Microsoft Word KHẢO SÁT VAI TRÒ CỦA ctDNA TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ THEO DÕI TÁI PHÁT SỚM BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG docx BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ TRỊNH NGỌC AN[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ TRỊNH NGỌC AN KHẢO SÁT VAI TRÒ CỦA ctDNA TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ THEO DÕI TÁI PHÁT SỚM BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ĐỀ CƯƠNG DỰ TUYỂN NGHIÊN CỨU SINH TP HỒ CHÍ MINH, Năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ TRỊNH NGỌC AN KHẢO SÁT VAI TRỊ CỦA ctDNA TRONG CHẨN ĐỐN VÀ THEO DÕI TÁI PHÁT SỚM BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG NGÀNH: MÃ SỐ: ĐỀ CƯƠNG DỰ TUYỂN NGHIÊN CỨU SINH NGƯỜI DỰ KIẾN HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS BS NGUYỄN HỮU THỊNH TS NGUYỄN HỒI NGHĨA TP.HỒ CHÍ MINH, Năm 2022 DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH DNA tuần hoàn Circulating free DNA DNA khối u tuần hoàn Circulating tumor DNA Tế bào u tuần hoàn Circulating tumor cell Bệnh tồn dư tối thiếu Minimal residual disease Giải trình tự gen hệ Next generation sequencing Chụp cắt lớp vi tính Computed tomography Chụp cộng hưởng từ Magnetic resonance imaging DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT cfDNA Circulating free DNA ctDNA Circulating tumor DNA CTC Circulating tumor cell MRD Minimal residual disease NGS Next generation sequencing CT Computed tomography MRI Magnetic resonance imaging TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh Đặt vấn đề Ung thư đại trực tràng bệnh ác tính thường gặp tồn giới nói chung Việt Nam nói riêng Cho đến nay, chẩn đoán xác định ung đại trực tràng dựa vào nội soi đại tràng sinh thiết Tuy nhiên, hỗn tạp nhiều loại tế bào diện đồng thời khối u, nhiều trường hợp hình ảnh đại thể khối u quan sát qua nội soi phù hợp với ung thư giải phẫu bệnh khơng tìm thấy tế bào ác tính Thực tế khơng đặt khó khăn việc giải thích tình trạng bệnh cho người bệnh mà cịn gây trở ngại định điều trị, ví dụ hố trị người bệnh có di xa, phẫu thuật mức độ tàn phá nhiều (cắt trực tràng phối hợp ngả bụng tầng sinh môn) chưa có chứng giải phẫu bệnh ung thư Một vấn đề khác đặt tái phát bệnh sau phẫu thuật Việc tiên lượng khả tái phát yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến định điều trị hỗ trợ (hoá trị, xạ trị) Phân tầng nguy tái phát dựa giai đoạn ung thư (phân loại TNM AJCC) nghiên cứu nhiều định điều trị hỗ trợ cho người bệnh ung thư đại trực tràng giai đoạn III trở thành kinh điển Tuy nhiên, ung thư giai đoạn II, hoá trị sau phẫu thuật cần cá thể hoá để cân hiệu điều trị ung thư tác dụng phụ hoá chất Nhiều yếu tố tiên lượng mơ hình dự báo tái phát nghiên cứu độ nhạy độ đặc hiệu cịn hạn chế Do địi hỏi cơng cụ xác khơng giúp tiên lượng mà theo dõi tái phát, mang lại hội điều trị kịp thời cho người bệnh Trong năm gần đây, DNA tuần hoàn (circulating free DNA - cfDNA) DNA khối u tuần hoàn (circulation tumor DNA – ctDNA) đẩy mạnh nghiên cứu chẩn đoán theo dõi đáp ứng điều trị số ung thư, có ung thư đại trực tràng Những kết ban đầu thu cho thấy ctDNA có tiềm dấu đặc hiệu cho ung thư, giúp theo dõi đáp ứng điều trị chẩn đoán tái phát sớm Tuy nhiên kĩ thuật mới, có nhiều phương pháp để phát ctDNA quy trình xét nghiệm chưa thống dẫn đến kết nghiên cứu chưa đồng Tại Việt Nam, xét nghiệm ctDNA, hay gọi la sinh thiết lỏng, nghiên cứu nhiều lĩnh vực ung thư phổi, ung thư tế bào máu, chẩn đoán tiền sản… chưa nghiên cứu ung thư đại trực tràng Như vậy, việc phát ctDNA có đặc hiệu cho ung thư đại trực tràng hay khơng? ctDNA có vai trị chẩn đốn xác định ung thư khơng? Và xét nghiệm ctDNA có giúp tiên lượng chẩn đốn sớm tái phát người bệnh sau phẫu thuật điều trị ung thư đại trục tràng khơng? Đó lí thúc đẩy tiến hành nghiên cứu “Khảo sát vai trị ctDNA chẩn đốn theo dõi tái phát sớm bệnh ung thư đại trực tràng” Mục tiêu nghiên cứu • Xác định độ nhạy xét nghiệm ctDNA chẩn đoán ung thư đại trực tràng • Khảo sát mối tương quan ctDNA với đặc điểm ung thư đại trực tràng: kích thước khối u, vị trí ung thư, giai đoạn bệnh… • Xác định độ nhạy độ đặc hiệu xét nghiệm ctDNA chẩn đoán tái phát ung thư đại trực tràng • So sánh giá trị chẩn đoán thời điểm chẩn đoán tái phát ung thư ctDNA với dấu ấn ung thư CEA phương tiện chẩn đốn hình ảnh • Khảo sát mối tương quan thay đổi ctDNA trước sau phẫu với ung thư đại trực tràng tái phát Tổng quan tài liệu 3.1 Dịch tễ học diễn tiến bệnh ung thư đại trực tràng Theo GLOBOCAN 2020, toàn giới ung thư đại trực tràng ung thư phổ biến thứ tính cho hai giới với 1.931.590 ca mắc, chiếm tỉ lệ 10% Riêng Việt Nam, ung thư đại trực tràng ung thư phổ biến thứ nam giới thứ nữ giới Đây bệnh ác tính gây tử vong đứng hàng thứ với tỉ lệ 6,7% tổng số tử vong ung thư Bệnh thường gặp nước phát triển Bắc Mỹ, Châu Âu… Bệnh phân bố nam nhiều nữ, với tỉ số nam : nữ » 1,5 : Lứa tuổi khởi phát bệnh chủ yếu 60 tuổi Thống kê cho thấy Hoa Kì, người 65 tuổi có nguy mắc bệnh cao gấp lần so với người từ 50 – 64 tuổi cao gấp 30 lần so với người 50 tuổi (1) Tuy nhiên, thập kỉ vừa qua ghi nhận gia tăng giới tỉ lệ mắc người 50 tuổi Việt Nam khơng nằm ngồi xu hướng đó, nghiên cứu cho thấy ung thư đại trực tràng Việt Nam khởi phát sớm tuổi 50 (độ tuổi khuyến cáo tầm sốt Châu Á Thái Bình Dương) với tỉ lệ lên đến 28% (2) Bùi Chí Viết bệnh viện Ung Bướu TP Hồ Chí Minh (1/2006 – 12/2007) ghi nhận tỉ lệ ung thư đại trực tràng người trẻ chiếm khoảng 30% Riêng bệnh viện Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh, tỉ lệ người trẻ 50 tuổi trẻ 40 tuổi 24,1% 11,7% (3) Hầu hết ung thư đại trực tràng xuất phát từ tế bào biểu mô tuyến niêm mạc ruột Những hiểu biết sinh bệnh học kết trình phát triển từ u tuyến (tổn thương tiền ung thư) Theo mơ hình “u tuyến – ung thư” Fearon Volgenstein, hình thành ung thư đại trực tràng trình biến đổi qua nhiều bước niêm mạc đại trực tràng ảnh hưởng tích tụ đột biến gen (4) Thơng thường, q trình ước tính kéo dài khoảng 10 năm (5) Khi hình thành, ung thư tiếp tục phát triển xuống lớp niêm, lớp cơ, lớp mạc mạc mạc treo trực tràng Sau vượt qua mạc, ung thư tiếp tục xâm lấn trực tiếp qua quan lân cận bàng quang, tử cung (đối với trực tràng cao) tuyến tiền liệt, túi tinh, âm đạo, niệu quản, vách chậu (đối với trực tràng thấp) Ngoài ra, ung thư phát triển đến lớp niêm, nơi phân bố giàu mạch máu mạch limphô, ung thư xâm lấn mạch di đến hạch vùng di xa đến tạng khác gan, phổi… Thống kê cho thấy khoảng 20 – 25% người bệnh có di xa thời điểm chẩn đoán, tương đương giai đoạn IV (6) Đối với ung thư đại trực tràng giai đoạn II – III, phẫu thuật phương pháp điều triệt Tỉ lệ sống năm ung thư giai đoạn III sau phẫu thuật 40 – 60% (7) Số liệu cho thấy tỉ lệ tái phát ung thư sau phẫu thuật thay đổi từ 28,5% đến 56,8% tuỳ theo nghiên cứu (8, 9), 80% trường hợp tái phát năm (10) Ung thư tái phát nguyên nhân hàng đầu gây thất bại điều trị yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sống người bệnh Do đó, xác định yếu tố tiên lượng xây dựng công cụ theo dõi bệnh yêu cầu cấp thiết để có định điều trị phù hợp kịp thời Các yếu tố tiên lượng xác định gồm có: giai đoạn bệnh, di hạch, ung thư xâm nhập thần kinh – mạch máu, nồng độ CEA/máu sau phẫu thuật (8, 9) Cùng với yếu tố trên, phác đồ theo dõi tái phát phối hợp khám lâm sàng, nồng độ CEA/máu, nội soi tiêu hoá, siêu âm, chụp cắt lớp vi tính giúp nâng tỉ lệ phẫu thuật triệt lần tỉ lệ sống người bệnh Tuy nhiên mức độ cải thiện chưa nhiều bắt nguồn từ hạn chế cận lâm sàng trên: CEA/máu không đặc hiệu cho ung thư đại trực tràng, tăng bệnh lý viêm dày – ruột, bệnh gan, phổi, tuỵ…; phương tiện chẩn đốn hình ảnh khơng phát tổn thương < 1cm; nội soi tiêu hoá thủ thuật xâm lấn 3.2 Giới thiệu ctDNA phương pháp xét nghiệm ctDNA Được ghi nhận lần từ 1869, bác sĩ giải phẫu bệnh người Úc – Thomas Ashworth quan sát thấy nhiều tế bào khơng điển hình mẫu máu người bệnh chết ung thư, sau gọi tế bào u tuần hoàn (circulating tumor cell - CTC) Đến năm 1948, Mandel Metais phát diện DNA tuần hoàn (circulating free DNA - cfDNA) máu người Và từ năm 1970, nghiên cứu lĩnh vực nở rộ ghi nhận nồng độ cfDNA máu người bệnh ung thư cao so với người bình thường (11) DNA tuần hồn – cfDNA phóng xuất từ tế bào chết theo chương trình tế bào hoại tử nhanh chóng đại thực bào thu dọn Khi đại thực bào bị tải, cfDNA phóng thích vào tuần hồn cfDNA DNA phóng thích từ tế bào vào dịng máu, có kích thước trung bình khoảng 170 bp, tương đương kích thước đoạn DNA quấn quanh nuclesome Ở người khỏe mạnh, cfDNA có nồng độ 5-10 ng/ml máu, đó, BN ung thư, nồng độ tăng lên đến 50 lần (12) Nồng độ cfDNA biến động phụ thuộc nhiều yếu tố: tập luyện thể dục, thời điểm ngày bệnh lý Sự biến động nồng độ cfDNA thay đổi phóng thích cfDNA q trình phân hủy cfDNA, chưa hiểu rõ Thời gian bán hủy (half-life) cfDNA khoảng giờ, phân hủy cfDNA diễn gan, lách phóng thích qua nước tiểu Ngồi lưu thơng tuần hồn, nghiên cứu gần cịn tìm cfDNA nước tiểu, dịch não tuỷ, dịch màng phổi, nước bọt (13) DNA khối u tuần hoàn (circulating tumor DNA – ctDNA) ) cfDNA phóng thích từ tế bào ung thư Các ctDNA thường phân biệt với cfDNA từ tế bào bình thường dựa đột biến sinh dưỡng (somatic mutation) epigenetics (thường methyl hóa DNA) gây ung thư Do phóng thích từ tế bào ung thư, ctDNA mang đột biến ung thư có tính đại diện đặc trưng cho ung thư ctDNA chiếm phần nhỏ tổng số cfDNA, thay đổi từ 0,1 – 10% phụ thuộc vào tổng khối tế bào u, giai đoạn ung thư (14) Từ phát này, ý tưởng ứng dụng ctDNA vào chẩn đoán theo dõi điều trị ung thư hình thành Ngày nay, với phát triển kĩ thuật sinh học phân tử, việc phân lập ctDNA vượt qua trở ngại số lượng ỏi ctDNA Digital droplet PCR sử dụng tạo giọt để phân chia đoạn DNA đơn lẻ thành giọt cách sử dụng nhũ tương dầu / nước Mỗi phân tử phân tích riêng lẻ cho chuỗi trình tự đích thơng qua end-point PCR, cho phép phát đoạn DNA đột biến tự nhiên Phương pháp phát nhiều đột biến từ mẫu với độ nhạy cao (từ 0,05% đến 0,001%), khả ghép kênh bị giới hạn việc phát từ đến 10 chuỗi mục tiêu khác (13) Phương pháp BEAMing, mô tả lần Diehl cộng sự, 28 dựa PCR đơn phân tử vi hạt nhũ tương dầu nước Độ nhạy xấp xỉ 0,01%; nhiên, phương pháp tương đối phức tạp khó sử dụng để phân tích thơng thường Do đó, phương pháp thường thích hợp để điều tra số lượng nhỏ đột biến thường áp dụng để phân tích đột biến điểm phát bệnh ung thư (13) Giải trình tự có mục tiêu cho phép thăm dị nhiều locus với độ nhạy cao cách sử dụng amplicon PCR phương pháp lai bắt giữ để loại bỏ yếu tố gây nhiễu Các khu vực để giải trình tự bao gồm từ exon riêng lẻ (kilobase) đến toàn exome (~ 50 megabases) Kĩ thuật cho phép ctDNA phát phân đoạn alen 0,1% (13) Các xét nghiệm dựa amplicon tối ưu hóa cho mục đích phân tích ctDNA nhắm đến hàng chục đến hàng trăm amplicon nhiều kilobase với độ nhạy cao Giải trình tự hệ (NGS) dựa lai bắt có khả làm giàu vùng gen quan tâm cách lai gen / vùng đích với oligonucleotide bổ sung trước giải trình tự Cách tiếp cận cho phép phân tích phần lớn gen xác định nhiều đột biến với độ nhạy cao Độ nhạy việc phát ctDNA nâng cao nữa, với lượng vật liệu đầu vào hạn chế, cách sử dụng ghép nối đặc hiệu cho người bệnh kết hợp với phương pháp giải trình tự nhắm trúng đích Tuy nhiên, chi phí cho việc phát hàng chục đột biến cfDNA cao (> 900 USD / xét nghiệm), việc phát triển kĩ thuật để định kiểu gen / hệ thống NGS để phát ctDNA dự kiến giảm chi phí tương lai gần (13) 3.3 Tình hình nghiên cứu vai trò ctDNA ung thư đại trực tràng Như đề cập trên, ctDNA có tính chất đại diện đặc trưng cho ung thư chứa đựng thông tin di truyền tế bào ung thư Đặc tính mở tiềm to lớn cho xét nghiệm ctDNA chẩn đoán điều trị ung thư đại trực tràng Trong số đó, hai lĩnh vực quan tâm đẩy mạnh nghiên cứu chẩn đoán tái phát theo dõi đáp ứng điều trị Bệnh tồn dư tối thiểu (Minimal residual disease – MRD) khái niệm sử dụng nhiều ung thư tế bào máu, dùng để mơ tả tế bào ung thư cịn sót lại thể người bệnh sau điều trị Ở khối u đặc ung thư đại trực tràng, MRD bao gồm tế bào ung thư lưu hành máu, tổn thương di vi thể hay phần nhỏ khối u nguyên phát sót lại sau điều trị MRD yếu tố tiên lượng sống quan trọng liên quan trực tiếp đến định điều trị hỗ trợ cho người bệnh Chẩn đoán MRD dựa vào phương pháp truyền thống xét nghiệm CEA chụp CT thường chậm trễ, bệnh giai đoạn tiến xa Vì địi hỏi xét nghiệm cho phép chẩn đốn sớm để có định điều trị kịp thời Lần từ 1869, bác sĩ giải phẫu bệnh người Úc – Thomas Ashworth quan sát thấy nhiều tế bào khơng điển hình mẫu máu người bệnh chết ung thư, sau gọi tế bào u tuần hoàn (circulating tumor cell - CTC) (11) CTC diện máu người bệnh, thường tồn với tần suất 1/106 – 107 bạch cầu, chí thấp giai đoạn sớm (14) Do đó, chẩn đốn MRD thơng qua truy tìm CTC khó thực Nhược điểm khắc phục việc phát ứng dụng ctDNA chẩn đoán MRD Nhiều nghiên cứu tiến hành cho thấy tỉ lệ tái phát người bệnh có ctDNA (+) sau phẫu thuật cao so với người bệnh ctDNA (-) Nghiên cứu Ryan cộng ghi nhận tỉ lệ tái phát người bệnh có ctDNA (+) ctDNA (-) 63% 2% (15) Một nghiên cứu khác Tie cộng khảo sát 230 người bệnh ung thư đại tràng giai đoạn II ghi nhận tỉ lệ 79% 9.8% (16) Như vậy, ctDNA (+) sau phẫu thuật dấu MRD yếu tố tiên lượng tái phát Ngoài ra, nghiên cứu Tie, người bệnh phát có ctDNA sau kết thúc hố trị có thời gian sống cịn khơng tái phát ngắn (16) Đối với ung thư trực tràng, nghiên cứu người bệnh ung thư trực tràng cho thấy tăng nguy tái phát ctDNA (+) sau kết thúc điều trị triệt Và nhiều nghiên cứu tiến cứu thực với cỡ mẫu lớn nhằm đánh giá vai trò ctDNA dấu ấn MRD nghiên cứu TRACC (n=1000), ADNcirc (n=473), COBRA (n=1408), CIRCULATE (n=1980)…(17) ... chẩn đoán theo d? ?i t? ?i phát sớm bệnh ung thư đ? ?i tr? ??c tr? ?ng” Mục tiêu nghiên cứu • Xác định độ nhạy xét nghiệm ctDNA chẩn đốn ung thư đ? ?i tr? ??c tr? ?ng • Khảo sát m? ?i tương quan ctDNA v? ?i đặc ? ?i? ??m ung. .. ngư? ?i bệnh có di xa th? ?i ? ?i? ??m chẩn đoán, tương đương giai đoạn IV (6) Đ? ?i v? ?i ung thư đ? ?i tr? ??c tr? ?ng giai đoạn II – III, phẫu thuật phương pháp ? ?i? ??u triệt Tỉ lệ sống năm ung thư giai đoạn III sau...BỘ GIÁO D? ??C VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ Đ? ?I HỌC Y D? ?ỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ TR? ??NH NGỌC AN KHẢO SÁT VAI TR? ? CỦA ctDNA TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ THEO D? ?I T? ?I PHÁT SỚM BỆNH UNG THƯ Đ? ?I TR? ??C TR? ?NG NGÀNH: