Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn lelliottia amnigena gây bệnh héo xanh ở cà chua

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG HÀ THỊ LÊ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN LELLIOTTIA AMNIGENA GÂY BỆNH HÉO XANH Ở CÀ CHUA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Đà Nẵng - 2021 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG HÀ THỊ LÊ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN LELLIOTIA AMNIGENA GÂY BỆNH HÉO XANH Ở CÀ CHUA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 7420201 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Người hướng dẫn: TS Nguyễn Minh Lý Đà Nẵng - 2021 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đề tài:”Nghiên cứu độc tính vi khuẩn Lelliotia amnigena gây bệnh héo xanh cà chua” cơng trình nghiên cứu độc lập hướng dẫn TS Nguyễn Minh Lý Đề tài, nội dung báo cáo sản phẩm mà em nỗ lực nghiên cứu trình học tập trường Các số liệu, kết trình bày báo cáo trung thực Đây kết nghiên cứu tác giả chưa công bố cơng trình khác trước Em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm, kỷ luật Khoa kỷ luật nhà trường vi phạm quy định đạo đức khoa học Sinh viên thực Hà Thị Lê i LỜI CẢM ƠN Quá trình thực luận văn tốt nghiệp giai đoạn quan trọng quãng đời sinh viên Luận văn tốt nghiệp tiền đề nhằm trang bị cho chúng em kỹ nghiên cứu, kiến thức quý báu trước lập nghiệp Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy, cô khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian học tập, nghiên cứu thực khóa luận Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Nguyễn Minh Lý, người thầy tâm huyết tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi định hướng cho em suốt trình thực khóa luận Cảm ơn cha mẹ người thân gia đình hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian qua đặc biệt thời gian em theo học trường Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn thân thương đến toàn thể bạn bè, người anh, người chị bạn sinh viên khóa ln động viên tinh thần, đồng hành em suốt thời gian học tập hồn thành khóa luận Xin chúc điều tốt đẹp đồng hành người Em xin chân thành cảm ơn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Ý nghĩa Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh héo xanh vi khuẩn vi khuẩn gây bệnh héo xanh 1.1.1 Bệnh héo xanh vi khuẩn 1.1.2 Vi khuẩn L.amnigena 1.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo xanh giới Việt Nam 1.2.1 Một số nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo xanh giới 1.2.2 Một số nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo xanh Việt Nam CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Vật liệu 11 2.2 Phương pháp nghiên cứu 11 2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 11 2.2.2 Phương pháp định danh vi khuẩn đoạn gen 16S 759/760 12 2.2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 13 2.2.4 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo 14 2.2.5 Phương pháp tính tốn xử lý số liệu 15 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 3.1 Phân lập định danh vi khuẩn gây bệnh héo xanh từ vùng trồng cà chua thành phố Đà Nẵng 16 3.2 Xác định ngưỡng mật độ lây nhiễm nhân tạo 19 3.2.1 Theo dõi tốc độ sinh trưởng L.amnigena 19 3.2.2 Xác định ngưỡng mật độ lây nhiễm 20 3.3 Đánh giá thời gian tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh số giống cà chua khác 23 3.3.1 Thời gian tỷ lệ héo xanh 23 3.3.2 Tái phân lập vi khuẩn xác định tác nhân gây HXVK 28 iii 3.4 Khảo sát mức độ gây bệnh vi khuẩn L.amnigena số trồng nông nghiệp 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 Kết luận 31 Kiến nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC 37 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT µg Microgram µL Microliter bp Base pair cs Cộng CTAB Cetyltrimethyl-ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid HXVK Héo xanh vi khuẩn mg Milligram mL Milliliter PCR Polymerase chain reaction SPA Sucrose peptone agar TBE Tris- Axit Boric - EDTA TZC 2,3,5- triphenyl tetrazolium clorua v DANH MỤC BẢNG BIỂU Số hiệu bảng Tên bảng Số trang 2.1 Tọa độ điểm thu mẫu 11 3.1 Kết nhuộm gram định danh vi khuẩn 3.2 3.3 Đánh giá ngưỡng mật độ gây bệnh chủng vi khuẩn L.amnigena cà chua trưởng thành Đánh giá ngưỡng mật độ gây bệnh chủng vi khuẩn L.aminigena cà chua vi 21 22 DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu hình Tên hình Số trang 1.1 Hình ảnh vi khuẩn L.amnigena phân lập môi trường TTC (Mai, 2020) 3.1 So sánh hình thái khuẩn lạc mơi trường TTC 17 3.2 Hình ảnh vi khuẩn nhuộm Gram 19 3.3 Sản phẩm PCR với mồi 16S mồi 759/760 19 3.4 Biểu đồ tương quan thời gian giá trị OD L.amnigena 19 3.5 Biểu đồ tương quan thời gian mật độ tế bào L.amnigena 20 3.6 Thời gian tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh nhóm cà chua trưởng thành 24 3.7 Thời gian tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh nhóm cà chua 24 3.8 Tỷ lệ nhiễm qua các khoảng thời gian khảo sát chủng L.amnigena nhóm cà chua 26 3.9 Tỷ lệ nhiễm qua các khoảng thời gian khảo sát chủng L.amnigena nhóm cà chua trưởng thành 27 3.10 Cây có triệu chứng héo rũ sau lây nhiễm 28 3.11 Tái phân lập vi khuẩn môi trường TTC 28 3.12 Sản phẩm PCR với mồi 759/760 29 3.13 Kiểm tra khả gây bệnh L.amnigena cà tím ớt thiên 30 vii TÓM TẮT Nghiên cứu nhằm đánh giá độc tính chủng vi khuẩn Lelliottia amnigena cà chua, cà tím ớt phương pháp lây nhiễm nhân tạo, thực theo phương pháp Hayward (1991) Thực đánh giá độc tính, khả gây bệnh từ chủng phân lập thông qua việc theo dõi tiến trình bệnh: Số ngày xuất triệu chứng héo héo rũ hoàn toàn, số chết qua ngày chủng vi khuẩn 7, 14, 21 28 ngày sau lây nhiễm với nhóm khảo sát: Cà chua trưởng thành (6-7 tuần tuổi) cà chua (6-7 ngày tuổi) Kết nghiên cứu cho thấy: Vi khuẩn L.amnigena có khả gây bệnh cà chua cà chua trưởng thành với TLB 54,16% trưởng thành 100% con, ngưỡng mật độ thể độc tính mạnh lây nhiễm nhân tạo 108, đánh giá so sánh song song với chủng R.solanacearum phân lập Đà Nẵng dùng làm đối chứng (+), tác nhân gây bệnh chủ yếu mầm bệnh HXVK với tỷ lệ bệnh 100% Bên cạnh đó, sử dụng thêm số giống trồng nơng nghiệp khác: cà tím, ớt để đánh giá phổ kí chủ vi khuẩn gây bệnh héo xanh L.amnigena, kết cho thấy không xuất triệu chứng bệnh sau ngày kể từ lây nhiễm, kết luận L.amnigena khơng có phổ ký chủ loại giống Từ khóa: Cà chua, héo xanh vi khuẩn, lây nhiễm nhân tạo, độc tính, tỷ lệ bệnh viii nhiễm với tỷ lệ bệnh 16,67% Và chết hoàn toàn từ ngày thứ cà chua Kiwami, ngày thứ 10 cà chua Bi đỏ Cherry Từ kết biểu thị biểu đồ nhóm: Cà chua cà chua trưởng thành, đưa nhận định: Độ tuổi giống có ảnh hưởng lớn đến khả lây nhiễm vi khuẩn L.amnigena Cụ thể, tỷ lệ bị nhiễm bệnh giống Kiwami nhanh nhiều so với giống cà chua bi với số lượng chết nhóm nhiều nhóm cà chua trưởng thành Giải thích cho kết này, dựa nghiên cứu Hayward, 1991, ông đưa nhận định: Tốc độ mức độ nghiêm trọng triệu chứng xuất mầm bệnh có liên quan đến độ tuổi, thể trạng tình trạng dinh dưỡng vật chủ, điều kiện môi trường độc lực vi khuẩn (A C Hayward, 1991) Kết cho thấy: Vi khuẩn L.amnigena vi khuẩn R.solanacearum phân lập thành phố Đà Nẵng chủng có độc lực có khả lây nhiễm cho cà chua Và chủng R.solanacearum có độc tính mạnh chủng L.amnigena cần khảo sát, tác nhân gây bệnh chính, chủ yếu mầm bệnh HXVK báo cáo trước Đối với con, vi khuẩn R.solanacearum xâm nhập vào hệ thống mạch, gây triệu chứng héo rũ thông thường với TLB 100% sau 14 ngày lây nhiễm So sánh mức độ nhiễm bệnh giống cà chua: Cà chua Bi đỏ Cherry có khả kháng bệnh tốt cà chua Kiwami, với nhóm trưởng thành L.amnigena có tỷ lệ lây nhiễm trung bình, R.solanacearum cho tỷ lệ nhiễm bệnh nặng (Hình 3.8.; 3.9.) 25 Kiwami Bi Đỏ Cherry Ngày thứ - sau lây nhiễm Ngày thứ - sau lây nhiễm Ngày thứ 8- 14 sau lây nhiễm Ngày thứ 8- 14 sau lây nhiễm Đối chứng (-): Nước cất Đối chứng (-): Nước cất Đối chứng (+): R.solanacearum Đối chứng (+): R.solanacearum Hình 3.8 Tỷ lệ nhiễm qua các khoảng thời gian khảo sát Chủng L.amnigena nhóm cà chua 26 Kiwami Bi Đỏ Cherry Ngày thứ 6-11 sau lây nhiễm Ngày thứ -17 sau lây nhiễm Ngày thứ 12- 18 sau lây nhiễm Ngày thứ 18 -20 sau lây nhiễm Ngày thứ 19- 28 sau lây nhiễm Ngày thứ 21 -28 sau lây nhiễm Đối chứng (+): R.solanacearum Đối chứng (-): Nước cất Hình 3.9 Tỷ lệ nhiễm qua các khoảng thời gian khảo sát Chủng L.amnigena nhóm cà chua trưởng thành 27 3.3.2 Tái phân lập vi khuẩn xác định tác nhân gây HXVK Để khẳng định giống thực khảo sát chết độc tính vi khuẩn lây nhiễm, cần thực tái phân lập từ có triệu chứng héo xanh (Hình 3.10.) Vi khuẩn gây bệnh héo xanh phân lập từ xử lý khử trùng, với quy trình phân lập mơi trường TTC có bổ sung 0,5mg Pennicillin D E Hình 3.10 Cây có triệu chứng héo rũ sau lây nhiễm D- Cà chua lây nhiễm R.solanacearum E- Cà chua lây nhiễm L.amnigena Sử dụng đối chứng (-) (nước cất) thực kiểm chứng yếu tố lây nhiễm, gây héo khác M N O Hình 3.11 Tái phân lập vi khuẩn môi trường TTC M- Phân lập từ cà chua lây nhiễm R.solanacearum N- Phân lập từ cà chua lây nhiễm L.amnigena O- Phân lập từ cà chua sử dụng đối chứng (-) Kết tái phân lập chủng vi khuẩn cho thấy: Hình thái khuẩn lạc phân lập giống với khuẩn lạc ban đầu xuất hình thái khuẩn lạc cho chủng vi khuẩn lây nhiễm, giống đĩa cấy lặp lại So sánh với đĩa 28 phân lập từ đối chứng (-), cho kết đối chứng hồn tồn bệnh, khơng có lây nhiễm chéo, khơng có nhiễm bẩn từ đất (Hình 3.11.) Sau thu hình thái khuẩn lạc từ tái phân lập, tiến hành nhân nhanh môi trường SPA lỏng, tách chiết chạy phản ứng PCR với đoạn mồi 759/760 M Hình 3.12 Sản phẩm PCR với mồi 759/760 M: Lader 3000bp; 1: L.amnigena; 2: R.solanacearum Kết mẫu bắt cặp với mồi 759/760, cho băng xuất kích thước khoảng 281bp (Hình 3.12.), tương ứng với kích thước thực phản ứng PCR, gửi mẫu định danh Chứng tỏ, vi khuẩn xâm nhập vào hệ thống bó mạch, héo rũ nhiễm bệnh HXVK, không tác nhân ngoại cảnh khác 3.4 Khảo sát mức độ gây bệnh vi khuẩn L.amnigena số trồng nông nghiệp Liên quan đến mầm bệnh này, nhiều loại trồng nông nghiệp chịu ảnh hưởng nghiêm trọng, thiệt hại lớn đến kinh tế Bởi phạm vi ký chủ rộng nhiều loại giống nông sản cà tím, khoai tây, ớt… Tính độc, khả gây bệnh vi khuẩn gây khác tuỳ theo vật chủ giống trồng (Elphinstone JG.;2005) Do đó, tơi tiến hành nghiên cứu khảo sát mức độ gây bệnh chủng vi khuẩn L.amnigena số giống trồng nơng nghiệp Thí nghiệm thực giống cà tím ớt thiên - ngày tuổi, nhằm bước đầu xác định phổ ký chủ vi khuẩn L.amnigena 29 B A Hình 3.13 Kiểm tra khả gây bệnh L.amnigena gây bệnh héo xanh cà tím ớt thiên A- Cà tím; B- Ớt thiên Kết khơng xuất triệu chứng héo sau ngảy kể từ lúc bắt đầu lây nhiễm giống nơng sản khảo sát: cà tím ớt thiên (Hình 3.13.) Nghiên cứu Buddenhagen, 1986 xác định, nhiều loại thực vật khơng có triệu chứng sau nhiễm bệnh khơng cơng nhận vật chủ, tạo điều kiện cho mầm bệnh tồn trình luân canh trồng Kết luận, loài gây bệnh HXVK khác phạm vi ký chủ (Buddenhagen, 1986) Tác nhân gây bệnh thích nghi với vật chủ chúng cách cố định liên tiếp đột biến có lợi, độc lực chúng bị ảnh hưởng số yếu tố, bao gồm đặc điểm vật chủ (Gandon & , M E Hochberg, 2013) Kết luận: Vi khuẩn L.amnigena không gây bệnh giống trồng nông nghiệp: cà tím ớt thiên 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Mơi trường TTC khơng cịn môi trường đặc hiệu cho vi khuẩn gây bệnh HXVK Mơi trường TTC có bổ sung 0,5 mg Pennicillin hiệu cho trình phân lập Chủng vi khuẩn L.amnigena có độc tính có khả gây bệnh HXVK Mật độ gây bệnh cao khảo sát lây nhiễm nhân tạo 108 Mức độ gây bệnh phụ thuộc vào độ tuổi, giống Tìm tác nhân gây bệnh HXVK cho cà chua địa bàn thành phố Đà Nẵng R.solanacearum Tiến triển bệnh HXVK sau lây nhiễm: Triệu chứng bệnh bắt đầu biểu mức cao sau ngày sau lây nhiễm Giống Kiwami có tốc độ tiến triển bệnh nhanh nhất, mức cao với chủng vi khuẩn Tính kháng giống bệnh HXVK: So sánh mức độ nhiễm bệnh giống cà chua, kết cho thấy: Cà chua Bi đỏ Cherry có khả kháng bệnh tốt cà chua Kiwami, với nhóm trưởng thành L.amnigena có tỷ lệ lây nhiễm trung bình, R.solanacearum cho tỷ lệ nhiễm bệnh nặng Kiến nghị Tối ưu thêm quy trình phân lập với nhiều loại kháng sinh hơn, pennicillin, bổ sung thêm loại kháng sinh: Polymycin B sultfat, Bacitraxin, Chloramphenicol, nhằm tiêu diệt tất vi khuẩn nội sinh, rút ngắn thời gian cho quy trình phân lập Tiếp tục nghiên cứu khả lây nhiễm vi khuẩn L.amnigena thời gian dài với số lượng lớn Thực lây nhiễm nhân tạo số phương pháp cắt rễ, gây tổn thương vùng rễ So sánh với phương pháp lây nhiễm thông thường, tự nhiên với việc tưới sinh khối quanh bề mặt rễ Kết hợp lây nhiễm nhân tạo chủng vi khuẩn R.solanacearum L.amnigena để đánh giá mối quan hệ chủng xâm lấn vào vật chủ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO A C Hayward (1991) Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by pseudomonas solanacearum In Distribution (pp 65–87) Aley, E., & Elphinstone, J (1995) Culture media for Ralstonia solanacearum isolation, identification and maintenance In Fitopatologia (Vol 30, pp 126–130) Asakura, H., Makino, S I., Kobori, H., Watarai, M., Shirahata, T., Ikeda, T., & Takeshi, K (2001) Phylogenetic diversity and similarity of active sites of Shiga toxin (Stx) in Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) isolates from humans and animals In Epidemiology and Infection (Vol 127, Issue 1, pp 27–36) Aslam, M., & Mukhtar, T (2018) Distributional variability of bacterial wilt of chili incited by Ralstonia solanacearum in eight agro-ecological zones of Pakistan Beth L Dalsing, C A (2014) Nitrate Assimilation Contributes to Ralstonia solanacearum Root Attachment, Stem Colonization, and Virulence Boshou, T Y and L (1990) General Aspects of Groundnut Bacterial Wilt in China Brady, C., Cleenwerck, I., Venter, S., Coutinho, T., & De Vos, P (2013) Taxonomic evaluation of the genus Enterobacter based on multilocus sequence analysis (MLSA): Proposal to reclassify E nimipressuralis and E amnigenus into Lelliottia gen nov as Lelliottia nimipressuralis comb nov and Lelliottia amnigena comb nov., In Systematic and Applied Microbiology (Vol 36, Issue 5, pp 309–319) CHAPMAN, G H (1951) A culture medium for detecting and confirming Escherichia coli in ten hours In American journal of public health and the nation’s health (Vol 41, Issue 11 Pt 1, p 1381) Chaudhry, Z., & Rashid, H (2011) Isolation and characterization of Ralstonia solanacearum from infected tomato plants of Soan Skesar valley of Punjab In Pakistan Journal of Botany (Vol 43, Issue 6, pp 2979–2985) Dalsing BL, Truchon AN, Gonzalez-Orta ET, Milling AS, A C (2015) Ralstonia solanacearum Uses Inorganic Nitrogen Metabolism for Virulence, ATP Production, and Detoxification in the Oxygen-Limited Host Xylem Environment Davin-regli, A., & Lavigne, J (2019) Enterobacter spp : Update on Taxonomy , Clinical Aspects , and (Vol 32, Issue 4, pp 1–32) Digonnet, C., Martinez, Y., Denancé, N., Chasseray, M., Dabos, P., Ranocha, P., Marco, Y., Jauneau, A., & Goffner, D (2012) Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: Focus at the plant cell wall In Planta (Vol 236, Issue 5, pp 1419– 1431) Đỗ Tấn Dũng, Nguyễn Tất Thắng, N V T (2011) Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn 32 (Raltonia solanacearum Smith) hại khoai tây vùng Hà Nội - phụ cận biện pháp phòng trừ Du, H., Chen, B., Zhang, X., Zhang, F., Miller, S A., Rajashekara, G., Xu, X., & Geng, S (2017) Evaluation of Ralstonia solanacearum infection dynamics in resistant and susceptible pepper lines using bioluminescence imaging In Plant Disease (Vol 101, Issue 2, pp 272–278) Elke Saile, Jeff A McGarvey, Mark A Schell, and T P D (1997) Role of Extracellular Polysaccharide and Endoglucanase in Root Invasion and Colonization of Tomato Plants by Ralstonia solanacearum Fegan, M., & Hayward, A (2014) Ralstonia solanacearum Race 3, Biovar In Manual of Security Sensitive Microbes and Toxins (pp 807–818) Gandon, S., & , M E Hochberg, R D H and T D (2013) What limits the evolutionary emergence of pathogens? Gavini F, Mergaert J, Beji A, Mielcarek C, Izard D, et al (1989) Transfer of Enterobacter agglomerans (Beijerinck 1888) Ewing and Fife 1972 to Pantoea gen nov as Pantoea agglomerans comb Nov and description of Pantoea dispersa sp Nov Int J Syst Bacteriol Genin S (2010) Molecular traits controlling host rangeand adaptation to plants in Ralstoniasolanacearum.pdf HUGH, R., & LEIFSON, E (1953) The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram negative bacteria In Journal of bacteriology (Vol 66, Issue 1, pp 24–26) https://doi.org/10.1128/jb.66.1.2426.1953 Iversen C, Mullane N, McCardell B, Tall BD, Lehner A, et al (2008) Cronobacter gen nov., a new genus to accommodate the biogroups of Enterobacter sakazakii, and proposal of Cronobacter sakazakii gen nov., comb Nov., Cronobacter malonaticus sp Nov., Cronobacter turicensis sp nov., Cronobacter muytjensii sp nov., Cro Izard D, Gavini F, Trinel PA, Lefebvre B, L H (1981) Taxonomic study of enterobacteria belonging or related to Escherichia coli species Jacobs JM, Milling A, Mitra RM, Hogan CS, Ailloud F, Prior P, A C (2013) Ralstonia solanacearum Requires PopS, an Ancient AvrE-Family Effector, for Virulence and To Overcome Salicylic Acid-Mediated Defenses during Tomato Pathogenesis Jacques Vasse, Pascal Frey, and A T (1995) Microscopic studies of intercellular Infection and Protoxylem Ivasion of Tomato Roots by Pseudomonas solanacearum Jiang, G., Wei, Z., Xu, J., Chen, H., Zhang, Y., She, X., Macho, A P., Ding, W., & Liao, B (2017) Bacterial wilt in China: History, current status, and future perspectives In Frontiers in Plant Science (Vol 8) Kang Y, Saile E, Schell MA, D T (1999) Quantitative Immunofluorescence of 33 Regulated eps Gene Expression in Single Cells of Ralstonia solanacearum Karim, Z., Hossain, M., & Begum, M (2018) Ralstonia solanacearum: A Threat to Potato Production in Bangladesh In Fundamental and Applied Agriculture (Vol 3, Issue 1, p 1) Khodaygan P et al (2012) Bacterial Wetwood Disease Kim, B S., French, E., Caldwell, D., Harrington, E J., & Iyer-Pascuzzi, A S (2015) Bacterial wilt disease: Host resistance and pathogen virulence mechanisms In Physiological and Molecular Plant Pathology (Vol 95, pp 37–43) Lemessa, F., & Zeller, W (2007) Isolation and characterisation of Ralstonia solanacearum strains from Solanaceae crops in Ethiopia In Journal of Basic Microbiology (Vol 47, Issue 1, pp 40–49) Lopes, C A., & Rossato, M (2018) History and status of selected hosts of the Ralstonia solanacearum species complex causing bacterial wilt in Brazil In Frontiers in Microbiology (Vol 9, Issue JUN) Lou, M M., Jin, G L., Tian, W X., Zhang, G Q., Fan, X Y., Wang, F., Zhu, B., & Xie, G L (2011) Specific and sensitive detection of Enterobacter mori using reliable RT-PCR In Plant Disease (Vol 95, Issue 9, pp 1070–1074) Mai Xuân Cường (2020) Identification phytopathogencausing bacterial wilt on tomato in central VietNam Mansfield, J (2012) Reviewmpp_804 614 629Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology Marie Turner, Alain Jauneau, Ste´phane Genin, Marie-Jose´ Tavella, F V., & Laurent Gentzbittel, and M.-F J (2020) Dissection of Bacterial Wilt on Medicago truncatula Revealed Two Type III Secretion System Effectors Acting on Root Infection Process and Disease Development Miao, L., Shou, S., Cai, J., Jiang, F., Zhu, Z., & Li, H (2009) Identification of two AFLP markers linked to bacterial wilt resistance in tomato and conversion to SCAR markers In Molecular Biology Reports (Vol 36, Issue 3, pp 479–486) Mihovilovich, E., Lopes, C A., Gutarra, L., Bonierbale, M., Linqvist-Kreuze, H., Aley, P., & Priou, S (2017) Protocol for assessing bacterial wilt resistance in greenhouse and field conditions Milling, A., Babujee, L., & Allen, C (2011) Ralstonia solanacearum extracellular polysaccharide is a specific elicitor of defense responses in wilt-resistant tomato plants In PLoS ONE (Vol 6, Issue 1) https://doi.org/10.1371/journal.pone Ngọ Văn Ngôn (2015) Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh hại lạc xác định dòng, giống kháng bệnh số tỉnh miền Bắc Việt Nam 34 Pavan ME, Franco RJ, Rodriguez JM, Gadaleta P, Abbott SL, et al (2005) Phylogenetic relationships of the genus Kluyvera: transfer of Enterobacter intermedius Izard et al 1980 to the genus Kluyvera as Kluyvera intermedia comb Nov and reclassification of Kluyvera cochleae as a later synonym of K intermedia Int JSyst EvolM In Analysis (Issue 27) Shiyin Liu, Yingxin Tang, Dechen Wang, N L and J Z (2016) Identification and Characterization of a New Enterobacter Onion Bulb Decay Caused by Lelliottia amnigena in China Supplier, D N S L (n.d.) Môi trường TZC TERGITOL_7_AGAR Tahat & Sijam (20010) Ralstonia_soalancearum_the_bacterial_wilt_causal_agentwith-cover-page- pdf Tans-Kersten J, Huang H, A C (2001) Ralstonia solanacearum Needs Motility for Invasive Virulence on Tomato Thomas, P., & Upreti, R (2014) Significant Effects Due to Peptone in Kelman Medium on Colony Characteristics and Virulence of Ralstonia solanacearum in Tomato In The Open Microbiology Journal (Vol 8, Issue 1, pp 95–113) Tomlinson, D L., Elphinstone, J G., Soliman, M Y., Hanafy, M S., Shoala, T M., ElFatah, H A., Agag, S H., Kamal, M., El-Aliem, M M A., Fawzi, F G., Stead, D E., & Janse, J D (2009) Recovery of Ralstonia solanacearum from canal water in traditional potato-growing areas of Egypt but not from designated Pest-Free Areas (PFAs) In European Journal of Plant Pathology (Vol 125, Issue 4, pp 589–601) Tran, T M., MacIntyre, A., Hawes, M., & Allen, C (2016) Escaping Underground Nets: Extracellular DNases Degrade Plant Extracellular Traps and Contribute to Virulence of the Plant Pathogenic Bacterium Ralstonia solanacearum In PLoS Pathogens (Vol 12, Issue 6) Trương Thị Hồng Hải, Trần Viết Thắng, Nguyễn Thị Thu Thủy, Phạm Thanh Bình, T N H., Tiên, Đ T K., Nga, N T T., & Ba, T T V (2016) Đánh giá khả gây bệnh chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum bước đầu khảo sát ảnh hưởng gốc ghép ớt đến khả chống chịu bệnh héo vi khuẩn ớt sừng điều kiện nhà lưới In Can Tho University Journal of Science: Vol Nông nghiệ (p 241) Yadeta, K A., & Thomma, B P H J (2013) The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens In Frontiers in Plant Science (Vol 4, Issue APR) Yasser E Ibrahim & Naglaa M Balabel & Amgad A Saleh & Nabil S Farag (2019) Determination of differences in Ralstonia solanacearum phylotype II, sequevar forms as related to their colony characteristics on Kelman medium and pathogenesis Yuliar, Yanetri Asi Nion, and K T (2015) Recent Trends in Control Methods for Bacterial Wilt Diseases Caused by Ralstonia solanacearum.pdf Zeiss, D R., Mhlongo, M I., Tugizimana, F., Steenkamp, P A., & Dubery, I A (2019) 35 Metabolomic profiling of the host response of tomato (Solanum lycopersicum) following infection by Ralstonia solanacearum In International Journal of Molecular Sciences (Vol 20, Issue 16) 36 PHỤ LỤC Phụ lục Mối tương quan giá trị OD mật độ tế bào chủng vi khuẩn Lelliottia amnigena qua khoảng thời gian Bảng Gía trị OD mật độ tế bào vi khuẩn L.amnigena Thời gian Gía trị OD Tổng số tế bào đếm Gía trị pha loãng Mật độ tế bào 0,16 347 10-3 52050000 0,1673 376 10-3 56400000 0,1718 385 10-3 57750000 0,1816 396 10-3 59400000 0,1843 398 10-3 59700000 0,1692 377 10-3 56550000 0,1853 401 10-3 60150000 0,2082 202 10-6 60600000 0,2290 213 10-6 63900000 0,3928 235 10-6 70500000 10 0,5344 178 10-9 80100000 11 0,6505 209 10-9 94050000 12 0,8206 212 10-9 95400000 13 0,9217 227 10-9 102150000 14 0,9376 315 10-9 141750000 15 1,2479 331 10-9 148950000 16 1,3562 399 10-9 179550000 37 17 2,0290 717 10-12 430200000 18 1,9361 708 10-12 424800000 19 1,8910 699 10-12 419400000 20 1,9772 711 10-12 426600000 21 1,9936 714 10-12 428400000 22 2,1579 907 10-12 544200000 23 2,1016 869 10-12 521400000 24 2,0843 855 10-12 513000000 Phụ lục Mẫu đất bệnh thực phân lập 38 Hình1 Hình ảnh mẫu sử dụng phân lập 1- Mẫu thu HTX Hòa Ninh (Đất bị nhiễm) 2- Mẫu thu Cẩm Lệ Vegestable Farm (Cây có triệu chứng bệnh) 3- Mẫu thu Rau, củ, Hòa Ninh (Cây có triệu chứng bệnh nhà lưới) 4- Mẫu thu tại Rau, củ, Hòa Ninh (Cây có triệu chứng bệnh bên ngồi nhà lưới) Phụ lục Hình thái khuẩn lạc L.amingena Hình Hình thái khuẩn lạc L.amingena môi trường TTC 39 ... 1.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo xanh giới Vi? ??t Nam 1.2.1 Một số nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo xanh giới 1.2.2 Một số nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo xanh Vi? ??t Nam ... dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh héo xanh vi khuẩn vi khuẩn gây bệnh héo xanh 1.1.1 Bệnh héo xanh vi khuẩn 1.1.2 Vi khuẩn L .amnigena. .. cứu khả gây bệnh vi khuẩn Lelliottia amnigena gây bệnh héo xanh cà chua? ?? Mục tiêu đề tài Xác định khả vi khuẩn L .amnigena gây bệnh héo xanh để phục vụ công tác chẩn đoán bệnh cà chua Ý nghĩa 3.1