CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và định danh các vi khuẩn gây bệnh héo xanh từ vùng trồng cây cà chua tạ
chua tại thành phố Đà Nẵng
Thực hiện bước phân lập ban đầu với môi trường đặc hiệu TTC gồm các mẫu thu được tại các tọa độ, vị trí địa lý ở Bảng 2.1. Kết quả nghiên cứu phân lập và định danh vi khuẩn thu được 6 loài thuộc chi Bacillus và chi Ralstonia (Bảng 3.1.).
Bảng 3.1. Kết quả nhuộm gram và định danh vi khuẩn.
Mẫu Loài Đặc điểm khuẩn lạc Kết quả nhuộm Gram Địa điểm thu mẫu
Đất Bacillus amylo-
liquefaciens
Khuẩn lạc khô, bề mặt gồ ghề, chia 2 vùng: vùng trung tâm có màu đỏ đậm, vùng viền ngồi có màu phớt hồng, khơng đều.
Vi khuẩn Gram(+), hình que
Hịa Ninh – Đà Nẵng
Rễ Bacillus sp. Khuẩn lạc khô, bề mặt gồ ghề,
chia 2 vùng: vùng trung tâm có màu đỏ đậm, vùng viền ngồi có màu phớt hồng, kích thước khuẩn lạc nhỏ hơn Bacillus amyloliquefaciens. Vi khuẩn Gram(+), hình que Hịa Ninh – Đà Nẵng Thân Bacillus velezensis Khuẩn lạc bóng, mềm chia 2 vùng: vùng trung tâm màu hồng đậm, vùng viền trắng nhầy.
Vi khuẩn Gram (+), hình thái vi khuẩn với 2 hình dạng: hình cầu và hình que, có mật độ vi khuẩn hình cầu lớn hơn. Hòa Ninh – Đà Nẵng
IP Ralstonia sp. Khuẩn lạc bóng, mềm, chia 2
vùng: Vùng trung tâm có màu đỏ đậm, vùng viền trắng nhỏ, khuẩn lạc tròn đều. Vi khuẩn Gram(-), hình que Hồ Ninh – Đà Nẵng IIP Serratia rubidaea Khuẩn lạc bóng, mềm chia 3
vùng: Vùng trung tâm hồng nhạt, vùng viền ngoài trắng, có màu đỏ đậm giữa 2 vùng trung tâm và vùng viền ngồi
Vi khuẩn Gram(-), hình que
Cẩm Lệ - Đà Nẵng
IIIP R.solanacearum Khuẩn lạc tròn mềm nhầy, chảy, vùng trung tâm phớt hồng, viền trắng sữa
Vi khuẩn Gram (-), hình thái vi khuẩn với 2 hình dạng: hình cầu và hình que
Hịa Ninh – Đà Nẵng
Việc phân loại được nhiều loại khác nhau trên môi trường TTC, cho thấy rằng môi trường này khơng cịn đặc hiệu với vi khuẩn gây bệnh héo xanh. Nhiều loại khuẩn lạc giống với hình thái khuẩn lạc của Bacillus sp. cũng có khả năng phát triển trên môi trường TTC đã được nghiên cứu và chứng minh là môi trường đặc hiệu cho vi khuẩn gây bệnh héo xanh (Kelman, 1954).
Năm 2014, Pious Thomas & Reshmi Upreti nghiên cứu đánh giá các thành phần môi trường đến sự thay đổi đặc điểm và khả năng gây bệnh của vi khuẩn gây bệnh héo xanh, đã chỉ ra rằng những tác động làm thay đổi đáng về đặc điểm khuẩn lạc, độc lực và phản ứng trong thí nghiệm đối kháng có liên quan đến nguồn thành phần được sử dụng trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn, cụ thể là peptone. Các kết quả của nghiên cứu khẳng định là thành phần mơi trường có ảnh hưởng đến độc lực của mầm bệnh này (Thomas & Upreti, 2014). Một số chủng không gây bệnh được tìm thấy trong q trình phân lập ni cấy, kết luận rằng việc ni cấy trên thạch TTC ít chính xác hơn để xác định vi khuẩn héo xanh, mặc dù phương pháp này ít tốn kém và đơn giản. Điều này là do một số vi khuẩn hoại sinh có hình thái khuẩn lạc tương tự như R.solanacearum, có thể làm giảm
tính chính xác của TTC (Lemessa & Zeller, 2007).
Muối TTC là thuốc nhuộm tetrazolium được sử dụng để phân biệt giữa các hoạt động chuyển hóa và khơng hoạt động. Vi khuẩn phát triển sẽ làm giảm TTC làm cho khuẩn lạc có màu đỏ do sự hình thành Formazan khơng hịa tan bao gồm vi khuẩn nhóm
Enterobacter, Proteus & Pseudomonas (Chapman, 1951; Supplier, n.d.) Do vậy, một số
vi khuẩn hoại sinh thuộc những nhóm vi khuẩn này, có thể xuất hiện dẫn đến việc nhầm lẫn trong q trình phân lập chọn lọc. Để kiểm sốt, giảm thiểu số loại khuẩn lạc, nhằm thuận tiện cho việc chọn lọc vi khuẩn gây bệnh HXVK, đòi hỏi một quy trình phân lập tối ưu hơn là cần thiết.
Bằng việc kết hợp các phương pháp phân lập, nhằm loại bỏ những vi khuẩn hoại sinh, phân lập trên mơi trường TTC có bổ sung TZC (2,3,5- triphenyl tetrazolium chloride); 0,5mg penicillin (Hugh & Leifson, 1953), phân biệt bằng hình thái khuẩn lạc.
Hình 3.1. So sánh hình thái khuẩn lạc trên 2 môi trường TTC.
III- Môi trường TTC cơ bản; IIIP- Mơi trường TTC có bổ sung 0,5 mg Pennicillin
IIIP III
Kết quả phân lập trên mơi trường TTC có bổ sung 0,5 mg Pennicillin, chỉ có duy nhất 1 loại hình thái khuẩn lạc giống với R.solanacearum được mô tả trước đây từ các
nguồn khác nhau đã được chọn (Hình 3.1.).
Thực hiện nhuộm gram nhằm phân biệt các loài vi khuẩn, dựa trên đặc tính hóa lý của thành tế bào.
Hình 3.2. Hình dạng vi khuẩn nhuộm Gram.
Đ- Đất; R- Rễ; T- Thân; IP- Mẫu đất tại HTX Hòa Ninh; IIP- Mẫu thân tại Vegestable Farm Cẩm Lệ; IIIP- Mẫu thân tại Rau, củ, quả sạch Hòa Ninh
Kết quả nhuộm Gram của những chủng phân lập, được chia thành 2 nhóm: Nhóm gram (-) gồm: IP, IIP, IIIP; nhóm gram (+) gồm: Đất, rễ, thân (Hình 3.2.), và nhân nhanh trên môi trường SPA nhằm kiểm tra, xác định bằng phương pháp tách chiết DNA, chạy phản ứng PCR. Kết quả phản ứng PCR với mồi 759/760.
Đ IP T III IIP R
Hình 3.3. Sản phẩm PCR với mồi 16S và mồi 759/760. Sản phẩm PCR với mồi 16S.
1: Đất; 2: Thân; 3: Rễ; 4: IP; 5: IIP; 6: IIIP; M1: Lader 2000bp. Sản phẩm PCR với mồi 759/760; 6: IP; 7: IIP; 8: IIIP; M2: Lader 3000bp
Kết quả chạy phản ứng PCR cho sản phẩm xuất hiện với kích thước khoảng 281bp và mồi 16S với kích thước khoảng 1500bp (Hình 3.3.), phù hợp với nghiên cứu được báo cáo trước đây.