Nghiên cứu khả năng gây bệnh và gây đáp ứng miễn dịch của virut gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú nuôi ở Việt Nam

Nghiên cứu khả gây bệnh gây đáp ứng miễn dịch virut gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú nuôi Việt Nam Phạm Thị Tâm1, Phạm Công Hoạt2, Nguyễn Thị Thu Hiền1, Vũ Tiến Lâm3, Nguyễn Thị Vui4 Nguyễn Thị Thanh4 Tóm tắt chủng virut gây bệnh hoại tử thần kinh (NNV) sử dụng để nghiên cứu khả gây bệnh gây đáp ứng miễn dịch cá mú nuôi Việt Nam Các chủng virut có độc lực khác đánh giá mức độ gây bệnh tế bào mẫn cảm cá mú con, với giá trị TCID50 đạt từ 10-2,7-10-3,9, LD50 đạt từ 10-1,5-10-7,5 Trong chủng NNV ký hiệu QN 02, QN 05, QN 07, KH 05 xác định có độc lực mạnh, gây chết 100% cá sau ngày gây nhiễm Đánh giá khả gây miễn dịch chủng virut xác định chủng KH 05 có tính đại diện kháng nguyên cao nhất, chủng bị bất hoạt formalin 0,3% NNV KH 05 nhũ hóa Montanide ISA 70 tạo kháng thể trung hòa với NNV cường độc ngày thứ 15 thỏ kháng thể bảo hộ cá 80- 85% ngày thứ 20 sau gây miễn dịch Kết sở để sản xuất vacxin phịng bệnh hoại tử thần kinh Từ khóa: Cá mú, Virut gây bệnh hoại tử thần kinh (NNV), TCID50, LD50, Kháng thể trung hòa, Kháng thể bảo hộ Study on the pathogenicity and immune response of Nervous Necrosis Virus (NNV) in grouper culture in Vietnam Pham Thi Tam, Pham Cong Hoat, Nguyen Thi Thu Hien, Vu Tien Lam, Nguyen Thi Vui and Nguyen Thi Thanh Summary Eight strains of Nervous Necrosis Virut (NNV) were used to study on pathogenecity and inducing immune response in grouper being cultured in Vietnam These virus strains having different virulences obtained through assessment of pathogenous levels in susceptible cells and grouper fry/fingerlings, with index TCID50 reached from 10-2,7 to 10-3,9, index LD50 reached from 10-1,5 to 10-7,5 Of which, four NNV strains namely QN 02, QN 05, QN 07, KH 05 were determined to have high virulence, causing 100 % groupers died after post infection Evaluation of inducing immune response of these virus strains was determined that KH 05 virus strain was highest antigen representative This virus strain was inactivated by formalin 0.3 %, NNV KH 05 was emulsified by Montanide ISA 70 that could generate antibody, neutralized with high virulence NNV at day 15th in rabbits and antibody protected 80 – 85 % in groupers at day 20th after inducing immunity This result could be used as basis for producing vaccine against VNN disease Key words: Grouper, Nervous Necrosis Virus (NNV), TCID50, LD50, Neutralizing antibody, Protective antibody -1 Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội Bộ Khoa học Công nghệ Cụng ty C phần phát triển Công nghệ Nông thôn-RTD Khoa Nông lâm ngư, trường Đại học Vinh I Đặt vấn đề Bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous necrosis-VNN) Nervous Necrosis Virut- NNV bệnh cấp tính, xuất 22 lồi cá, có lồi: cá mú (Epinephelus sp.), cá chình (Anguilla anguilla), cá chẽm (Lates calcarifer), cá giò (Racycentron canadum) Bệnh chủ yếu cá giống, gây tỷ lệ chết lên đến 90 – 100% Ở Việt Nam, virut phát thấy cá mú tự nhiên cá chình nước [1,2] Hầu hết nghiên cứu VNN cho thấy: mơ đích NNV hệ thần kinh trung ương (gồm não tuỷ sống) võng mạc [5] Virut gây hoại tử nơron thần kinh dẫn đến biểu bất thường bơi khơng định hướng, chủ yếu theo hình trơn ốc lao thẳng, nhanh phía trước [4] Hiện tại, việc phòng bệnh hoại tử thần kinh thực theo hướng: Loại trừ giống mang mầm bệnh sử dụng vacxin [3] Nghiên cứu thực nhằm mục đích xác định khả gây đáp ứng miễn dịch NNV cá mú để làm sở cho sản xuất vacxin sau II Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng chủng NNV ký hiệu QN 02, QN 05, QN 07, HP 11, NĐ 01, NĐ 11, KH 05, KH 09 phân lập từ cá mú mắc bệnh hoại tử thần kinh (VNN) thu thập từ vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Khánh Hòa 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nuôi cấy virut tế bào NNV nuôi tế bào GS (grouper spleen) Trước sử dụng, tế bào hoạt hóa chai nuôi cấy với môi trường Leibovitz’s L-15 (L 15) có bổ xung 10% huyết bào thai bê (FCS) Tế bào nuôi tủ ấm nhiệt độ 27oC, 5% CO2 ngày để đạt mật độ 105 tế bào/ml Mẫu NNV lây nhiễm tế bào GS 01 hoạt hóa Chai đối chứng có tế bào GS mơi trường L-15 có bổ sung 10% FCS Theo dõi hiệu ứng huỷ hoại tế bào (CPE-cytopathic effect) ngày Khi CPE đạt khoảng 90-95% thu dịch virut khỏi chai nuôi cấy ly tâm thu dịch có chứa virut 2.2.2 Chuẩn độ virut * TCID50 Chuẩn độ virut thực đĩa nhựa 96 giếng nuôi tế bào GS Dịch virut tiến hành pha loãng theo hệ số 10 môi trường Hank’s bổ sung vào giếng tế bào Virut hấp phụ vào tế bào Tiếp tục nuôi tế bào Leibovitz’s L-15 có 10% FCS Quan sát CPE vịng ngày đê xác định TCID50 theo phương pháp Reed Muench * LD50 Cá mú có kích thước 1,5 cm chia thành lô, lô 30 gây nhiễm với chủng VNN phân lập từ vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Khánh Hịa, Bình Thuận Lơ đối chứng tiêm Leibovitz’s L-15 10% +Phương pháp gây nhiễm: Dịch virut pha lỗng theo hệ số 10 mơi trường Leibovitz’s L-15 tiêm 0,1ml/con + Vị trí tiêm: Dưới gốc vây đuôi + Thời gian theo dõi cá: đến 15 ngày sau gây nhiễm Sau tiêm truyền, quan sát biểu lâm sàng, tỷ lệ chết, kiểm tra gen mã hóa kháng nguyên bề mặt LD50 tính dựa theo phương pháp Reed Muench (1938) 2.2.3 Phương pháp gây bất hoạt virut NNV bất hoạt formalin với nồng độ: 0,1%; 0,3%; 0,5% nhiệt độ 37°C 12h Sau 12h trung hòa formalin sodium phosphate, thực lắc dịch liên tục 24 2.2.4 Phương pháp RT-PCR ARN tổng số NNV tách kit RNA extraction (Qiagen) ADN bổ sung tạo thành từ phản ứng RT- PCR với kit RT-PCR (Invitrogen) cặp mồi PCR F1 –R3 [4] (5’-GGATTTGGACGTGCGACCAA-3’; 5’-CGAGTCAACACGGGTGAAGA3’) (Invitrogen) Phản ứng thực với 30 chu kỳ theo chu trình nhiệt: 900C/5 phút, 550C/45 giây, 720C/1 phút Sau đó, phản ứng tiếp tục 720C/10 phút 2.2.5 Phương pháp ELISA trực tiếp Phản ứng thực với kháng thể pha loãng dung dịch đệm carbonate, giếng phủ 100l ủ qua đêm nhiệt độ 40C; Dịch kháng nguyên pha loãng theo tỷ lệ 1/400 PBS, ủ nhiệt độ 370C/ giờ; Goat anti-rabbit IgG HRPO (Sigma) pha loãng 1/10.000, ủ nhiệt độ phòng 45 phút; chất sinh màu TMB ủ 15 phút 37 0C dừng phản ứng H2SO4 1M Đọc kết phản ứng máy đọc đĩa ELISA, bước sóng 450nm III Kết nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu khả gây nhiễm NNV 3.1.1 Xác định liều TCID50 NNV tế bào mẫn cảm Liều TCID50 chủng NNV thí nghiệm xác định dựa mức độ hủy hoại tế bào GS sau ngày gây nhiễm Kết trình bày bảng Bảng Kết gây nhiễm virut tế bào GS 01 STT CPE theo độ pha loãng virut (%) Ký hiệu mẫu TCID50 10-1 12 17 19 25 QN 02 QN 05 QN 07 HP 11 NĐ 01 NĐ 11 KH 05 KH 09 HP 11 100 100 100 70 100 95 100 60 55 10-2 100 100 100 70 100 95 100 60 55 10-3 98 95 95 60 95 80 95 50 50 10-4 85 80 80 50 80 75 80 40 30 10-5 80 70 70 35 70 60 70 15 15 10-6 70 60 60 20 60 52 60 5 10-7 50 48 48 48 35 48 + + 10-8 25 25 25 + 25 20 25 - 10-9 10 10 10 + 10 10 - 10-6,9 10-6,8 10-6,8 10-3,9 10-6,8 10-5,9 10-6,8 10-3 10-2,7 3.1.2 Kết xác định liều gây chết gây nhiễm 50% (LD 50) cá mú chủng virut phân lập từ vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Khánh Hòa sử dụng để gây nhiễm cá mú có kích thước 1,5cm Theo dõi tỷ lệ cá chết có biểu lâm sàng bệnh hoại tử thần kinh lơ thí nghiệm 15 ngày đồng thời xác định gen mã hóa kháng nguyên NNV để khẳng định có mặt virut mẫu cá chết Kết thí nghiệm trình bày bảng Bảng 2: Kết gây nhiễm NNV cá mú STT Ký Tỷ lệ chết cộng dồn sau 15 ngày (%) theo độ pha loãng hiệu virut mẫu (n=30) 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 LD50 QN 02 QN 05 QN 07 NĐ 01 NĐ 11 KH 05 KH 09 HP 11 ĐC 10-6,2 10-7,5 10-7,5 10-5,5 10-6,5 10-6,2 10-2,6 10-1,5 nd 100 100 100 100 100 100 80 66,7 100 100 100 100 100 100 80 53,3 100 100 100 100 100 100 53,3 30 100 93,3 80 93,3 86,7 73,3 26,6 13,3 80 93,3 80 66,7 86,7 66,7 13,3 6,7 60 80 73,3 53,3 66,7 53,3 6,7 6,7 53,3 66,7 60 30 53,3 53,3 6,7 6,7 13,3 53,3 46,7 26,6 30 13,3 0 13,3 33,3 40 13,3 15 13,3 0 Gen T2 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 + + + + + + + + - + + + + + + + + - + + + + + + + + - + + + + + + + + - + + + + + + + + - + + + + + + + + - + + + + + + + + - + + + + + + + + - + + + + + + + + - Ghi chú: nd: khơng tính tốn, gen T2: gen mã hóa kháng nguyên NNV [4] +: dương tính với gen T2, -: âm tính với gen T2, ĐC: tiêm Leibovitz’s L-15 chủng NNV tiếp tục gây nhiễm cho cá mú với liều LD50 để đánh giá độc lực virut thông qua mức độ gây chết cá thời điểm theo dõi thí nghiệm Các mẫu cá chết có biểu bệnh hoại tử thần kinh giám định đồng thời gen T2 Bảng Kết gây nhiễm cá mú với chủng NNV phân lập Tỷ lệ chết tích lũy (%) theo thời gian gây nhiễm Bố trí lơ thí (h) LD50 Gen T2 nghiệm (n=30) 24 36 72 96 120 10-6,2 QN 02 13,3 46,7 100 + -7,5 10 QN 05 23,3 63,3 100 + 10-7,5 QN 07 26,7 50 100 + -5,5 10 NĐ 01 16,7 23,3 40 56,7 73,3 + 10-6,5 NĐ 11 23,3 43,3 63,3 83,3 100 + 10-6,2 KH 05 30 36,7 100 + -2,6 10 KH 09 10 16,7 33 40 75 + -1,5 10 HP 11 3,3 13,3 30 46,7 72 + Đối chứng âm (n=15) nd 0 6,67 6,67 - Kết trình bày bảng cho thấy, lô đối chứng âm, cá bị chết tiêm Leibovits L15 10%, tỷ lệ chết cộng dồn sau 120 6,67%, kiểm tra gen T2 cho kết âm tính Có 4/8 chủng gây chết 100% cá thời điểm 72 chủng QN 02, QN 05, QN 07 KH 05, chủng gây chết 100% cá thời điểm 120 NĐ 11, chủng gây gây chết 72-75% cá thời điểm 120 chủng NĐ 01, KH 09, HP 11 Như vậy, chủng ký hiệu QN 02, QN 05 QN 07 KH 05 có độc lực mạnh chủng lại, chủng sử dụng phản ứng trung hòa để kiểm tra kháng thể động vật thí nghiệm tiêm NNV 3.2 Nghiên cứu khả gây đáp ứng miễn dịch NNV 3.2.1 Kết nghiên cứu khả gây đáp ứng miễn dịch NNV thỏ chủng NNV phân lập cá mú tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định Khánh Hòa sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch thỏ nhằm mục đích: i) lựa chọn chủng đại diện kháng nguyên, ii) đánh giá khả trung hòa virut cường độc kháng thể thu 3.2.1.1 Kết lựa chọn chủng NNV đại diện kháng nguyên Chủng đại diện kháng nguyên chủng phải đạt tiêu chí: i) có khả kích thích sinh đáp ứng miễn dịch nhanh, mạnh nhất, ii) kháng thể sinh chủng phải nhận biết nhiều chủng virut NNV khác Để lựa chọn chủng này, tiêm NNV vào thỏ thí nghiệm với lần nhắc lại ngày thứ 15 Theo dõi biến động hiệu giá kháng thể thỏ phản ứng ELISA Kết thí nghiệm trình bày đồ thị 76 ELISA OD 450nm 1.6 1.4 QN02 1.2 QN05 QN07 NĐ01 0.8 NĐ11 0.6 KH05 0.4 KH09 0.2 HP11 Đối chứng âm (L15) d0 d7 d15 d21 d35 d45 d60 số ngày Đồ thị Biến động kháng thể máu thỏ tiêm NNV (ELISA OD450) Kết đồ thị cho thấy chủng KH 05, KH 09, QN 07 có khả gây đáp ứng miễn dịch nhanh mạnh thỏ thí nghiệm, chủng cịn lại gây đáp ứng chậm Do đó, kháng thể chủng KH 05, KH 09, QN 07 lựa chọn để kiểm tra khả nhận biết chéo với chủng virut gây bệnh hoại tử thần kinh khác nhằm tìm mẫu kháng thể nhận biết nhiều chủng NNV Thí nghiệm thực phản ứng ELISA trực tiếp Kết trình bày bảng Bảng Kết kiểm tra khả phát chéo chủng NNV kháng thể đặc hiệu với chủng KH 05, KH 09, QN 07 (ELISA OD 450=1,2) Kháng thể KH 05 KH 09 QN 07 Chủng virut KH 05 + + KH 09 + + QN 07 + + + QN 02 + + + QN 05 + + + NĐ 01 + + + NĐ 11 + + + HP 11 + + + Kết phản ứng ELISA trực tiếp cho thấy, kháng thể đặc hiệu với hai chủng KH 05 KH 09 có khả gây phản ứng chéo với chủng cịn lại, kháng thể chủng QN 07 lại không phát chủng NNV phân lập Khánh Hịa Có thể chủng QN 07 thuộc phân typ khác NNV Từ kết bảng biểu đồ 1, chủng KH 05 lựa chọn làm chủng đại diện kháng ngun chủng đạt tiêu chí: có khả kích thích sinh đáp ứng miễn dịch nhanh, mạnh kháng thể sinh KH 05 nhận biết nhiều chủng virut NNV khác NNV KH 05 bất hoạt formalin nồng độ: 0,1%; 0,3% 0,5% Sau ngày bất hoạt trung hòa sodium phosphate, virut tiêm 77 truyền trở lại cá mú để đánh giá mức độ bất hoạt Kết thí nghiệm thu trình bày bảng 5: Bảng Kết đánh giá mức độ bất hoạt NNV nồng độ formalin Nồng độ Số Biểu cá tiêm truyền virut sau Gen T2 Formalin Liều tiêm con/lô xử lý formalin (%) 0,1% 15 0,1ml/con Bơi không định hướng ngày đầu, sau bơi đứng, bỏ ăn; 100% lô cá bị chết sau ngày 0,3% 15 0,1ml/con Cá bình thường, khơng có biểu đặc biệt - 0,5% 15 0,1ml/con Cá bình thường, khơng có biểu đặc biệt - + Kết thí nghiệm cho thấy, 100% cá chết sau ngày tiêm truyền dịch virut xử lý formalin 0,1%, cho kết dương tính với gen T2 Như vậy, nồng độ formalin 0,1% khơng gây bất hoạt hồn tồn chủng NNV KH 05 Ở hai lô virut xử lý formalin 0,3% 0,5% không phát cá chết triệu chứng bệnh hoại tử thần kinh Bằng phản ứng RT-PCR, đoạn gen T2 không phát cá gây nhiễm Như hai nồng độ bất hoạt hoàn toàn chủng NNV KH 05 Từ kết cho phép chúng tơi xác định rằng, nồng độ formalin 0,3% thích hợp để bất hoạt virut, phục vụ gây miễn dịch cho cá thí nghiệm 3.2.1.2 Kết đánh giá khả trung hòa NNV cường độc kháng thể thu thỏ Phản ứng trung hòa thực với chủng virut cường độc ký hiệu QN 02, QN 05 QN 07 kháng thể thu từ thỏ gây miễn dịch với chủng KH 05 Định kỳ thu huyết thỏ để làm phản ứng trung hòa với 03 chủng virut NNV cường độc Các mẫu kháng thể virut ủ giờ, 370C tiêm trở lại cá mú bệnh Theo dõi cá ngày, kết trung hòa virut đánh giá tỷ lệ nhiễm bệnh chết trình bày bảng Bảng Kết trung hòa chủng NNV cường độc kháng thể kháng NNV KH 05 Tên chủng QN 02 (n=20) QN 05 (n=20) QN 07 (n=20) Tỷ lệ cá mắc bệnh/ chết (%) Ngày thu huyết d0 d7 d15 d21 d35 d45 d60 Tỷ lệ cá mắc bệnh (%) 100 100 20 0 Tỷ lệ cá chết (%) 100 100 0 0 Tỷ lệ cá mắc bệnh (%) 100 100 25 10 0 Tỷ lệ cá chết (%) 100 75 0 0 Tỷ lệ cá mắc bệnh (%) 100 100 35 0 Tỷ lệ cá chết (%) 100 90 0 0 Ghi chú: d: ngày thu huyết thỏ 78 Số liệu bảng cho thấy, kháng thể trung hòa thỏ sinh từ ngày thứ 35 sau gây miễn dịch NNV, 100% cá tiêm dịch virut trung hịa khơng bị chết với triệu chứng bệnh hoại tử thần kinh, không bị nhiễm NNV (giám định có mặt gen T2 mô não cá quan sát triệu chứng lâm sàng) Ở ngày thứ 15, tỷ lệ cá chết mắc bệnh có sai khác 03 chủng thí nghiệm, chênh lệch tỷ lệ cá mắc bệnh chết từ 20-30% 3.2.2 Đánh giá khả tạo đáp ứng miễn dịch NNV cá mú Chủng NNV KH 05 bất hoạt nhũ hóa dầu Montanide ISA70 gây đáp ứng miễn dịch cho cá mú lần ngày thứ 1, 7, 10 với liều 0,1 ml/con (hiệu giá virut 10-6,2) , lô đối chứng tiêm L15 10% Sau gây miễn dịch, cá mú công cường độc chủng QN 02, QN 05, QN 07 để đánh giá khả tạo đáp ứng miễn dịch cá với NNV Kết thí nghiệm thể bảng 7: Bảng 7: Kết tạo đáp ứng miễn dịch NNV cá mú Tên chủng QN 02 QN 05 QN 07 Ngày công cường độc (n=20) Tỷ lệ cá mắc bệnh/ chết (%) d15 d20 d25 D30 d35 d40 d45 Tỷ lệ cá mắc bệnh (%) 30 25 25 20 20 15 15 Tỷ lệ cá chết (%) 15 10 15 15 10 10 10 Tỷ lệ cá mắc bệnh (%) 35 25 20 15 15 15 15 Tỷ lệ cá chết (%) 25 15 10 10 10 10 10 Tỷ lệ cá mắc bệnh (%) 30 25 20 15 20 20 15 15 15 15 15 10 15 10 Tỷ lệ cá chết (%) Theo số liệu bảng 7, NNV bất hoạt tạo kháng thể cá thí nghiệm Ở ngày thứ 15, kháng thể sinh bảo hộ 65-70% cá bị công cường độc Từ ngày thứ 20-30 kháng thể sinh bảo hộ 80-85% cá bị công cường độc Lô đối chứng tiêm virut bất hoạt không công cường độc khơng phát thấy gen T2 có não cá (số liệu bảng 7), chứng tỏ cá bị bệnh lơ thí nghiệm chủng cường độc QN 02, QN 05, QN 07 Kết sản xuất vacxin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho tỷ lệ bảo hộ cao lựa chọn liều kháng nguyên số lần tiêm nhắc lại phù hợp IV Kết luận đề nghị - Đã xác định liều TCID50, LD50 chủng virut gây bệnh hoại tử thần kinh cá mú, mức độ gây nhiễm chủng khác nhau, có chủng có độc lực mạnh QN 02, QN 05, QN 07 KH 05 - Đã lựa chọn chủng đại diện kháng nguyên KH 05 Chủng virut bị bất hoạt formalin 0,3% - NNV KH 05 bất hoạt tạo kháng thể trung hòa với NNV cường độc ngày thứ 15 thỏ kháng thể bảo hộ cá 80- 85% ngày thứ 20 sau gây miễn dịch 79 Đề nghị nghiên cứu lặp lại để có sở vững cho SX vacxin Đề nghị nghiên cứu sản xuất vacxin vơ hoạt nhũ dầu để phịng bệnh hoại tử thần kinh cá mú Tài liệu tham khảo Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt (2011) Phát hiện, phân lập xác định số đặc tính virut gây bệnh hoại tử thần kinh (Nervous Necrosis Virus) cá mú tự nhiên vùng biển Quảng Ninh Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, ISSN 0866-7020, số 20, 2011 Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Thị Vui, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Quang Linh (2012) Xác định virut gây bệnh hoại tử thần kinh (Nervous Necrosis Virut) cá chình ni vùng biển miền Trung Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, ISSN 08667020, số 12, 2012 Liu W, Hsu CH, Chang CY, Chen HH, Lin CS (2006) Immune response against grouper nervous necrosis virus by vaccination of virus-like particles Vaccine 24(3739):6282-7 Renault, T., Haffner, P., Baudin, L.F., Breuil, G., Bonami, J.R., 1991 Mass mortalities in hatchery-reared sea bass Lates calcarifer larvae associated with the presence in the brain and retina of virus-like particles Bull Eur Assoc Fish Pathol 11, 68–73 80