CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Đánh giá thời gian và tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh ở một số giống cà chua khác nhau
3.3.1. Thời gian và tỷ lệ héo xanh
Thời gian bắt đầu xuất hiện triệu chứng héo đầu tiên, cho đến khi cây héo rũ hoàn tồn với tỷ lệ được tính tốn, đánh giá biểu thị ở biểu đồ hình 3.6.; 3.7.
Hình 3.6. Thời gian và tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh ở nhóm cà chua trưởng thành.
Kết quả đánh giá thời gian và tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh ở cà chua trưởng thành, từ ngày đầu tiên đến ngày thứ 28 sau lây nhiễm. Nhận thấy: Chủng vi khuẩn L.amnigena
xuất hiện triệu chứng bệnh sớm nhất ở giống khảo sát là Kiwami kể từ ngày thứ 4 sau lây nhiễm với tỷ lệ bệnh 12,5%; tiếp theo là giống cà chua bi sau 5 ngày lây nhiễm với tỷ lệ bệnh 8,3%. Đến ngày thứ 28, kết thúc quá trình theo dõi, ở giống cà chua Kiwami tỷ lệ bệnh vẫn đạt mức cao nhất 62,5%; và thấp hơn ở cà chua Bi đỏ Cherry với tỷ lệ bệnh 54,16%.
Hình 3.7. Thời gian và tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh ở nhóm cà chua con.
Kết quả đánh giá thời gian và tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh ở cà chua con. Chủng
L.amnigena xuất hiện triệu chứng bệnh sớm nhất ở giống khảo sát là Kiwami kể từ ngày
thứ 3 sau lây nhiễm với tỷ lệ bệnh 16,67%; tiếp theo là giống cà chua bi sau 4 ngày lây 0 10 20 30 40 50 60 70 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 T L B (% ) Time (Ngày) L.a-Kiwami L.a-Bi 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 TL B (% ) Time (ngày) L.a-Kiwami L.a-Bi
nhiễm với tỷ lệ bệnh 16,67%. Và cây chết hoàn toàn từ ngày thứ 8 ở cà chua Kiwami, ngày thứ 10 ở cà chua Bi đỏ Cherry.
Từ kết quả biểu thị trong biểu đồ của 2 nhóm: Cà chua con cà chua trưởng thành, đưa ra nhận định: Độ tuổi của cây và giống cây có ảnh hưởng lớn đến khả năng lây nhiễm của vi khuẩn L.amnigena. Cụ thể, tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh ở giống Kiwami là
nhanh và nhiều hơn so với giống cà chua bi với số lượng cây chết ở nhóm cây con nhiều hơn nhóm cà chua trưởng thành.
Giải thích cho kết quả này, dựa trên nghiên cứu của Hayward, 1991, ông đưa ra nhận định: Tốc độ và mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng xuất hiện của mầm bệnh có liên quan đến độ tuổi, thể trạng và tình trạng dinh dưỡng của vật chủ, điều kiện môi trường và độc lực của vi khuẩn (A. C. Hayward, 1991).
Kết quả cho thấy: Vi khuẩn L.amnigena và vi khuẩn R.solanacearum phân lập được tại thành phố Đà Nẵng là chủng có độc lực và có khả năng lây nhiễm cho cây cà chua. Và chủng R.solanacearum có độc tính mạnh hơn chủng L.amnigena cần khảo sát, là tác nhân gây bệnh chính, chủ yếu của mầm bệnh HXVK đã được báo cáo trước đây. Đối với cây con, vi khuẩn R.solanacearum có thể xâm nhập vào hệ thống mạch, gây các triệu chứng
héo rũ thông thường với TLB 100% sau 14 ngày lây nhiễm.
So sánh mức độ nhiễm bệnh của 2 giống cà chua: Cà chua Bi đỏ Cherry có khả năng kháng bệnh tốt hơn cà chua Kiwami, với cả 2 nhóm cây trưởng thành và cây con.
L.amnigena có tỷ lệ lây nhiễm trung bình, R.solanacearum cho tỷ lệ nhiễm bệnh nặng (Hình 3.8.; 3.9.).
Kiwami Bi Đỏ Cherry
Ngày thứ 1 - 7 sau lây nhiễm Ngày thứ 1 - 7 sau lây nhiễm
Ngày thứ 8- 14 sau lây nhiễm Ngày thứ 8- 14 sau lây nhiễm
Đối chứng (-): Nước cất Đối chứng (-): Nước cất
Đối chứng (+): R.solanacearum Đối chứng (+): R.solanacearum
Hình 3.8. Tỷ lệ nhiễm qua các các khoảng thời gian khảo sát của Chủng L.amnigena trên
Kiwami Bi Đỏ Cherry
Ngày thứ 6-11 sau lây nhiễm Ngày thứ 9 -17 sau lây nhiễm
Ngày thứ 12- 18 sau lây nhiễm Ngày thứ 18 -20 sau lây nhiễm
Ngày thứ 19- 28 sau lây nhiễm Ngày thứ 21 -28 sau lây nhiễm
Đối chứng (+): R.solanacearum Đối chứng (-): Nước cất
Hình 3.9. Tỷ lệ nhiễm qua các các khoảng thời gian khảo sát của Chủng L.amnigena trên
3.3.2. Tái phân lập vi khuẩn và xác định tác nhân gây HXVK
Để khẳng định các giống cây thực hiện khảo sát chết là do độc tính của vi khuẩn lây nhiễm, cần thực hiện tái phân lập từ cây có triệu chứng héo xanh (Hình 3.10.). Vi khuẩn gây bệnh héo xanh được phân lập từ cây được xử lý khử trùng, với quy trình phân lập trên mơi trường TTC có bổ sung 0,5mg Pennicillin.
Hình 3.10. Cây có triệu chứng héo rũ sau lây nhiễm.
D- Cà chua lây nhiễm R.solanacearum. E- Cà chua lây nhiễm L.amnigena.
Sử dụng cây đối chứng (-) (nước cất) thực hiện kiểm chứng các yếu tố lây nhiễm, gây héo khác.
Hình 3.11. Tái phân lập vi khuẩn trên môi trường TTC.
M- Phân lập từ cà chua lây nhiễm R.solanacearum. N- Phân lập từ cà chua lây nhiễm L.amnigena. O- Phân lập từ cây cà chua sử dụng là đối chứng (-).
Kết quả tái phân lập của các chủng vi khuẩn cho thấy: Hình thái khuẩn lạc phân lập được giống với khuẩn lạc ban đầu và chỉ xuất hiện duy nhất một hình thái khuẩn lạc cho
D E
O
phân lập từ cây đối chứng (-), cho kết quả cây đối chứng hồn tồn sạch bệnh, khơng có sự lây nhiễm chéo, khơng có sự nhiễm bẩn từ đất (Hình 3.11.).
Sau khi thu được hình thái khuẩn lạc từ cây tái phân lập, tiến hành nhân nhanh trên môi trường SPA lỏng, tách chiết và chạy phản ứng PCR với đoạn mồi 759/760.
Hình 3.12. Sản phẩm PCR với mồi 759/760.
M: Lader 3000bp; 1: L.amnigena; 2: R.solanacearum
Kết quả cả 2 mẫu đều bắt cặp với mồi 759/760, cho băng xuất hiện ở kích thước khoảng 281bp (Hình 3.12.), tương ứng với kích thước đã thực hiện phản ứng PCR, gửi mẫu định danh. Chứng tỏ, vi khuẩn đã xâm nhập được vào hệ thống bó mạch, cây héo rũ là do nhiễm bệnh HXVK, không do bất kỳ tác nhân ngoại cảnh nào khác.
3.4. Khảo sát mức độ gây bệnh của vi khuẩn L.amnigena trên một số cây trồng nông nghiệp
Liên quan đến mầm bệnh này, nhiều loại cây trồng nông nghiệp cũng chịu ảnh hưởng nghiêm trọng, thiệt hại lớn đến nền kinh tế. Bởi do phạm vi ký chủ rộng trên nhiều loại giống nơng sản như cà tím, khoai tây, ớt… Tính độc, khả năng gây bệnh của vi khuẩn gây ra rất khác nhau tuỳ theo vật chủ và giống cây trồng (Elphinstone JG.;2005). Do đó, tơi tiến hành nghiên cứu khảo sát mức độ gây bệnh của chủng vi khuẩn
L.amnigena trên một số giống cây trồng nơng nghiệp. Thí nghiệm được thực hiện trên
giống cà tím và ớt chỉ thiên được 6 - 7 ngày tuổi, nhằm bước đầu xác định phổ ký chủ của vi khuẩn L.amnigena.
Hình 3.13. Kiểm tra khả năng gây bệnh của L.amnigena gây bệnh héo xanh trên
cà tím và ớt chỉ thiên. A- Cà tím; B- Ớt chỉ thiên
Kết quả không xuất hiện triệu chứng héo nào sau 4 ngảy kể từ lúc bắt đầu lây nhiễm ở cả 2 giống nơng sản khảo sát: cà tím và ớt chỉ thiên (Hình 3.13.).
Nghiên cứu của Buddenhagen, 1986 xác định, nhiều loại thực vật vẫn khơng có triệu chứng sau khi nhiễm bệnh và do đó khơng được cơng nhận là vật chủ, tạo điều kiện cho mầm bệnh tồn tại trong quá trình luân canh cây trồng. Kết luận, các loài gây bệnh HXVK rất khác nhau về phạm vi ký chủ (Buddenhagen, 1986). Tác nhân gây bệnh thích nghi với vật chủ của chúng bằng cách cố định liên tiếp các đột biến có lợi, độc lực của chúng có thể bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố, bao gồm cả đặc điểm của vật chủ (Gandon & , M. E. Hochberg, 2013).
Kết luận: Vi khuẩn L.amnigena không gây bệnh trên 2 giống cây trồng nơng
nghiệp: cà tím và ớt chỉ thiên.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Môi trường TTC khơng cịn là mơi trường đặc hiệu cho vi khuẩn gây bệnh HXVK. Mơi trường TTC có bổ sung 0,5 mg Pennicillin là hiệu quả cho q trình phân lập.
Chủng vi khuẩn L.amnigena có độc tính và có khả năng gây bệnh HXVK. Mật độ gây bệnh cao nhất khảo sát được bằng lây nhiễm nhân tạo là 108.
Mức độ gây bệnh phụ thuộc vào độ tuổi, giống cây.
Tìm ra được tác nhân gây bệnh HXVK cho cây cà chua trên địa bàn thành phố Đà Nẵng là R.solanacearum.
Tiến triển bệnh HXVK sau khi lây nhiễm: Triệu chứng bệnh bắt đầu biểu hiện ở mức cao nhất sau 6 ngày sau lây nhiễm. Giống Kiwami có tốc độ tiến triển bệnh nhanh nhất, ln ở mức cao nhất với các chủng vi khuẩn.
Tính kháng của các giống đối với bệnh HXVK: So sánh mức độ nhiễm bệnh của 2 giống cà chua, kết quả cho thấy: Cà chua Bi đỏ Cherry có khả năng kháng bệnh tốt hơn cà chua Kiwami, với cả 2 nhóm cây trưởng thành và cây con. L.amnigena có tỷ lệ lây nhiễm trung bình, R.solanacearum cho tỷ lệ nhiễm bệnh nặng.
2. Kiến nghị
Tối ưu thêm quy trình phân lập với nhiều loại kháng sinh hơn, ngoài pennicillin, bổ sung thêm các loại kháng sinh: Polymycin B sultfat, Bacitraxin, Chloramphenicol, nhằm tiêu diệt tất cả vi khuẩn nội sinh, rút ngắn thời gian cho quy trình phân lập.
Tiếp tục nghiên cứu khả năng lây nhiễm của vi khuẩn L.amnigena trong thời gian
dài hơn với số lượng cây lớn hơn.
Thực hiện lây nhiễm nhân tạo bằng một số phương pháp cắt rễ, gây tổn thương vùng rễ. So sánh với phương pháp lây nhiễm thông thường, tự nhiên với việc tưới sinh khối quanh bề mặt rễ.
Kết hợp lây nhiễm nhân tạo cả 2 chủng vi khuẩn R.solanacearum và L.amnigena để đánh giá mối quan hệ giữa 2 chủng khi cùng xâm lấn vào một vật chủ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. C. Hayward. (1991). Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by pseudomonas solanacearum. In Distribution (pp. 65–87).
Aley, E., & Elphinstone, J. (1995). Culture media for Ralstonia solanacearum isolation, identification and maintenance. In Fitopatologia (Vol. 30, pp. 126–130).
Asakura, H., Makino, S. I., Kobori, H., Watarai, M., Shirahata, T., Ikeda, T., & Takeshi, K. (2001). Phylogenetic diversity and similarity of active sites of Shiga toxin (Stx) in Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) isolates from humans and animals. In Epidemiology and Infection (Vol. 127, Issue 1, pp. 27–36).
Aslam, M., & Mukhtar, T. (2018). Distributional variability of bacterial wilt of chili incited by Ralstonia solanacearum in eight agro-ecological zones of Pakistan.
Beth L. Dalsing, C. A. (2014). Nitrate Assimilation Contributes to Ralstonia solanacearum Root Attachment, Stem Colonization, and Virulence.
Boshou, T. Y. and L. (1990). General Aspects of Groundnut Bacterial Wilt in China. Brady, C., Cleenwerck, I., Venter, S., Coutinho, T., & De Vos, P. (2013). Taxonomic
evaluation of the genus Enterobacter based on multilocus sequence analysis (MLSA): Proposal to reclassify E. nimipressuralis and E. amnigenus into Lelliottia gen. nov. as Lelliottia nimipressuralis comb. nov. and Lelliottia amnigena comb. nov., . In Systematic and Applied Microbiology (Vol. 36, Issue 5, pp. 309–319). CHAPMAN, G. H. (1951). A culture medium for detecting and confirming Escherichia
coli in ten hours. In American journal of public health and the nation’s health (Vol.
41, Issue 11 Pt 1, p. 1381).
Chaudhry, Z., & Rashid, H. (2011). Isolation and characterization of Ralstonia solanacearum from infected tomato plants of Soan Skesar valley of Punjab. In
Pakistan Journal of Botany (Vol. 43, Issue 6, pp. 2979–2985).
Dalsing BL, Truchon AN, Gonzalez-Orta ET, Milling AS, A. C. (2015). Ralstonia solanacearum Uses Inorganic Nitrogen Metabolism for Virulence, ATP Production, and Detoxification in the Oxygen-Limited Host Xylem Environment.
Davin-regli, A., & Lavigne, J. (2019). Enterobacter spp .: Update on Taxonomy , Clinical Aspects , and (Vol. 32, Issue 4, pp. 1–32).
Digonnet, C., Martinez, Y., Denancé, N., Chasseray, M., Dabos, P., Ranocha, P., Marco, Y., Jauneau, A., & Goffner, D. (2012). Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: Focus at the plant cell wall. In Planta (Vol. 236, Issue 5, pp. 1419–
1431).
(Raltonia solanacearum Smith) hại cây khoai tây vùng Hà Nội - phụ cận và biện pháp phòng trừ.
Du, H., Chen, B., Zhang, X., Zhang, F., Miller, S. A., Rajashekara, G., Xu, X., & Geng, S. (2017). Evaluation of Ralstonia solanacearum infection dynamics in resistant and susceptible pepper lines using bioluminescence imaging. In Plant Disease (Vol. 101, Issue 2, pp. 272–278).
Elke Saile, Jeff A. McGarvey, Mark A. Schell, and T. P. D. (1997). Role of Extracellular
Polysaccharide and Endoglucanase in Root Invasion and Colonization of Tomato Plants by Ralstonia solanacearum.
Fegan, M., & Hayward, A. (2014). Ralstonia solanacearum Race 3, Biovar 2. In Manual of Security Sensitive Microbes and Toxins (pp. 807–818).
Gandon, S., & , M. E. Hochberg, R. D. H. and T. D. (2013). What limits the evolutionary
emergence of pathogens?
Gavini F, Mergaert J, Beji A, Mielcarek C, Izard D, et al. (1989). Transfer of Enterobacter agglomerans (Beijerinck 1888) Ewing and Fife 1972 to Pantoea gen. nov. as Pantoea agglomerans comb. Nov. and description of Pantoea dispersa sp. Nov. Int J Syst Bacteriol.
Genin S. (2010). Molecular traits controlling host rangeand adaptation to plants in Ralstoniasolanacearum.pdf.
HUGH, R., & LEIFSON, E. (1953). The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram negative bacteria. In Journal
of bacteriology (Vol. 66, Issue 1, pp. 24–26). https://doi.org/10.1128/jb.66.1.24-
26.1953
Iversen C, Mullane N, McCardell B, Tall BD, Lehner A, et al. (2008). Cronobacter gen.
nov., a new genus to accommodate the biogroups of Enterobacter sakazakii, and proposal of Cronobacter sakazakii gen. nov., comb. Nov., Cronobacter malonaticus sp. Nov., Cronobacter turicensis sp. nov., Cronobacter muytjensii sp. nov., Cro.
Izard D, Gavini F, Trinel PA, Lefebvre B, L. H. (1981). Taxonomic study of enterobacteria belonging or related to Escherichia coli species.
Jacobs JM, Milling A, Mitra RM, Hogan CS, Ailloud F, Prior P, A. C. (2013). Ralstonia
solanacearum Requires PopS, an Ancient AvrE-Family Effector, for Virulence and To Overcome Salicylic Acid-Mediated Defenses during Tomato Pathogenesis.
Jacques Vasse, Pascal Frey, and A. T. (1995). Microscopic studies of intercellular Infection and Protoxylem Ivasion of Tomato Roots by Pseudomonas solanacearum.
Jiang, G., Wei, Z., Xu, J., Chen, H., Zhang, Y., She, X., Macho, A. P., Ding, W., & Liao, B. (2017). Bacterial wilt in China: History, current status, and future perspectives. In
Frontiers in Plant Science (Vol. 8).
Regulated eps Gene Expression in Single Cells of Ralstonia solanacearum.
Karim, Z., Hossain, M., & Begum, M. (2018). Ralstonia solanacearum: A Threat to Potato Production in Bangladesh. In Fundamental and Applied Agriculture (Vol. 3,
Issue 1, p. 1).
Khodaygan P et al. (2012). Bacterial Wetwood Disease.
Kim, B. S., French, E., Caldwell, D., Harrington, E. J., & Iyer-Pascuzzi, A. S. (2015). Bacterial wilt disease: Host resistance and pathogen virulence mechanisms. In
Physiological and Molecular Plant Pathology (Vol. 95, pp. 37–43).
Lemessa, F., & Zeller, W. (2007). Isolation and characterisation of Ralstonia solanacearum strains from Solanaceae crops in Ethiopia. In Journal of Basic Microbiology (Vol. 47, Issue 1, pp. 40–49).
Lopes, C. A., & Rossato, M. (2018). History and status of selected hosts of the Ralstonia solanacearum species complex causing bacterial wilt in Brazil. In Frontiers in Microbiology (Vol. 9, Issue JUN).
Lou, M. M., Jin, G. L., Tian, W. X., Zhang, G. Q., Fan, X. Y., Wang, F., Zhu, B., & Xie, G. L. (2011). Specific and sensitive detection of Enterobacter mori using reliable RT-PCR. In Plant Disease (Vol. 95, Issue 9, pp. 1070–1074).
Mai Xuân Cường. (2020). Identification phytopathogencausing bacterial wilt on tomato in central VietNam.
Mansfield, J. (2012). Reviewmpp_804 614..629Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.
Marie Turner, Alain Jauneau, Ste´phane Genin, Marie-Jose´ Tavella, F. V., & Laurent Gentzbittel, and M.-F. J. (2020). Dissection of Bacterial Wilt on Medicago truncatula Revealed Two Type III Secretion System Effectors Acting on Root Infection Process and Disease Development.
Miao, L., Shou, S., Cai, J., Jiang, F., Zhu, Z., & Li, H. (2009). Identification of two AFLP markers linked to bacterial wilt resistance in tomato and conversion to SCAR markers. In Molecular Biology Reports (Vol. 36, Issue 3, pp. 479–486).
Mihovilovich, E., Lopes, C. A., Gutarra, L., Bonierbale, M., Linqvist-Kreuze, H., Aley, P., & Priou, S. (2017). Protocol for assessing bacterial wilt resistance in greenhouse
and field conditions.
Milling, A., Babujee, L., & Allen, C. (2011). Ralstonia solanacearum extracellular polysaccharide is a specific elicitor of defense responses in wilt-resistant tomato plants. In PLoS ONE (Vol. 6, Issue 1). https://doi.org/10.1371/journal.pone.
Ngọ Văn Ngôn. (2015). Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam.
Pavan ME, Franco RJ, Rodriguez JM, Gadaleta P, Abbott SL, et al. (2005). Phylogenetic relationships of the genus Kluyvera: transfer of Enterobacter intermedius Izard et al. 1980 to the genus Kluyvera as Kluyvera intermedia comb. Nov. and reclassification of Kluyvera cochleae as a later synonym of K. intermedia. Int JSyst EvolM. In
Analysis (Issue 27).
Shiyin Liu, Yingxin Tang, Dechen Wang, N. L. and J. Z. (2016). Identification and