Erythritol 13 1.3.1 Giới thiệu chung 13 1.3.2 Cấu tạo tính chất 13 1.3.3 ứng dụng 16 1.4 Quá trình nấm men Moniliella biến đồi dường Glucose thành Erythrytol.17 1.4.1 Sự khác biệt trình tích lũy đường Erythrytol cùa vi khuân nấm men 17 1.4.2 Con đường Pentose photphate chúng nấm men chịu áp suất thầm thấu cao 19 PHÀN II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.2 Các môi trường giữ giống, nuôi cay 22 2.3 Các hóa chat cần thiết 23 ■S'V: Bùi Thị Thương KI8-LỚP 1Ỉ.03-KS.CNSH Viện Đại học Mờ Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học 2.4 Các thiết bị q trình tiến hành thí nghiệm 23 2.5 Phương pháp nghiên cứu 23 2.5.1 Phương pháp giữ giống 23 2.5.2 Phương pháp xác định khà lên men loại đường 24 2.5.3 Phương pháp kiểm tra ãnh hưởng cùa pH 24 2.5.4 Phương pháp kiểm tra ảnh hưởng nhiệt độ tới khả lên men.24 2.5.5 Phương pháp hấp phụ than hoạt tính bột trợ lọc 25 2.5.6 Xác định khả sinh trưởng phát triển vi sinh vật phương pháp đo độ hấp thụ quang (OD) 26 2.5.7 Xác định đường bàng phương pháp Graxianop ( Kali ferixianua) 27 2.5.8 Phương pháp sắc kí lớp mỏng TLC 28 I Một sổ đặc tính hình thái chùng nấm men Moniliella từ sưu tập giống Viện Công nghiệp thực phẩm 31 3.2 Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men phù hợp với phát triển nam men đen Moniliella 32 3.3 Đánh giá khà tích lũy đường Erythritol chủng nấm men Wo",7/e//atừb^f^iệiTViện"ĐạrlTỌC"MưiíàNợi 33 3.4 Nghiên cứu ánh hường cùa yêu tô dinh dưỡng 35 3.4.1 Ánh hường nguồn cacbon 35 3.4.2 Ánh hường nồng độ đường Glucose 36 3.4.3 Ảnh hường cùa tỉ lệ giống 38 3.4.4 Ánh hưởng nồng độ yeast extract 39 3.4.5 Ảnh hường muối vô 40 3.4.6 Ảnh hường cùa loại vitamin 42 3.5 Ành hường cùa yếu tố môi trường khác 42 3.5.1 Ảnh hường cùa nhiệt độ tới khả thu dịch lên men .42 3.5.2 Ảnh hường pH tới trình lên men 44 3.5.3 Ánh hưởng cùa thời gian lên men 45 3.5.4 Ảnh hường cùa điều kiện lắc 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 SV: Bùi Thị Thương KI8-LỞP ì 1.03-KS.CNSH Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mờ Hà Nội DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chùng nấm men đen Monilỉella phân lập trung tâm vi sinh - Viện Công nghiệp thực phẩm năm 2010 111 .Error! Bookmark not defined Bảng 1.2 Bảng hàm lượng chất khoáng cần cho nấm men.Error! Bookmark not defined Báng 2.1 Một số chúng nấm men Monlilella từ sưu tập giống cùa Viện Công nghiệp Thực phẩm Error! Bookmark not defined Bảng 3.1 Kct quà đo OD (bước sóng 610nm) số chúng nam men đen Moniliella lên men môi trường GYU 20 YM bô sung 20% Glucose.Error! Bookmai Bảng 3.2 Kết kiềm tra thông số chủng nấm men Moniliclla sau ngày lên men môi trường GYU 20 Error! Bookmark not defined Bàng 3.3 Ket quà kiem tra thông so liên quan số chúng nấm men sau ngày nuôi cấy nguồn cacbon khác Error! Bookmark not defined Bảng 3.4 Kết kiếm tra thông số liên quan cùa chùng nấm men đen Monilìella nồng độ đường Glucose khác nhau.Error! Bookmark not defined Bảng 3.5 Ket đo OD (bước sóng 610nm) chúng nấm men đen Moniliella tỉ lệ giống Bookmark not defined Bảng 3.6 Ket quà kiếm tra thông số liên quan chúng nấm men đen Moniliella nồng độ yeast extract khác .Error! Bookmark not defined Bang 3.7 Ket quà thông so liên quan cùa chung nam men đen môi trường GYU 20 có bồ sung I số loại muối khống khác nhau.Error! Bookmark not defined Bảng 3.8 Ket kiếm tra thông số liên quan chúng nam men đen Moniliella điều kiện lên men có bố sung loại vitamin khác nhau.Error! Bookmark r Bảng 3.9 Kêt quà kiêm tra thông sô liên quan chúng nâm men đen Moniliella điều kiện nhiệt độ lên men khác nhau.Error! Bookmark not defined Bảng 3.10 Ket kiếm tra thông số liên quan cũa chùng nấm men đen Moniliella giá trị pH khác Error! Bookmark not defined Bảng 3.11 Kết kiềm tra thông số liên quan chùng nấm men đen Moniliella điều kiện lac khác Error! Bookmark not defined SV: Bùi Thị Thương KI8-LỚP 1Ỉ.03-KS.CNSH Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại học Mờ Hà Nội DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ãnh khuẩn lạc nấm men Moniliella suavedens var suavedens nuôi đĩa thạch Error! Bookmark not defined Hình 1.2 Hình ảnh bào tử nấm men Moniliela quan sát kính hiến vi.Error! Bookmark not del Hình 1.3 Hình ánh sinh sản chồi nam men đen[3J.Error! Bookmark not defined Hình 1.4 Anh hường cùa nhiệt độ tốc độ sinh trưởng vi sinh vật (Theo sách cùa Prescott Harley Klein) Error! Bookmark not defined Hình 1.5 Tốc độ sinh trướng cúa nam men phụ thuộc vào thời gian lên men.Error! Bookmarl Hình 1.6 Hình ánh tinh thể đường Erythritol Error! Bookmark not defined Hình 1.7 Dộ lay Sucrose làm chuẩn Error! Bookmark not defined Hình 1.8 Quá trình sinh tổng hợp erythritol vi khuẩn nấm men [20].Error! Bookmark IK Hình 1.9 Sự tạo thành Erythritol sàn phẩm khác bang đường Pentose phosphate! 19] 20 Hình 2.1 Máy dộ hấp thụ quang loại ống Error! Bookmark not defined Hình 2.2 Hình ánh chạy sác kí bán móng TLC [ 17].Error! Bookmark not defined Hình 3.1 Hình anh chung nấm men Moniliella TBY 2038.1 dược lưu trử ngắn hạn ni cấy đìa thạch Error! Bookmark not defined Hình 3.2 Hình ảnh tế bào số chủng nấm men đen Moniìiella soi kính hiền vi độ phóng đại 40X Error! Bookmark not defined Hình 3.3 Bán phân tích TLC săn phẩm dịch lên men chúng nấm men Moniliella sau ngày Error! Bookmark not defined Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn tốc độ sinh trường phụ thuộc vào nguồn cacbon.Error! Bookmarl Hình 3.5 Biểu đồ tốc dộ sinh trường phụ thuộc vào nồng độ dường Glucose Error! Bookmark not defined Hình 3.6 Đo thị biểu diễn tốc độ sinh trường phụ thuộc vào li lệ giống.Error! Bookmark not Hình 3.7 Đồ thị biếu diễn tốc độ sinh trường phụ thuộc vào nồng độ yeast extract Error! Bookmark not defined Hình 3.8 Bicu tốc độ sinh trường phụ thuộc vào nhiệt độ.Error! Bookmark not d' Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn tốc độ sinh trường phụ thuộc vào pH.Error! Bookmark not define! Hình 3.10 Biếu đồ thê tốc độ sinh trường phụ thuộc vào thời gian lên men.Error! Bookir S'V: Bùi Thị Thương KI8-LỚP 1Ỉ.03-KS.CNSH MỞ ĐÀU Ngày nay, với phát triển không ngừng khoa học - công nghệ, đời sống người ngày nâng cao, moi quan hệ thực phẩm sức khóe ngày quan tâm Yêu cầu cùa người tiêu dùng thực phẩm có nhiều thay đối Neu lúc trước đặt vấn đề hàng đầu hàm lượng dinh dư&ng cao, khả cung cấp nhiều lượng yêu cầu với thực phàm có nhiều thay đối thay đối đa dạng nhóm đối tượng đa dạng nhu cầu chức với nhóm thực phẩm Đã có nhiều người chuyền hướng tìm cho loại thực phàm khơng có có dinh dường, loại thực phẩm thấp lượng Một số khác lại có nhu cầu sứ dụng thực phám đế phịng chữa bệnh Thực phấm chức đời từ Thực phẩm chức định nghĩa loại thực phẩm có chứa hoạt tính sinh học có khả phịng chống bệnh tật, tăng cường sức khỏe dựa sở cua trình dinh dưỡng Đường chức phận quan trọng nhóm thực phẩm chức nàng, dược tập trung nghiên cứu nhiều trọng năm gần dây có nhiêu đặc tính có lợi cho sức khóe như: chống béo phì, tiếu đường, sâu răng, kích thích tiêu hóa Trong dó Erythritol dược nhà nghiên cứu ý cà săn xuất phương pháp lên men từ vi sinh vật, sản phấm có nhiều đặc tính ưu việt, có hương vị thơm ngon cùa đường kính saccarose, mát, lại có nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khóe đặc biệt thấp lượng loại đường khác [10], Đường Erythritol có thê tích lũy bới nhiều nhóm vi sinh vật khác thực vật, vi khuấn, nam men Với đặc tính phù hợp sinh sản nhanh diều kiện hiếu khí, vi hiếu khí, phát triền dạng đơn bào mơi trường lịng, kích thước lớn, thuận lợi cho công nghệ thu hồi sán phẩm nấm men đen Moniliella đối tượng ý khai thác q trình sản xuất đường Erythritol Trong lên men yếu tố định đến hiệu suất cùa cà q trình tối ưu hóa kiện len men làm tăng khả sinh trưởng nam men nhiệm vụ quan trọng hàng đau Xuất phát từ thực tể trên, đề tài tốt SV; Bùi Thị Thương K18-LỚP Ỉ1.03-KS.CNSH nghiệp với tên gọi "Nghiên cún điền kiện sinh trưởng phát triển chủng nấm men Moniliella có sinh tống hợp đường Erythritol ” đời Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội SV; Bùi Thị Thưong K18-LỚP Ỉ1.03-KS.CNSH PHẦN I TỎNG QUAN Nấm men đen Moniliella 1.1 1.1.1 Giói thiệu chung nấm men đen Moniliella Con người biết đến nấm men đen vào khoáng cuối the ki XIX Là nhóm phân loại khơng đồng nhất, thành tế bào có melanine sinh sản bàng phương thức nảy chồi Tuy nhiên, nấm men đen loại nấm khó đề nhận dạng Vì hiểu biết chúng cịn chưa hồn chình Nấm men đen Moniliella chi rát đặc biệt mặt phân loại tiến hóa giới nấm có ý nghĩa quan trọng mặt kinh tế Moniliella nhóm đối tượng đặc biệt quan tâm hiệu suất chuyến hóa đường đế tạo Erythritol tương đối cao, nhóm vi sinh vật có nhiều đặc điềm có lợi sứ dụng quy mô công nghiệp Nồi bật chi Moniỉiella loài Moniliella pollinis, sừ dụng nhiều nước the giới Mỹ, Đức, Nga đế sàn xuất Erythritol quy mô công nghiệp Chi Moniliella lần miêu tã năm 1996 với loài M.acetoahutens M.tomentosa (Stolk Dakin, 1996) [2] Lịch su tìm kiếm phân loại Đ;1| học Mơ Hà Nộị 1.1.2 Chi Moniliella lan miêu tả năm 1966 với hai loài M.acetoabutens M.tomentosa (Stolk & Dakin, 1966) Tiếp theo hai loài M.suaveolens M.mellis, miêu tả von Arx(1972) Rao & de Hoog(1975) Sau tố hợp Moniliella pollinis đề nghị cho M.tomentosa var pollinis dựa khác biệt đáng kẻ thành phan G+C (Dc Hoog & Gueho, 1984).Năm 2009, Rosa cộng cho Moniliella Trichosporonoides (Haskins & Spencer, 1967) có the xếp vào chi bôn tô hợp loài M.megachiliensis, M.nigrescens, M oedocephalis, M.spathulata loài M.fonsecae đề nghị (Rosa et al, 2009).Gần đây, ba lồi cơng bố M.carnis, M.dehoogii (Thanh et al, 2012) M.byzovii (Thanh et al,2013).TỚi chi Moniliella chứa 12 loài sau: - Moniliella acetoabutens Stolk & Dakin - Moniliella byzovii Thanh.Hien & Thom - Moniliella camis Thanh, Hai, Hien, Takashima & Lachance - Moniliella dehoogii Thanh, Hai Hien, Takashima & Lachance SV; Bùi Thị Thương KlS-Lớp Ỉ1.03-KS.CNSH - Moniliella fonsecae Rosa, Nakase, Jindamorakot, Limtong, Lachance, FidalgoJimenz, Daniel, Pagnocca, Inacio & Morais - MoniHella megachiliensis (Inglis & Sigler) Rosa & Lachance - Moniliella mellis Rao & dehoog - Moniliella nigrescens (Hocking & Pitt) Rosa & Lachance - Moniliella oedocephalis (Haskins & Spencer) Rosa & Lachance - Moniliella pollinis De Hoog & Gueho - Moniliella spathulata (de Hoog) Rosa & Lachance - Moniliella suaveolens von Arx Moniliella bao gồm nhiều lồi với hình dáng kích thước đa dạng Vì vậy, trình phân loại thường gặp khó khăn Trong năm gần nhóm nghiên cứu cùa môn vi sinh Viện công nghệ thưc phẩm nghiên cứu phân lập nấm men từ hoa, ong, thực phẩm dụng cụ chế biến thực phẩm Trong nhiệm vụ nhóm tác giã kiếm tra khà sinh polyol, đặc biệt Erythritol cúa chung thu thập được[2],[3],[ 18] Bảng 1.1 Một số chiíng nấm men den Moniliella dã đưọx* phân lập trung tâm vi sinh - Viện Công nghiệp thực phẩm năm 2010 [ ] STT Kí hiệu mẫu Địa điểm thu thập TBY211-2 Chợ Trường Yên Ninh Bình TBY 325 Mồ Lao, Hà Đông TBY 217 Chợ Trường Yên, Ninh Bình TBY 372 Viện CNSH XTY 108 Trường Yên, Ninh Bình TBY121 Viện công nghiệp thực phấm TBY30-1 Cù lao Chàm Quáng Nam TBY 368-2 Chợ Giếng Vuông, Lạng Sơn TBY342 Chợ Giếng Vuông Lạng Sơn 10 TBY 78 Trường Yên, Ninh Bình 11 TBY 76 Trường Yên, Ninh Bình 12 TBY 83 Trường Yên, Ninh Bình SV; Bùi Thị Thương K18-LỚP I I.03-KS.CNSH 13 TBY38-8 Trường Yên, Ninh Bình 14 TBY388-3 Chợ n Phúc, Hà Đơng 15 TBY 367 Chợ Giếng Vuông, Lạng Sơn 16 TBY 384-2 Chợ Vạn Phúc, Hà Đông 17 TBY 385-3 ChợVạn Phúc, Hà Đông 18 TBY370-1 Chợ Giếng Vuông, Lạng Sơn 19 TBY202-2 Chợ Đông Kinh, Lạng Sơn 20 TBY 201-2 Trường Yên, Ninh Bình 21 TBY 388-2 Trường Yên, Ninh Bình 22 TBY 368-1 Chợ Trường Yên, Ninh Bình 23 TBY 365-2 Chợ Giếng Vuông, Lạng Sơn 24 TBY 38-4 Chợ Vạn Phúc, Hà Đơng 25 TBY237-I Trường n, Ninh Bình 1.1.3 Đặc điểm hình thái sinh sản ciía Moniliella Moniliella nấm men đẹn có khuấn lạc hình trịn hầu hết cịn non có ; ' T DU' Viện/Tiện trại nọc M ợ H ậ/Nội màu trăng già chuyên sáng màu xám đen đen oliu có thè màu xám hay xanh xám Te bào có hình elip trụ, có lồ vách Khn ty phân nhánh, đường kính 2-6pm, đứt găy nhiều tạo thành đoạn ngán[ 16] Hình 1.1 Hình ảnh khuấn lạc nấm men Moniliella suavedens var suavedens nuôi cấy đĩa thạch Hình 3.6 Dồ thị biểu diễn tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào ti lệ giống Thông qua bâng số liệu 3.5 nhận thấy ràng chúng TBY 2038.1 TBY 3425 phát triền tốt lên men ta cung cấp ti lệ giống 1% Nhiều hay dẫn đen việc mat cân bang nguồn dinh dưỡng lượng chúng giống l khoangthời) gian lên men Đ^u oặỵ phù hợp với nghiên cứu công bố cùa Erin Conner Cox J.Burschapcrs, 3.4.4 Ảnh hưởng nồng độ yeast extract Yeast extract nguồn dinh dưỡng phố biến cùa vi sinh vật Nó cung cấp axit amin vitamin (vitamin B Glutathione), 50-75% protein, 4-13% carbon hydrate, muoi cho nam men phát triển Tuy nhiên việc bố sung với liều lượng khác mang lại hiệu q khác có thê kích thích hay ức chế q trình sinh tống hơp, chúng tơi tiến hành tối ưu hóa nồng độ yeast extract lên men chung lựa chọn Kct thúc trình lên men ta tiến hành xác định thông số liên quan pH, OD Kết quà thể bàng 3.6 Bảng 3.6 Kết kiểm tra thông số liên quan chúng nấm men đen Moniliella ả nồng độ yeast extract khác Nồng Giá trị OD Giá trị pH độ (%) Ban đầu TBY 2038.1 TBY 3425 TBY 2038.1 TBY 3425 0.5 6.1 5.4 5.5 3.7 3.38 1.0 6.4 5.3 5.6 4.57 3.98 1.5 5.9 4.7 4.9 4.46 3.84 Biểu đồ thề tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ yeast extract Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ yeast extract Nhìn vào bâng số liệu dồ thị ta thấy nồng độ yeast extract 1% phù hợp cho phát triên cúa chúng tiêm nghiên cứu Tại điêu kiện mật độ tế bào đạt giá trị cao Khi tế bào phát triển mạnh trình trao đối chất sàn sinh chất trình lên men làm tăng nồng độ axid cùa môi trường Môi trường vi sinh vật phát triến mạnh pH giám mạnh Điều phù hợp với kết nghiên cứu cùa chúng tơi Ví dụ TBY 2038.1 mơi trường lên men có nồng độ yeast extract %, pH giảm 1.1 giá trị OD đạt 4.57 nồng độ yeast extract 0.5%, pH giảm 0.7 giá trị OĐ dạt 3.7 3.4.5 Ảnh hưởng muối vơ Muối khống ngun tố vi lượng có vai trị quan trọng q trình lên men vi sinh vật Mặc dù chi phí cho nguồn khống cho lên men vi sinh vật nhị loại muối thường rè lượng dùng lại lợi ích mà chúng mang lại lớn đặc biệt trình sinh tống hợp enzyme Theo tài liệu công bố cho thấy, loại muối như: MgSO4 KH2PO4 CaCl2 ZnSO4 NaCl hay sứ dụng Để lựa chọn loại muối can thiết thích hợp cho q trình lên men chúng tơi làm thí nghiệm xét ânh hường lừng loại muối MgSO4 KH2PO4 CaCI2 ZnSO4 đến phát triến cúa nam men đen Moniliella Ket bảng 3.7 Bảng 3.7 Ket thông số liên quan chúng nấm men đen mơi trưịng GYU 20 có bổ sung số loại muối khống khác Thành phần muối vô Giá trị pH Giá trị OD Ban TBY TBY TBY TBY đầu 2038.1 3425 2038.1 3425 MgSO4.7H2O (0,1%) 6.4 5.1 5.2 2.94 3.56 KH2PO4 (0,1%) 6.1 4.8 4.7 4.04 2.71 CaCl2 2H2O (0,1%) 6.3 vife V 5.3 5.2 s6 ỌC3\Jơ 6.4 5.5 5.3 ZnSO4.7H2O (0,1%) Không bổ sung muối 3.55 L'1 3.28 2.27 3.06 2.26 Các loại muối vô lựa chọn bồ sung vào mơi trường muối trung tính có tính axit nhẹ nên khơng làm thay đối nhiều độ pH ban đầu môi trường, pH ban đầu cùa môi trường kháo sát nam khoảng từ 5.9 đến 6.4 Sau kkhi lên men pH dịch lên men có giám nhẹ khơng đáng kể nằm khoáng từ 4,7 đến 5,6 khoáng pH phù hợp với sinh trướng phát triền cùa nấm men Moniliella theo nghiên cứu cúa Sang Yong Kim, Deok Kun Oh Bong Soo Noh, Soo Ryun Jung Ky ung Ah Kim, Nhìn vào báng số liệu ta thấy nguồn muối vô không làm ánh hường lớn tới trình phát triển cùa nấm men KH2PO4 CaCI2 2H2O muối nấm men có thề phát triển tốt nhiên chênh lệch không lớn nên việc bo sung SV; Bùi Thị Thương 41 KỈ8-LỚP 1J.03-KS.CNSH nguồn muối vô cho chủng tiềm TBY 2038.1 TBY 3425 không cần thiết 3.4.6 Ảnh hưởng loại vitamin Mỗi lồi vi sinh vật nói chung nam men nói riêng có nhu cầu nguồn vitamin khác Có loại sử dụng vitamin loại chất kích thích sinh trường, có loại lại chất kìm hãm sinh trướng Trong trình nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men cùa chùng TB Y 2038.1 TB Y 3425 bố sung số loại vitamin vào tài nghiên cứu Makoto Mtsubishi Chem đề đánh giá khả sinh trường Kết chúng tơi tóm tắt bàng 3.8 Bang 3.8 Ket kiếm tra thông số liên quan cua chủng nấm men đen Moniliella ỏ' điều kiện lên men có bổ sung loại vitamin khác Giá trị OD Các loại vitamin B| 50mg/i B2 50mg/l TBY 2038.1 TBY 3425 2.78 3,98 ện Viện ‘Oẩi học M( ■ Hà Nội 66 Biotin 20mg/l 2.64 4.14 Không bo sung vitamin 4.06 3.72 Từ bâng số liệu cho thấy, bồ sung số loại vitamin B| Bj Biotin kích thích TBY 3425 phát triền vượt bậc Cịn chúng TBY 2038.1 thích nghi với mơi trường có bơ sung nguồn vitamin Ảnh hưởng yếu tố mơi trưịng khác 3.5 3.5.1 Ánh hưởng nhiệt độ tới khả thu dịch lên men Nhiệt độ ảnh hưởng lớn tới trình lên men Mỗi vi sinh vật lại có khoảng nhiệt độ mà phát triền đạt mạnh Dựa tài liệu liên quan công bo nam men dcn thường phát triển tốt từ 28-30l,C, chúng tơi tiến hành thí nghệm kiềm tra ánh hướng cùa nhiệt độ đen chủng TBY 2038.1 TBY 2425 ngưỡng xung quanh 25°c, 28°c, 30"C, 35°c, 40°C Đánh giá sinh trường thông qua mật độ tế bào bang cách tiến SV; Bùi Thị Thương 42 KỈ8-LỚP 1J.03-KS.CNSH hành đo độ hấp thụ quang bước sóng 610nm Kết quà băng 3.9 hình 3.8 Bảng 3.9 Kết kiếm tra thông số liên quan chúng nấm men đen Moniliella điều kiện nhiệt độ lên men khác Nhiệt độ (°C) Giá trị OD TBY 2038.1 TBY 3425 25 1.77 1.54 28 3.51 3.38 30 4.33 3.36 35 2.61 2.07 40 0.87 0.96 Biểu đồ thể tốc độ sinh truỏng phụ thuộc vào nhiệt độ Tên chúng ( l.TBY 2038.1 2.TBY 3425 ) Hình 3.8 Biểu đồ tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nhiệt độ Nhìn vào bàng số liệu 3.9, ta thấy: Chùng TBY 2038.1 lên men 30°C hiệu suất đạt cao gấp 4.98 lần 40°C 2.45 lẩn 25°c, TBY 3425 lên men 30°C hiệu suất có thề đạt cao gấp 3.5 lần 40°C 2.18 lần 25°c Kết quã phàn tích cho thấy chủng lựa chọn TBY 2038.1 TBY 3425 giống nấm men khác phát triển tốt ngưỡng nhiệt từ 28-30°C Ngoài khoảng nam men chậm phát triển sinh khối giảm dần Khoảng nhiệt 3.5.2 Ánh hưỏng pH tói trình lên men Trong thực tế pH mơi trường quan trọng với trình độ hấp thụ chất dinh dưỡng cùa tế bào hoạt động hệ thống Enzyme tham gia vào tổng hợp protein, tạo vitamin Vì mồi loại vi sinh vật có sinh trường khoảng pH mơi trường thích hợp nên để lựa chọn mơi trường pH tối thích tiến hành khảo sát giá trị pH môi trường ban đầu khác từ 3-8 hai chủng lựa chọn TBY 2038.1 TBY 3425 Kết quà đánh giá thông qua mật độ tế bào bang cách kết thúc trình lên men ta đo độ hấp thụ quang bước sóng 610nm thể bàng 3.10 Giá trị pH ban đầu ta đo 6.5 Bảng 3.10 Ket kiếm tra thông số liên quan cua chủng nấm men đen Moniliella ỏ' giá trị pH khác Giá trị OD Giá trị pH pH TBY 2038.1 3.0 2.6 4.0 39 4.5 5.1 TBY 3425 TBY 2038.1 1.85 2.8 NĨA v"1C1Ịị Ipcll 111 ~ K.4Ã*9 !ỈA TBY 3425 1.51 2.28 5.4 2.89 2.4 3.02 2.52 5.0 5.1 5.5 5.5 4.1 5.4 3.78 2.49 6.0 4.2 5.3 4.26 3.37 6.5 4.9 5.0 4.33 3.36 7.0 5.4 5.4 3.1 2.63 8.0 5.3 5.5 1.86 1.32 Dựa vào bâng số liệu 3.10 tiếp tục giá trị OD thông qua dạng biểu đồ SV; Bùi Thị Thương 44 KỈ8-LỚP 1J.03-KS.CNSH Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn tốc độ sinh trưỏTig phụ thuộc vào pH Nhìn vào bảng số liệu đồ thị ta nhận thấy điều kiện pH thấp ( pH 3) cà chủng lựa chọn phát triển giá trị OD đo với chúng TBY 2038.1 chì đạt 1.85 TBY 3425 1.51 Khi pH cùa mơi trường tăng lên nấm men thích nghi tốt hơn, dền giới hạn pH đạt 6.5 Ngồi ngưỡng này, tức mơi trường kiềm trung tính q trình phát triền dần chậm lại Cũng giống loại nam men khác chủng nam men đen Moniliella TBY 2038.1 TBY 3425 phát triển tốt khoáng pH 5.5-6.5 Giá trị pH gần pH cùa môi trường ban đầu điều kiện thuận lợi giúp hạn chế khâu điều chinh pH lên men 3.5.3 Ánh huỏTig thòi gian lên men Đối với mồi loại vi sinh vật khác thời gian ni cấy có ánh hướng khác đến đường tăng sinh trướng cùa chúng Với loại vi sinh vật thu nhận sinh khối chất tiết ngoại bào canh trường việc khão sát thời gian lên men quan trọng việc thu nhận sản phâm cụ the Chính đề tài sâu kháo sát khả sinh trường cũa hai chúng nấm lựa chọn để xác định thời gian nuôi cấy phù hợp Các chúng nấm sau cấy vào môi trường dinh dường gồm 20% glucose, % cao nấm men 0,1 % urê cho lên men điều kiện nhiệt độ 30°C, lác 150 vòng/phút với khoảng thời gian khác sau ngày ngày, ngày, ngày, Canh trường sau len men mang đo OD đê xác định mật độ tế bào sinh khối thu nhận Tốc độ sinh trường chúng giống trình lên men xác định cách đo mật độ quang bước sóng 610nm Ket thu báng 3.11 hình 3.10 Bang 3.11 Kết quã kiểm tra thông số liên quan chủng nấm men đen Moniliella điều kiện thời gian lên men khác Đường glucosecịn sót Thời gian Giá trị pH Giá trị OD (%) TBY TBY TBY TBY TBY 2038.1 2425 2038.1 2425 2038.1 5.8 5.9 1.81 1.31 16.07 18.75 5.6 5.7 3.52 2.81 14.06 15.07 5.6 5.6 4.12 3.57 11.25 12.5 5.2 5.4 4.7 4.06 10.23 11.54 5.3 5.5 4.43 3.84 9.38 10.23 (ngày) TBY 2425 •A 4-R 5.4 5.6 3.41 8.82 —ft J viên 1'iên Đai )OC Mơ l|à Nôi— Từ báng số liệu thề giá trị OD dạng đồ thị 9.78 Hình 3.10 Biếu đồ thể tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào thời gian lên men Nhìn vào đồ thị kết thống kê báng ta thấy thời gian phát triền cùa chủng TBY 2038.1 TBY 2425 dài khoáng tuần Bẳt đầu sang ngày thứ sinh khối tăng dần đạt cực đại ngày thứ chu kì lên men (TBY 2038.1 giá trị OD đạt 4.7 TBY 3425 đạt 4.06) sau lại giám dần Lượng đường Glucose cịn sót thể mức dộ chuyển hóa đường Glucose q trình lên men Thời gian lên men dài lượng đường chuyền hóa lớn có nghĩa đường glucose sót lại Ket q phân tích phù hợp với thực te (được bàng 3.11 hình 3.10) 3.5.4 Ánh huỏng điều kiện lắc Trong trình lên men vi sinh vật cần nguồn dinh dưỡng lớn đe sinh trưởng Đặc biệt với nấm men đen, trình lên men hiếu khí tạo nhiều lợi the cho việc sinh tống hợp dường Chính việc lấc trộn làm cho vi sinh vật tiếp xúc môi trường dinh dưỡng tốt hơn, tăng lượng oxi hịa tan dịch mơi trường giúp nâng cao hiệu suất cùa cá trình Đe kiếm chứng chúng tơi tiến hành thí nghiệm với mơi trường lên men giống nhau, thí nghiệm lên men khơng có lắc thí nghiệm có lắc 150 vịng/phút Kết q chúng tơi thề bảng 3.12 Băng 3.12 Kết kiểm tra thông số liên quan chủng nấm men đen Moniliella điều kiện lắc khác Giá trị OD Lắc (vịng/phút) Glucose cịn sót (%) TBY 2038.1 TBY 3425 TBY 2038.1 TBY 3425 3.18 2.83 12.5 13.23 150 4.8 4.2 10.23 10.89 Thông qua báng số liệu ta thấy có lắc trộn mật độ tế bào tăng lên rõ rệt, với lượng dường Glucose cịn sót lại giảm theo Cụ thê là: đôi với chủng TBY 2038.1 giá trị OD tăng từ 3.18 lên 4.8 lượng đường sót giám 2.27% TBY 3425 giá trị OD tăng từ 2.83 lên 4.2, lượng đường sót giảm 2.34% So sánh với tài liệu cơng bố kết q hồn tồn phù hợp Vì q trình lên men việc lấc trộn cần thiết SV; Bùi Thị Thương 41 KỈ8-LỚP 1J.03-KS.CNSH Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội SV: Bùi Thị Thương 48 K18-LỚP 11.03-KS.CNSH KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ Kết luận Sau kết thúc thí nghiệm, vào kết q trình bày phần III chúng tơi rút kết luận sau: • Thơng qua trình lên men ta xác định yếu tố mơi trường ành hường tối ưu hóa chúng + Nhìn chung nấm men đen Moiìiliella chuyển hóa đường Glucose thành Erythritol tốt tốt nồng độ đường 40% + Mơi trường lên men tối thích GYU40 + Ti lệ cấp giống phù hợp q trình lên men 1% • Tối ưu hóa yếu tố ănh hướng cúa mơi trường bên ngồi đến hiệu suất cùa q trình lên men + Nhiệt độ: 28-30°C + pH: 5.5-Ó.5 + Thời gian lên men: ngày + Trong trình lên men có,sự khuấy lắc hiệu suất sệ đạt cao rnir \ icnvien Đạĩ HOC MỞI la NI ộ • Lựa chọn Moniliella byzovii TBY 2038.1 cho hiệu suất lên men chuyền hóa tạo đường Erythritol cao đế tiếp tục nghiên cứu chuyên sâu để hoàn thành đề tài Kiến nghị Do đe tài mờ nhiều hướng nghiên cứu Việt Nam điều kiện thời gian nghiên cứu chưa tuyển chọn thêm chủng giống men đen cho hiệu suất lên men tạo đường Erythritol cao việc xây dựng quy trình lên men khóa luận cịn chưa hồn thiện Đặc biệt q trình lọc dịch lên men, chúng tơi chi tiến hành lọc thơ bàng than hoạt tính bột trợ lọc nên độ tinh chưa cao nhiều tap chat bán chạy TLC chưa thật rõ ràng Do điều kiện trang thiết bị chưa tốt nên chúng tơi khơng tiến hành định lượng xác lượng đường Erythritol tạo thành bang phương pháp HPLC mà chi tiến hành chạy TLC xác định lượng đường Glucose sót Vì tơi xin dưa số đề xuất sau: SV; Bùi Thị Thương 49 KỈ8-LỚP 1J.03-KS.CNSH • Tiếp tục tuyển chọn tìm chủng nấm men có khã lên men tạo đường Erythritol cho hiệu suất cao • Kết thúc q trình lên men tiến hành định lượng đường Erythritol phương pháp HPLC • Tiến hành xây dựng quy trình lên men quy mô công nghiệp Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội sv.- Bùi Thị Thương 50 KỈ8-LỚP 1J.03-KS.CNSH TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liêu nước: I.VŨ Nguyên Thành Bào tồn lưu giữ nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm, 12/ 2010 Bang Trang 34 Nguyễn Lân Dũng, Đào Thị Lương.Tuyên tập vi sinh vật học 11/07/2006 Nguyễn Lân Dũng Phân loại nam men Nguyễn Thị Thu Huyền Đồ án công nghệ thực phẩm Nguyễn Đức Lương Công nghệ vi sinh vật tập NXB Đại học Quốc gia TP HCM, 2000 Lương Đức Phẩm Nấm men công nghiệp NXB KHKT Hà Nội, 2005 Vũ Thị Hoa Nghiên cứu quy trình cơng nghệ sàn xuất đường chức Xylơoligơsacarit từ lõi ngơ quy mơ xướng thực nghiệm Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mớ Hà Nội 2010 Nguyễn Văn Lực, Nguyễn Văn Công, Nguyền Trung Dũng, Thin-Layer chromatography gas chromatography Nguyễn La Arfc Nghtbn cứả yẻòtịý^ighệCsán xủất chất''báo quản sinh học Bacterioxin bang phương pháp vi sinh có ứng dụng cơng nghiệp thực phẩm Viện Công nghiệp thực phâm Hà Nội, 2010 lO Trịnh Thị Kim Vân Đường fructooligosaccarit-đặc tính chức ứng dụng 11 Trần Thị Châu Hồn thiện cơng nghệ xử lý nước phương pháp công nghệ sinh học dung cho sân xuất rượu vang chất lượng cao 2005 12 Đinh Thị Kim Nhung Anh hưởng cùa sổ yếu tố đến trình lên men Táo mèo (Docynia indica) Tạp chí khoa học cơng nghệ, tập 45, số 2, 2007 Tr 87- 92 13 Nguyễn Lân Dũng, Đào Thị Lương Thí nghiệm xác định nhu cầu vitamin cho sinh trưởng cùa nam men 11/07/2006 14 Hoàng Khánh Hồng Định lượng vi sinh vật phương pháp đo mật độ quang 18/6/2011 15 Trần Thị Thúy Liễu, Trần Thị Thu Hà Đồ án môn học công nghệ thực phẩm SV: Bùi Thị Thương 51 K18-LỚP 11,03-KS.CNSH 16 Nguyễn Thị Hà Trần Thị Hồng, Nguyễn Thị Thanh Nhàn, Đồ Thị cẩm Vân, Lê Thị Thu Yen Nghiên cứu khả hấp thụ so kim loại nặng (Cu2+, Pb2+ , Zn2+ ) nước nấm men Saccharomyces cerevisiae Tạp chí Khoa học ĐH Quốc Gia Hà Nội Khoa học Tự nhiên Công nghệ 23 2007 Tr 99-106 Tài liệu nước ngoài: 17 Gholam Ghezelbash I ; Iraj Nahvi I, * ; And Mohammad Rabbani Study of polyols production by Yarrowia lipolytica in batch culture and optimization of growth condition for maximum production 18 Dooms L, Henncbcrt G.L, Vcrachtert H (1971) Polyol synthesis and taxonomic characters in the genus Miniliella, Antoni van Leeuwenhoek, 37 Trang 107-118 19 J Burschapers D Schustolla, K Schugerl H Roper J.C.Troostembergh Engineering aspects of the production of sugar alcohols with the osmophilic yeast Moniliella tomentosa var pollinis Part Batch and fed-batch operation in stirred tank,thắng 2/2002 Trang 498 20 Hee- Jung Moon, MarimuthuJeya In- Won Kim Biotechnological production of erythritol and its Applications Tháng 2/ 2010 Trang 1019 21 Erin, Connor Cox, Ingledew Elleviation of the effects of nitrogen limitiation in high gravity worts through increased inoculation 1999 22 Kurtzman c p Fell J w "The Yeasts a Taxonomic Study”, Elsvier Science Publishers 1998 23 B| Patent: US 005902739A, Method of producing Erythritol (Table 4) 24 Sang Yong Kim, Deok Kun Oh Bong Soo Noh, Soo Ryun Jung, Kyung Ah Kim Fermentation process for preparing erythritol using mother liquor produced from purification process of palatinose US 6270815 Bl 2001 25 JIbicax B.B MnKpõnonormt: MeTOflHHecKMe pcKOMeníiaựnn K jiaoopaTopiibiM 3aHHTHHM H KOHTpoJib caMOCTOitTenbHOH paỗOTbi CTy,'ieHTOB / JIbicax B.B., XcjiajKOHa P.A // Mh.: Bry, 2002 - 100 c 26 Laxman s s Ramchandra V G., Bhalchandra K V., Narayanan K Strain improvement and statistical media optimization for enhanced erythritol production with minimal by-products from Canida magnoliae mutant R23”, Biochemical Engineering Journal Vol55 2011 SV; Bùi Thị Thương 52 K18-LỚP 11,03-KS.CNSH 27 Mhairi Workman, Philippe Holt, Jette Thykaer Comparing cellular performance of Yarrowia lipolytica during growth on glucose and glycerol in submerged cultivations 2013 Nguồn internet 28 http://vietnamese.alibaha.com/product-gs/erythritol-99-1004418155.litml 29 http://cptoctenamgiang.blogspot.com/2010/01/disodium-succinate.html 3().http://www.caysua.com/cpia-trinh-pentozophotphat-pentose-phosphate-pathway/ 31 http://ijs.sgmjourncds.Org/content/59/2/425.full 32.http://vietnamese.alibaba.com/product-gs/erythritol-99 —1004418155.html 33 http://www.erythritol-erytliritol.com/erythritol-specs.html Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội sv.- Bùi Thị Thương 53 K18-LỚP 11,03-KS.CNSH ... Xuất phát từ thực tể trên, đề tài tốt SV; Bùi Thị Thương K18-LỚP Ỉ1.03-KS.CNSH nghiệp với tên gọi "Nghiên cún điền kiện sinh trưởng phát triển chủng nấm men Moniliella có sinh tống hợp đường Erythritol. .. chi có 3g/l mơi trường Chính mà nấm men đen phát triển môi trường GYU 20 tốt mơi trương YM có bồ sung 20% Glucose 3.3 Đánh giá khả tích lũy đường Erythritol chủng nấm men Moniliella từ sun tập Đường. .. Nhìn vào đồ thị ta thấy TBY 2038.1 phát triển mạnh TBY 3425 Nấm men đen Moniliella phát triền cà điều kiện nồng độ đường cao lên đến 60% Phát triển diêu kiện nơng độ dường cao diêm nôi bật cùa nấm