Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là dạng ung thư thường gặp hiện nay và đang có xu hướng trẻ hoá. Nghiên cứu mối liên quan giữa tỷ lệ hàm lượng ctDNA và một số đặc điểm bệnh học của UTĐTT là nền tảng cho việc sử dụng ctDNA trong chẩn đoán sớm, điều trị và theo dõi tái phát. đặc biệt là trong ung thư giai đoạn sớm.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA TỶ LỆ HÀM LƯỢNG ctDNA VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC CỦA UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG GIAI ĐOẠN SỚM Đường Thị Hồng Diệp1, Lê Hồng Thủy2, Nguyễn Hoài Nghĩa1, Đỗ Thị Thanh Thủy3, Trần Diệp Tuấn1 TÓM TẮT Mục tiêu: Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) dạng ung thư thường gặp có xu hướng trẻ hố Triệu chứng UTĐTT phụ thuộc vào giai đoạn khối u, vị trí khối u, kích thước khối u, mức độ xâm lấn mức độ di Sử dụng phương pháp giải trình tự hệ mẫu sinh thiết lỏng giúp tìm đột biến trực tiếp dịng máu bệnh nhân hướng đầy tiềm Nghiên cứu mối liên quan tỷ lệ hàm lượng ctDNA số đặc điểm bệnh học UTĐTT tảng cho việc sử dụng ctDNA chẩn đoán sớm, điều trị theo dõi tái phát đặc biệt ung thư giai đoạn sớm Đối tượng Phương pháp: Phương pháp giải trình tự hệ thực để tìm đột biến 20 gen có tần suất đột biến cao bệnh nhân ung thư đại trực tràng báo cáo giới Mẫu máu 50 bệnh nhân ung thư đại trực tràng với giai đoạn khác nhau: 0, I, II III thu thập từ 01/2021 đến 08/2021 để giả trình tự tìm đột biến phân tích mối liên quan có phổ đột biến gene đặc điểm lâm sàng bệnh Kết quả: Tỷ lệ hàm lượng ctDNA số gen có xu hướng tăng theo giai đoạn, kích thước khối u, vị trí khối u, mức độ xâm lấn di hạch Nghiên cứu làm tảng cho việc tiếp tục nghiên cứu phát triển sử dụng ctDNA chẩn đoán sớm hay theo dõi điều trị ung thư đại trực tràng Kết luận: Kết nghiên cứu bước đầu cho thấy việc phát ct DNA máu bệnh nhân ung thư đại trực tràng giai đoạn khác khả thi Có thể tiếp tục hướng nghiên cứu phát triển ctDNA thành kỹ thuật sinh thiết lỏng tương lai gần để phát sớm ung thư đại trực tràng, theo dõi điều trị, giúp bác sĩ lâm sàng có thêm lựa chọn thực đánh giá theo dõi hiệu điều trị, đánh giá tế bào ung thư tồn dư tái phát Từ khóa: ung thư đại trực tràng (UTĐTT), ctDNA, cfDNA ABSTRACT SURVEYING THE CORRELATION BETWEEN ctDNA AND PATHOLOGICAL FEATURES IN EARLY STAGE OF COLORECTAL CANCER Duong Thi Hong Diep, Le Hong Thuy, Nguyen Hoai Nghia, Do Thi Thanh Thuy, Tran Diep Tuan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 26 - No - 2022: 161-169 Objectives: Colorectal cancer is the most common form of cancer today and tends to be younger Symptoms of colorectal cancer depend on tumor stage, tumor location, tumor size, invasion, and metastasis Using a next generation sequencing (NGS) method to find out the tumor specific genetic mutations directly in the patient's blood samples is reliable Study the relation between ctDNA from patients blood sample and the colorectal cancer pathological features is the necessary for the next using of ctDNA in early diagnosis, treatment, and follow-up of recurrence, especially in early-stage cancer Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Viện di truyền y học TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Đường Thị Hồng Diệp Trường Đại học T}y Nguyên, Đăk Lăk Chuyên Đề Nội Khoa ĐT: 0989369390 Email: diepdh@yahoo.com 161 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Methods: Using the New generation sequencing method (Illumina) to determine the mutations in over 20 genes with high mutation frequency reported in colorectal cancer over the world Blood samples of 50 patients with diferent stages, such as: 0, I, II, and III were selected from January 2021 to August 2021 and subjected to sequencing, as well as data analysis to find down the potential correlation Results: The ctDNA of some target genes tended to increase with stage, tumor size, tumor location, invasion and lymph node metastasis The results suggesting that ctDNA is one of the potential markers for early diagnosis, recurency and treatment monitoring of colorectal cancer Conclusion: The results of this study show that the dectection of ctDNA in patients blood sample in diferent stages is realiable The next study can be extended, to make sure that ctDNA can be properly use as a liquid biopsy marker for early diagnosis and treatment monitoring Key word: colorectal cancer, ctDNA, cfDNA ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tr|ng (UTĐTT) l| loại ung thư phổ biến Việt Nam giới Theo thống kê tổ chức Y tế giới WHO tình hình ung thư Việt Nam năm 2020, UTĐTT đứng thứ số bệnh ung thư phổ biến nhất, chiếm 9% c{c trường hợp mắc mới(1) Triệu chứng UTĐTT phụ thuộc vào giai đoạn khối u, mức độ biệt hóa, vị trí khối u, kích thước khối u, mức độ xâm lấn mức độ di Ở giai đoạn muộn, ung thư lan rộng v|o c{c quan lân cận, di đến c{c quan xa l|m người bệnh tử vong(2) Ở Việt Nam, UTĐTT chưa có phương pháp phát sớm hiệu Các dấu ấn (kh{ng nguyên) ung thư có độ nhạy v| độ đặc hiệu cfDNA mang đột biến hay ctDNA (circulating tumor DNA) coi dấu ấn sinh học tiềm v| mang nét đặc trưng việc chẩn đo{n sớm, theo dõi điều trị tiên lượng khả t{i ph{t ung thư thông qua thay đổi nồng độ cfDN(3,4) Tỷ lệ ctDNA tổng số cfDNA gọi tỷ lệ h|m lượng ctDNA hay tần suất đột biến (MAF – Mutation Alelle Fraction) thể biến động theo c{ nh}n v| theo giai đoạn bệnh, nồng độ cfDNA tăng mạnh bệnh nhân ung thư, đặc biệt giai đoạn tái phát xâm lấn so với người khoẻ mạnh, nhiên, nồng độ giảm dần sau qu{ trình điều trị loại bỏ khối u Do đó, việc khảo s{t mối tương quan tỷ 162 lệ h|m lượng ctDNA v| phổ đột biến gen với đặc điểm bệnh học UTĐTT l| cần thiết ĐỐI TƢỢNG- PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Đối tƣợng nghiên cứu Các bệnh nh}n ung thư đại trực tràng giai đoạn I, II, III (theo tiêu chuẩn AJCC VII) bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh thời gian từ 01/2021 đến 08/2021 Tiêu chuẩn chọn Bệnh nhân tham gia nghiên cứu thỏa mãn c{c điều kiện sau: (i) bệnh nh}n đồng ý tự nguyện tham gia nghiên cứu sau tư vấn rõ c{c điều kiện v| nguy tham gia nghiên cứu; (ii) bệnh nh}n chẩn đo{n UTĐTT giai đoạn – III; (iii) bệnh nh}n chưa qua điều trị can thiệp; (iv) bệnh nhân không truyền m{u vòng th{ng trước tham gia nghiên cứu Tiêu chí loại Khi bệnh nh}n khơng đ{p ứng tiêu chí chọn mẫu Phƣơng pháp nghiên cứu Đầu tiên, 10 ml máu bệnh nh}n thu giữ ống BD Vacumtainer, sau quay ly tâm lần (1600 x g 10 phút 4oC 16.000 x g 10 phút 40C) Huyết thu được bảo quản -800C CfDNA tách chiết hoá chất MagMAX Cell-Free DNA Isolation kit (Thermo Fisher, USA) theo hướng dẫn nhà sản xuất CfDNA tách chiết chuẩn bị thư viện hoá chất Accel- Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 NGS 2S DNA Library Kit (Swift Biosciences, USA) theo hướng dẫn nhà sản xuất Nồng độ thư viện định lượng hệ thống QuantiFluor dsDNA (Promega, USA) DNA từ mô u (FFPE) tách chiết kit QiaAmp DNA FFPE kit (Qiagen), qui trình tách chiết tiến h|nh theo hướng dẫn kit, q trình tách chiết mẫu có xử lí với Uracil-N-Glycosilase để loại bỏ gốc cytosine bị deamin hóa DNA tách chiết từ mẫu FFPE phân mảnh enzyme fragmentase (NEBNext dsDNA Fragmentase) Phản ứng phân cắt thực 370C 25 phút Sản phẩm sau phân cắt kiểm tra điện di gel Agarose, kích thước sản phẩm tập trung 150bp-300bp Sản phẩm DNA sau phân mảnh tiến hành sửa đuôi (NEBNext FFPE DNA Repair Mix) chuẩn bị thư viện (NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina) C{c bước tiến h|nh theo hướng dẫn nhà sản xuất Mỗi phân tử cfDNA tách chiết gắn với “adaptor” thông qua phản ứng nối (ligation) xúc tác enzyme “Adaptor” bao gồm thành phần: mã x{c định UID (là đoạn trình tự 8bp đặc trưng cho phân tử cfDNA ban đầu), trình tự mã hóa mẫu (index: đoạn trình tự đặc hiệu cho mẫu, cho phép giải trình tự đồng thời nhiều mẫu) đoạn oligonucleotide cho phép cfDNA gắn giá thể giải trình tự (flow cell) Cấu trúc cfDNA-adaptor nhân PCR với số lượng chu kì giới hạn Các sản phẩm từ bước tạo thư viện mẫu tiến hành lai với hỗn hợp mẫu dò đặc hiệu cho 20 gen mục tiêu (APC, TP53, FAT4, LRP1B, TGFBR, FAT1, BRAF, KMT2C, KMT2D, ARID1A, TRRAP, ZFHX3, TCF7L2, KRAS, PIK3CA, ACVR2A, FBXW7, RNF43, SMAD4, PREX2) - quy trình theo hố chất xGen Lockdown Reagents Quá trình giải trình tự thực hệ thống Illumina NextSeq 550 với NextSeq 500/550 Mid output kits v2 (150 cycles), có độ phủ trung bình 15.000 X Kết giải trình tự phân tích Chuyên Đề Nội Khoa Nghiên cứu Y học phần mềm hãng Swift Bioscience C{c đột biến ghi nhận phân loại đột biến dựa sở liệu COSMIC chuyên biệt cho đột biến ung thư Trên mẫu máu, nên tránh khỏi tình trạng ghi nhận c{c đột biến sinh dưỡng thể khảm có nguồn gốc từ tế bào máu Một số l| đột biến đến từ dòng tế bào tạo máu (Clonal Hematopoiesis - CH) Đ}y đột biến sinh dưỡng tích lũy tế bào gốc tế bào tiền thân tạo máu Các nghiên cứu trước đ}y cho thấy tượng Clonal Hematopoiesis tạo nên dòng tế b|o m{u mang đột biến ung thư bị apoptosis trước góp phần vào q trình sinh ung Những tế b|o m{u mang đột biến bị apoptosis, gây phóng thích cfDNA vào máu ngoại vi, dẫn đến nhầm lẫn với ctDNA phóng thích từ khối u thực Để chứng minh c{c đột biến xuất phát từ dòng tế bào gốc tạo m{u, chúng tơi tiến hành giải trình tự vật liệu di truyền thu từ lớp buffy coat (chứa tế bào bạch cầu) mẫu huyết tương tương ứng Mẫu buffy coat thu nhận phân lập huyết tương Từ đó, chúng tơi có sở x{c định đột biến từ khối u mà từ tế bào máu Như vậy, đột biến xuất phát từ khối u (hay ctDNA) đột biến ghi nhận mẫu huyết tương không diện mẫu bạch cầu, đồng thời có xuất mẫu mơ u Phân tích xử lý số liệu Các số liệu phân tích phần mềm STATA 10 So sánh tỉ lệ test χ2, kiểm tra biến định lượng có phân phối chuẩn hay không phép kiểm Kolmogosov-Smirnov cỡ mẫu lớn 50, phép kiểm Shapiro-Wilk cỡ mẫu nhỏ 50, so sánh trung vị phép kiểm Mann-Whitney, sử dụng phép kiểm Wilcoxon x{c định thay đổi có ý nghĩa c{c biến định lượng với giá trị thời điểm theo dõi bệnh nhân (p