Khóa luận tốt nghiệp ngành y đa khoa xây dựng quy trình phân tích một số đa hình gen n acetyltransferase 2 liên quan đến đáp ứng điều trị isoniazid ở người bệnh lao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC KIỀU HỒNG NHUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ ĐA HÌNH GEN N-ACETYLTRANSFARASE LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ ISONIAZID Ở NGƯỜI BỆNH LAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA Hà Nội – Năm 2019 ac y, VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC an d Ph a rm KIỀU HỒNG NHUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ed ici ne MỘT SỐ ĐA HÌNH GEN N-ACETYLTRANSFARASE LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ ISONIAZID of M Ở NGƯỜI BỆNH LAO Sc ho ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA : QH 2013.Y : PSG.TS Đinh Đoàn Long ThS Phạm Thị Hồng Nhung Co py rig ht @ Khóa Người hướng dẫn Hà Nội – Năm 2019 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma LỜI CẢM ƠN VN U Để hồn thành q trình nghiên cứu khóa luận này, lời xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Đinh Đoàn Long, ThS Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy kinh nghiệm suốt q trình thực khóa luận ac y, hướng dẫn trực tiếp, dạy nhiệt tình, tỉ mỉ truyền đạt cho tơi nhiều kiến thức Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới TS Vũ Thị Thơm – Giảng viên Khoa Y rm Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội - cố vấn khoa học, người thầy tận tâm giúp Ph a đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu, sẵn sàng giải đáp thắc mắc để tơi hồn thành khóa luận Đồng thời, xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Thu Hà, thành viên nhóm nghiên cứu ln tích cực giúp đỡ, dạy nhiều an d q trình thực nghiên cứu phịng thí nghiệm Tôi xin cảm ơn Bộ Khoa học công nghệ Chương trình Newton Fund Việt ed ici ne Nam tài trợ kinh phí cho đề tài nghiên cứu KHCN cấp nhà nước (Mã số HNQT/SPĐP/01.16) PGS.TS Lê Thị Luyến chủ trì, mà nhánh đề tài nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện 74 Trung Ương cung cấp mẫu phẩm phục vụ cho nghiên M cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy cơ, bạn thực tập Phịng thí nghiệm – Bộ mơn Y Dược học sở nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực of nghiên cứu ol Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, toàn thể thầy cô giáo Sc ho Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội cho kiến thức quý báu trình học tập trường Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn yêu thương tới gia đình bạn bè ln bên cạnh, động viên, khích lệ tơi lúc khó khăn Co py rig ht @ trình thực khóa luận Hà Nội, ngày 13 tháng năm 2019 Tác giả Kiều Hồng Nhung PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Vi khuẩn kháng axit (Acid Fast Bacillus) CYP2E1 Cytochrom P450 2E1 ddNTP Dideoxynucleotide DHPLC Sắc kí lỏng cao áp biến tính (Denaturing high performance liquid chromatography) DILI Tổn thương gan thuốc (Drug-induced liver injury) DNA Axit Deoxyribonucleic (Deoxyribo Nucleic Acid) EDTA Chất chống đông Ethylene Diamine Tetra acetic Acid INH Isoniazid NAT1 Gen N-Acetyltransferase NAT2 Gen N- Acetyltransferase NAT2 Enzym N- Acetyltransferase OD Mật độ quang học (Optical Density) PCR Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase chain Reaction) PGx Dược di truyền học (Pharmacogenetics/-nomics) RFLP Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment M ed ici ne an d Ph a rm ac y, AFB Length Polymorphism) Đa hình di truyền đơn nucleotit (Singles nucletotide of SNP ol polymorphisms) Liều điều trị tiêu chuẩn (Standard Treatment Dose) Sc ho STD Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) Co py rig ht @ WHO PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma DANH MỤC CÁC BẢNG VN U Trang Bảng 1 Ảnh hưởng kiểu hình acetyl hóa tới chuyển hóa số thuốc .4 Bảng Một số SNP phổ biến gen NAT2 .7 ac y, Bảng Thành phần điều kiện phản ứng cắt 23 Bảng Thành phần điều kiện phản ứng nhân dòng gen NAT2 27 Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ici ne an d Ph a rm Bảng Kết phân tích kiểu gen tần số đa hình NAT2 30 Bảng 3 Tỷ lệ kiểu hình NAT2 100 người bệnh mắc lao người Việt Nam 30 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma DANH MỤC CÁC HÌNH VN U Trang Hình 1 Một số phản ứng chuyển hóa xúc tác NAT2 Hình Cấu trúc vị trí gen NAT2 nhiễm sắc thể số ac y, Hình Ảnh hưởng mức độ phân tử SNP NAT2 Hình Tỉ lệ mắc bệnh lao số khu vực giới năm 2017 .9 rm Hình Chuyển hóa isoniazid gan 12 Hình Số lượng người gặp tác dụng phụ isoniazid từ 1997-2018 13 Ph a Hình Các bước tiến hành nghiên cứu 20 Hình 2 Nguyên lý tách DNA tổng số kit 21 Hình Trình tự đoạn gen NAT2 nhân dòng để xác định kiểu alen 22 an d Hình Kết dự kiến cắt alen NAT2*5, NAT2*6 NAT2*7 23 Hình Kết DNA tổng điện di gel agarose 1,2% 26 Hình Kết tối ưu phản ứng PCR nhân dòng NAT2 gel agarose 1,5% 27 ed ici ne Hình 3 Kết nhân dòng 10 mẫu nghiên cứu gen NAT2 theo điều kiện tối ưu 28 Hình Phân tích kiểu gen NAT2 dựa vào PCR - RFLP 28 Hình Kết xác định kiểu gen NAT2 BioEdit version 7.1.9 30 M Hình Các tần số phân bố alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12, *13 số vùng khu vực giới 34 Hình Sự phân bố kiểu hình acetyl hóa chậm 99 quần thể giới 35 of Hình Nồng độ INH sau kiểu hình acetyl hóa 36 ol Hình 4 Tỷ lệ tổn thường gan INH gây (INH-DILI) theo thời gian số 172 Co py rig ht @ Sc ho người bệnh 37 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma MỤC LỤC VN U Trang ĐẶT VẤN ĐỀ ac y, CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan enzym N-Acetyltransferase (NAT2) rm 1.2 Tổng quan gen N-Acetyltransferase 1.2.1 Vị trí, cấu trúc vai trị gen NAT2 Ph a 1.2.2 Đa hình gen N-Acetyltransferase 1.3 Đặc điểm chung bệnh lao vai trò isoniazid điều trị lao an d 1.3.1 Đặc điểm chung bệnh lao 1.3.2 Điều trị dự phòng lao 10 ed ici ne 1.3.3 Isoniazid điều trị lao 11 1.3.3.1 Dược lý, chuyển hóa isoniazid 11 1.3.3.2 Độc tính INH với thể 12 M 1.3.4 Gen liên quan đến chuyển hóa isoniazid người 14 1.4 Các nghiên cứu đa hình di truyền NAT2 liên quan đến đáp ứng điều trị isoniazid of người bệnh lao 15 ol 1.5 Các phương pháp phân tích đa hình NAT2 16 Sc ho CHƯƠNG ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 @ 2.1.2 Hóa chất 19 ht 2.1.3 Thiết bị 19 py rig 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Thu mẫu sinh phẩm 21 Co 2.2.2 Tách chiết DNA tổng số 21 2.2.3 Nhân dòng đoạn gen NAT2 PCR 22 2.2.4 Tinh sản phẩm PCR 23 2.2.5 Xác định kiểu gen NAT2 PCR-RFLP 23 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma 2.2.6 Xác định kiểu gen NAT2 phương pháp giải trình tự 24 VN U 2.2.7 Xác định tần số SNP dự đốn kiểu hình acetyl hóa 24 2.3 Đạo đức nghiên cứu 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 ac y, 3.1 Tách chiết DNA tổng số 26 3.2 Nhân dòng đoạn gen NAT2 PCR 26 rm 3.2.1 Tối ưu quy trình PCR 26 Ph a 3.3.2 Nhân dòng gen NAT2 100 mẫu nghiên cứu 27 3.3 Xác định kiểu gen NAT2 PCR-RFLP 28 an d 3.4 Xác định kiểu gen NAT2 giải trình tự 29 3.5 Kết phân bố tần số alen tỷ lệ kiểu gen, kiểu hình NAT2 30 CHƯƠNG BÀN LUẬN 32 ed ici ne 4.1 Tối ưu hóa quy trình phân tích đa hình di truyền NAT2 32 4.1.1 Phương pháp PCR-RFLP 32 4.1.2 Phương pháp giải trình tự 32 M 4.2 Về đa hình di truyền NAT2 33 of 4.2.1 Tần số alen tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa 33 4.2.2 Về mối liên quan NAT2 số bệnh khác 39 ol KẾT LUẬN 40 Sc ho KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Co py rig ht @ PHỤ LỤC PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lao vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis bệnh nhiễm ac y, trùng mạn tính phổ biến người Bệnh gây nên triệu chứng chủ yếu đường hô hấp, ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe sống người bệnh Theo công bố Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam đứng thứ 16/30 nước có 124.000 người 12.840 người tử vong lao [40] rm gánh nặng bệnh lao cao giới với số lượng người mắc năm 2017 Ph a Sau chẩn đoán mắc bệnh lao, người bệnh thường điều trị theo phác đồ Chương trình Chống lao Quốc gia [1] Theo thuốc chống lao hàng gồm có thuốc: Isoniazid (INH), Rifampicin, Ethambutol, Pyrazinamid, Streptomycin [1] an d Trong đó, Isoniazid thuốc then chốt điều trị dự phòng lao hiệu lực kìm diệt vi khuẩn lao cao Đối với người bệnh lao mắc không đa kháng ed ici ne thuốc, hầu hết đáp ứng điều trị tốt với phác đồ hàng 1, nhiên tỷ lệ gặp phải tác dụng không mong muốn, phần khác thất bại điều trị Nhiều trường hợp điều trị thất bại gặp tác dụng phụ số nghiên cứu giới trước liên quan đến đột biến gen N- Acetyltransferase (NAT2) gây kiểu hình acetyl hóa chậm Tùy vào vị trí đột biến mà làm biến đổi hoạt tính, cấu M trúc độ bền enzym làm ảnh hưởng đến khả chuyển hóa isoniazid thuốc of chuyển hóa NAT2 hydralazin, procainamid, aminoglutethimid, sufasalazin, nitrazepam, dapson [24] Kiểu gen NAT2 quy định kiểu hình acetyl hóa với kiểu ol hình acetyl hóa acetyl hóa nhanh, acetyl hóa trung bình acetyl hóa chậm [44] Sc ho Một số nghiên cứu chứng minh, người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm có nguy tổn thương gan, gặp tác dụng phụ tỉ lệ thất bại điều trị với thuốc chuyển hóa NAT2 cao kiểu hình cịn lại [23, 46] NAT2 ngồi liên quan đến chuyển hóa số thuốc nêu trên, cịn đóng vai trị quan trọng chuyển hóa @ số hợp chất gây ung thư Một số nghiên cứu liên quan kiểu hình ht acetyl hóa nguy ung thư vú, ung thư bàng quang, ung thư đại trực tràng [10, 35] py rig Trong đột biến liên quan đến kiểu hình acetyl hóa, alen NAT2*5 (c.341T>C), NAT2*6 (c.590G>A), NAT2*7 (c.857G>A), NAT2*11 (c.481C>T), NAT2*12 (c.803G>A), NAT2*13 (c.282C>T) ghi nhận phổ biến nghiên Co cứu nhiều số quần thể giới [36, 37] Việc xác định đột biến gen NAT2 nhằm tìm hiểu mối liên quan biến đổi di truyền đáp ứng thuốc giúp bác sĩ lâm sàng cân nhắc điều chỉnh liều điều trị INH, hạn chế tác dụng phụ thuốc, qua nâng cao hiệu điều trị cho người bệnh Đây xu PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma hướng tối ưu hóa điều trị theo cá thể, tích hợp xét nghiệm di truyền phác đồ điều trị phát triển mở rộng ứng dụng nhanh chóng giới Tuy vậy, VN U Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng quy trình phân tích kiểu gen NAT2 vào ac y, thực hành lâm sàng bắt đầu Từ nhu cầu lâm sàng tính cấp thiết việc tích hợp xét nghiệm gen NAT2 liệu trình chẩn đốn, điều trị người bệnh mắc lao, nhóm nghiên cứu chúng tơi tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình phân tích số đa hình gen N-acetyltransferase liên quan đến đáp ứng điều trị isoniazid rm người bệnh lao” với mục tiêu nội dung nghiên cứu sau: Mục tiêu nghiên cứu: Ph a - Xây dựng quy trình phân tích số đa hình di truyền gen NAT2 an d người bệnh mắc lao Việt Nam - Áp dụng quy trình tối ưu để bước đầu đánh giá mức độ đa hình di truyền gen NAT2 100 mẫu người bệnh lao Việt Nam Nội dung nghiên cứu: ed ici ne - Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dịng đoạn gen mã hóa enzym NAT2 - Xác định kiểu gen NAT2 phương pháp PCR-RFLP giải trình tự - Khảo sát tần số kiểu gen tần số alen liên quan đến đa hình SNP gồm NAT2*5 (c.341T>C), NAT2*6 (c.590G>A), NAT2*7 (c.857G>A), NAT2*11 Co py rig ht @ Sc ho ol of tham gia nghiên cứu M (c.481C>T), NAT2*12 (c.803G>A), NAT2*13 (c.282C>T) nhóm người bệnh PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan enzym N-Acetyltransferase (NAT2) VN U 1.1 Như biết, hiệu lực nhiều loại thuốc chất ngoại lai từ mơi trường tới thể ngồi việc phụ thuộc vào chế truyền tin (cơ chế dược lực ac y, học), cịn phụ thuộc vào chuyển hóa thải trừ thuốc thể (các chế dược động học) Trong đường chuyển hóa thải trừ thuốc, acetyl hoá thuốc rm enzym N-Acetyltransferase (NAT, EC 2.3.1.5) [24, 62] chế chuyển hoá quan trọng giúp thể tránh khỏi phản ứng khích với thuốc chất độc Ph a hại từ môi trường Nhiều loại thuốc hóa chất thể NAT chuyển thành chất không độc loại khỏi thể, có chất có khả gây ung thư gây độc cho thể [14] NAT enzym xúc tác phản ứng acetyl hóa, qua an d có xu hướng chuyển chất gây độc cho thể thành chất khơng độc NAT xúc tác phản ứng gồm N-Acetyl hóa, O-Acetyl hóa N,O-Acetyl hóa, ed ici ne N-acetyl hóa (Hình 1.1) đường hiệu thực biến đổi sinh học hợp chất amin thơm, hydralazin số chất gây ung thư [14] NAT người bao gồm loại N-Acetyltransferase (NAT1) N-Acetyltransferase (NAT2) Enzym NAT1 có vai trị chuyển hóa hợp chất folat, M NAT2 đóng vai trị quan trọng chuyển hóa số hợp chất amin thơm dị vòng isoniazid (một loại thuốc chống lao), hydralazin endralazin (thuốc điều trị tăng huyết áp), procainamid (thuốc điều trị loạn nhịp tim), aminoglutethimid ( of chất ức chế tổng hợp hormon tuyến thượng thận), nitrazepam (thuốc an thần) ol dapson (thuốc điều trị bệnh phong) (Bảng 1.1) [24] Sc ho NAT2 phân bố chủ yếu gan, phần ruột non đại tràng NAT1 có hầu hết mơ thể [14] Các gen mã hóa hai protein có khung đọc mở dài 870 bp nhánh ngắn (vùng 22) nhiễm sắc thể số (vùng @ 8p22) [54] Các biến thể di truyền gen NAT1 NAT2 định kiểu hình acetyl hóa cá thể ảnh hưởng đến đáp ứng với nhiều thuốc chất có nguy ht gây ung thư Tùy vào trình tự nucleotid NAT2 cá thể mà phân chia ba nhóm kiểu hình acetyl hóa nhanh, trung bình chậm [15] Mối liên py rig quan kiểu hình acetyl hóa (được định NAT2) nguy mắc bệnh khác báo cáo từ nhiều năm Năm 1960, lần đa hình NAT2 nghiên cứu liên quan đến chuyển hóa isoniazid, sau nghiên cứu Co chứng minh liên quan đến thuốc khác đưa nhiều hơn, ngày chứng minh tầm quan trọng NAT chế giải độc thể [12] PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U ac y, rm Ph a an d Hình 1 Một số phản ứng chuyển hóa xúc tác NAT2 [14] Kiểu hình acetyl hóa Chậm Sulphamethoxazol Chậm Hydralazin Chậm Nhanh ol Chậm Tăng mẫn cảm Liên quan đến lupus ban đỏ hệ thống Giảm hiệu điều trị Chậm Tăng phản ứng không mong muốn Chậm Gây độc với gan, gây buồn nôn, nôn Procainamid Chậm Liên quan đến lupus ban đỏ hệ thống ht Ảnh hưởng đến phenytoin rifampicin Phenelzin Nhanh Giảm đáp ứng điều trị py rig Sc ho Isoniazid Ảnh hưởng Gây độc hệ thần kinh of Dapson M Tên thuốc ed ici ne Bảng 1 Ảnh hưởng kiểu hình acetyl hóa tới chuyển hóa số thuốc [24] p- Phenylenediamin Chậm Gây viêm da tiếp xúc Ctrimoxazol @ Sulphasalazin Sự tiếp xúc với chất độc hại từ thực phẩm từ mơi trường làm việc Co (như khói thuốc lá, hóa chất có chứa benzen ) làm người dễ mắc số bệnh, đặc biệt ung thư Và kiểu hình acetyl hóa làm tăng giảm nguy mắc ung thư cá thể có phơi nhiễm Nguy khác kiểu hình PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma acetyl hóa nhanh chậm nghiên cứu chứng minh với số bệnh như: ung thư bàng quang, ung thư đại tràng, ung thư vú, bệnh lupus ban đỏ hệ thống [14], VN U bệnh Parkinson Alzheimer [11] Đối với chuyển hóa thuốc, tính đa hình di truyền NAT2 phát lần người bệnh lao điều trị isoniazid [47] Các nghiên cứu sau chứng minh mối liên quan kiểu hình acetyl hóa ac y, chuyển hóa isoniazid, từ đưa phác đồ điều trị phù hợp cho kiểu hình nhằm hạn chế tối đa ảnh hưởng không tốt isoniazid lên thể Tổng quan gen N-Acetyltransferase rm 1.2 1.2.1 Vị trí, cấu trúc vai trò gen NAT2 Ph a Gen NAT2 vai ngắn nhiễm sắc thể số (vùng 8p22) mã hóa enzym an d arylamine N-Acetyltransferase Gen NAT2 gồm hai exon, exon (khơng mã hóa protein) dài 100 bp nằm vị trí kb ngược dịng vị trí bắt đầu dịch mã, exon @ Sc ho ol of M ed ici ne (mã hóa protein) khung đọc mở dài 870 bp mơ tả Hình 1.2 [54] Hình Cấu trúc vị trí gen NAT2 nhiễm sắc thể số 8[16] ht Việc xác định đa hình NAT2 quan trọng việc thiết lập khái py rig niệm dược lý học thuốc chuyển hóa NAT2, isoniazid thuốc điển hình Enzym NAT2 có vai trị trung tâm chuyển hóa thuốc này, biến đổi bất thường gen NAT2 gây nhiều ảnh Co hưởng khác cá thể với khả đáp ứng thuốc, tác dụng không mong muỗn thuốc với gia tăng tỷ lệ số bệnh tiếp xúc với yếu tố phơi nhiễm PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma 1.2.2 Đa hình gen N-Acetyltransferase VN U Dự án giải trình tự hệ gen người hoàn thành vào năm 2004 nghiên cứu sau chứng minh DNA hệ gen phần lớn (hơn 7,5 tỷ người) sống khác biệt chủ yếu đa hình thay đơn nucleotit (Singles nucletotide polymorphisms – SNP), loại ʺđột biến điểmʺ khơng dẫn ac y, đến thay axit amin SNP có ý nghĩa quan trọng loại biến dị di truyền phổ biến ổn định Sự biến đổi SNP chung hệ gen coi có ảnh hưởng lớn đến phản ứng người bệnh tật, với nhân tố môi trường rm (như vi khuẩn, vi rút, độc tố hóa chất), thuốc liệu pháp điều trị khác Ph a Sự tiến nghiên cứu di truyền học dược lý học chứng tỏ chất di truyền khác biệt cá thể đáp ứng yếu tố bất lợi môi trường (như chất độc) đáp ứng thuốc SNP giải thích biến đổi hoạt an d động enzym với chuyển hóa thuốc làm tăng giảm độ thải thuốc, qua tác động đến đáp ứng điều trị [38] Mặc dù tác động SNP đến hình thành ed ici ne bệnh tương đối yếu kết hợp chúng làm thay đổi đáng kể nguy gây bệnh Cùng với liên quan đến khả đáp ứng, khả hấp thụ chuyển hóa nhiều thuốc Do có cấu trúc đơn giản, thay đổi nucleotit nên kĩ thuật sinh học phân tử xác định nhanh kiểu gen dự đốn hiệu kiểu gen lên đáp ứng thuốc cá thể Các nhà di truyền y học hy vọng M tương lai hồn thiện đồ SNP có liên quan đến bệnh lý, tiến đến việc giải mã chức gen cá thể giúp tiên lượng nguy mắc bệnh, từ of có lời khun thích hợp vấn đề phòng bệnh điều trị cá thể ol Đa hình NAT2 cho thấy quan điểm lĩnh vực dược lý học, Sc ho đa hình chuyển hóa thuốc ghi nhận tương đối hệ thống nhiều quần thể người [12] Ngay từ năm 1953, nghiên cứu bắt đầu chứng @ minh mối liên quan đa hình NAT2 với hiệu lâm sàng, cụ thể gia tăng tần số mức độ tác dụng phụ thuốc chống lao isoniazid số người bệnh [42] Năm 1960, kết mối liên quan công bố Evan cộng ht [12], đến năm 1965 danh pháp quốc tế gen NAT công bố lần py rig áp dụng toàn giới vào nghiên cứu sau [30] Các nghiên cứu NAT2 có kiểu hình acetyl hóa acetyl hóa nhanh (3 alen nhanh), acetyl hóa trung bình (2 alen nhanh, alen chậm) acetyl hóa chậm (nhiều alen chậm) [15] Hiện nay, nhà di truyền học xác định alen kiểu dại Co hay gọi kiểu alen khơng có đột biến, alen kiểu dại qui ước NAT2*4 Các đột biến dạng SNP xuất đoạn gen xuất đồng thời với đột biến khác gọi halotype hay biến thể di truyền Hiện nay, PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma giới tìm thấy tổng cộng 108 halotype, số halotype tìm chứng minh ảnh hưởng kiểu hình acetyl hóa [5] Một ví dụ VN U điển hình halotype tìm thấy alen NAT2*5, alen gây kiểu hình acetyl hóa chậm Alen xác định có thay axit amin isoleucin thành threonin vị trí c.341T>C , halotypee NAT2*5A xác định có vị trí ac y, xảy thay axit amin c.341T>C c.481C>T [5] Bên cạnh alen kiểu dại NAT2*4 halotype khác NAT2*12A-C, *13A, *18 liên quan đến kiểu hình có liên quan đến kiểu hình acetyl hóa chậm (Phụ lục 1) rm acetyl hóa nhanh halotype NAT2*5A-J, *6A-E, *7, *12D, *14A-G, *17 *19 Kiểu hình acetyl hóa Chậm Ảnh hưởng chức Giảm hoạt tính NAT2 Arg197Gln Chậm ed ici ne Ph a Bảng Một số SNP phổ biến gen NAT2 [31, 38, 56] Chậm Giảm độ bền NAT2 Giảm hoạt tính NAT2 Leu161Leu Nhanh Không gây biến đổi Arg268Lys Nhanh Không gây biến đổi Nhanh Khơng gây biến đổi Mã tra cứu Vị trí Axit amin thay NAT2*5 rs1801280 341T>C Ile114Thr NAT2*6 rs1799930 590G>A NAT2*7 rs1799931 857G>A Gly286Glu NAT2*11 rs1799929 481C>T NAT2*12 rs1208 803A>G NAT2*13 rs1041983 282C>T M an d Alen Tyr94Tyr of Trong đa hình gây kiểu hình acetyl hóa chậm, alen NAT2*5, *6, *7 nghiên cứu nhiều nhất, tỷ lệ đột biến vị trí tìm thấy nhiều ol hẳn vị trí khác, đồng thời ảnh hưởng SNP rõ ràng [19] Sc ho Tuy nhiên, nghiên cứu sử dụng alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12, *13 dùng phổ biến (Bảng 1.2) [5, 41], đặc biệt nghiên cứu có sử dụng phương pháp giải trình tự Đối với kiểu hình dựa SNP, nhóm cá thể có kiểu hình @ acetyl hóa nhanh có kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại vị trí SNP (T341C, G590A, G857A) Các cá thể có kiểu hình acetyl hóa trung bình có kiểu gen dị hợp tử alen ht đột biến vị trí NAT2*5, *6 *7 Những người acetyl hóa chậm py rig người có alen đột biến SNP Tuy nhiên, nghiên cứu vị trí địa lý khác giới cho kết tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa có khác biệt quốc gia vùng địa lý Đối với kiểu hình SNP, xác định kiểu hình Từ năm 2009 ứng dụng web Co acetyl hóa cho xác NAT2PRED (của tác giả Igor B Kuznetsov) cho phép xác định kiểu hình acetyl hóa thơng qua kiểu gen vị trí NAT2 *5, *6, *7, *11, *12, *13 Trên báo cơng bố web NAT2PRED có tỷ lệ khác biệt kiểu hình dựa SNP SNP, PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma khác biệt khơng lớn, việc xác định kiểu hình dựa SNP ưu VN U tiên [31, 65] Một số vị trí đột biến thay gây kiểu hình acetyl hóa chậm biểu thi Hình 1.3 Alen đột biến NAT2*5 (c.341T>C) làm thay isoleucin vị trí 114 thành threonin gây giảm hoạt tính enzym, nhiên đột biến xác định ac y, RFLP Vì vậy, hầu hết nghiên cứu phân tích alen c.481C>T (là đột biến câm liên kết với c.341) biến thể đại diện NAT2*5, xảy đột M ed ici ne an d Ph a rm biến vị trí c.481 xảy đột biến NAT2*5 ngược lại [38, 58] of Hình Ảnh hưởng mức độ phân tử SNP NAT2 [56] Hình 3D ol NAT2 SNP phổ biến xác định kiểu hình acetyl hóa gồm NAT2*5 (Ile114Thr,vị trí số 2), NAT2*6 (Arg197Gln, vị trí số 7), NAT2*7 (Gly286Glu,vị trí số 10) Sc ho NAT2*12 (Arg268lys, vị trí số 8) Đột biến alen NAT2*6 (c.590G>A) dẫn đến làm giảm độ bền NAT2 thay axit amin Arginin Glycin Đột biến alen NAT2*7 (c.857G>A) làm biến @ đổi cấu hình lập thể trung tâm xúc tác enzym qua làm giảm hoạt tính ht enzym Các SNP vị trí dẫn đến thay đổi hoạt độ, độ ổn định, lực enzym NAT2 với chất, hậu gây biến đổi nồng độ hợp chất py rig không tốt thể gây biểu lâm sàng [50] Các halotype NAT2*11A, NAT2*12A NAT2*13A gây kiểu hình acetyl hóa nhanh cho khơng ảnh hưởng đến hoạt tính enzym NAT2, nhiên xuất alen Co nhanh nàycó thể liên quan đến tăng giảm số chất chuyển hóa thuốc khác Các nghiên cứu trước đặc điểm chức đa hình NAT2 cho thấy chế phân tử khác kiểu hình acetyl hóa chậm, cuối gây giảm biểu PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma protein mRNA protein NAT2 Đặc biệt có diện NAT2*5B, 1.3 VN U NAT2*6D NAT2*14G [8, 57] Đặc điểm chung bệnh lao vai trò i soniazid điều trị lao 1.3.1 Đặc điểm chung bệnh lao ac y, Bệnh lao người vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn kháng cồn kháng axit (Acid fast bacilli, AFB) gây ra, chủ yếu vi khuẩn lao người (Mycobacterium tuberculosis hominis) Đây nguyên nhân hàng HIV/AIDS (Human Immuno-deficiency Virus/ rm đầu gây tử vong tồn giới [2] Thêm vào đó, xuất đại dịch Acquired Immuno Deficiency Ph a Syndrom, Vi rút gây Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải người làm cho bệnh lao bùng phát trở lại đáng sợ hơn, đặc biệt năm cuối kỉ an d XX tỷ lệ người mắc chết lao gia tăng mạnh mẽ Năm 1993, WHO tuyên bố tình trạng khẩn cấp tồn cầu bệnh lao mối hiểm họa kháng thuốc tương lai Trong công bố WHO dịch tễ lao, năm 2017 có 10 triệu người mắc bệnh lao ed ici ne với 1,3 triệu người tử vong lao, số khu vực vùng lãnh thổ có tỷ lệ mắc cao, đặc biệt khu vực Châu Phi đồ phân bố Hình 1.4 Trong số ca tử vong năm 2017, có khoảng 1,3 triệu người âm tính với HIV 300.000 người dương tính với HIV [40] Năm 2017 Việt Nam có 124.000 người mắc M với 12.840 ca tử vong lao Hiện tại, Việt Nam xếp thứ 16/30 nước Sc ho ol kháng thuốc [40] of có gánh nặng bệnh lao cao giới thứ 13/30 nước có gánh nặng bệnh lao đa ht @ Việt Nam Co py rig Số ca mắc Hình Tỉ lệ mắc bệnh lao số khu vực giới năm 2017 [64] PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Bệnh lao diễn biến qua giai đoạn nhiễm lao lao bệnh Vi khuẩn lao gây bệnh tất phận thể người, phổ biến lao phổi VN U Giai đoạn nhiễm lao xảy vi khuẩn xâm nhập lần vào thể chưa tiếp xúc với lao Vi khuẩn lao xâm nhập vào thể chủ yếu qua đường hô hấp vào tận phế nang gây tổn thương viêm phế nang, sau khoảng tuần đến tháng tác ac y, động vi khuẩn lao, thể có chuyển biến mặt sinh học, hình thành dị ứng miễn dịch với vi khuẩn lao Người bị lây tình trạng nhiễm lao, lúc thể người bị nhiễm có kháng thể kháng lao phản ứng Tuberculin dương tính rm Đa số người bị bệnh tình trạng nhiễm lao (khoảng 80% - 90%) không chuyển sang giai đoạn lao bệnh Khoảng 10% -20% người nhiễm lao chuyển sang giai đoạn Ph a bệnh lao sức đề kháng thể giảm, số lượng độc tính vi khuẩn tăng bệnh mạn tính, bệnh tồn thân khác [3] an d Đặc biệt người thuộc nhóm suy giảm miễn dịch HIV/AIDS có Vi khuẩn lao quan phận gây nên triệu chứng thuộc ed ici ne quan phận Do triệu chứng giai đoạn sớm thường khó phát hiện, bệnh phát có biểu rõ ràng Các triệu chứng hay gặp triệu chứng toàn thân triệu chứng thuộc đường hô hấp như: da xanh xao, người mệt mỏi, ăn kém, gầy sút cân, ho kéo dài, sốt nhẹ chiều (37 o5 đến 38 o C) kèm mồ hôi ban đêm Tuy nhiên, triệu chứng thường mơ hồ, khó xác định dễ M nhầm với triệu chứng thuộc bệnh khác, bệnh lao chẩn đốn xác định tìm thấy vi khuẩn lao bệnh phẩm (đờm, dịch dày, dịch phế quản) of Các kĩ thuật xác định vi khuẩn lao gồm nhóm kĩ thuật cổ điển đại ol Các kĩ thuật cổ điển gồm: kĩ thuật nhuộm soi trực tiếp Ziehl - Neelsen (còn gọi kĩ thuật nhuộm AFB), phương pháp nuôi cấy, phương pháp tiêm truyền súc vật Nhóm Sc ho kĩ thuật đại gồm: phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain Reaction PCR), phương pháp khuếch đại trực tiếp (Amplified direct test), phản ứng miễn dịch gắn men (Enzym Linked Immunosorbent Assay – ELISA), Xpert/MTB nhiều kĩ @ thuật khác [2, 3] ht 1.3.2 Điều trị dự phòng lao py rig Điều trị lao: Mỗi nước giới có phác đồ điều trị lao riêng, có đặc điểm chung dựa vào chiến lược chống lao WHO khuyến cáo chiến lược DOTS (Directly Observed Treatment Short Course) điều trị hóa trị liệu ngắn ngày có kiểm sốt trực tiếp Dựa DOTS, Chương trình Chống lao Quốc Co gia Việt Nam đưa phác đồ điều trị cho loại bệnh lao Trong lao mắc sử dụng phác đồ I gồm thuốc chống lao hàng isoniazid, rifampicin, streptomycin, pyrazinamid, ethambutol Phác đồ cụ thể sử dụng loại thuốc 10 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma streptomycin, isoniazid, rifampicin, pyrazinamid người lớn rifampicin, isoniazid, pyrazinamid với trẻ em hàng ngày tháng đầu, tháng dùng VN U loại thuốc isoniazid, ethambutol cho người lớn rifampicin, isoniazid cho trẻ em hàng ngày Người bệnh điều trị thuốc lao cần theo dõi đánh giá đáp ứng lâm sàng tác dụng phụ thuốc để điều chỉnh kịp thời Các người bệnh lao AFB ac y, dương tính xét nghiệm đờm vào tháng thứ 2, thứ thứ Điều trị coi thất bại từ tháng thứ xét nghiệm AFB dương tính [1] Dự phòng lao: Vaccin BCG sử dụng dự phòng trường hợp chưa rm nhiễm lao, người bệnh nhiễm lao dự phòng uống INH vịng an d 1.3.3.1 Dược lý, chuyển hóa isoniazid Ph a tháng đến năm để làm giảm tỷ lệ chuyển sang giai đoạn bệnh lao 1.3.3 Isoniazid điều trị lao Isoniazid (còn gọi isonicotinylhydrazid, viết tắt INH), thuốc điều trị bệnh lao Hóa chất tổng hợp Praha năm 1912 đến năm ed ici ne 1952 biết tác dụng INH với vi khuẩn lao INH kìm hãm sinh trưởng diệt vi khuẩn lao tế bào Cơ chế tác dụng thuốc thông qua ức chế hình thành axit mycolic có thành trực khuẩn lao [3] Sau uống, M INH hấp thu qua ruột vào máu: 40% dạng tự do, phần kết hợp với axit amin máu thành hydrazol; INH dạng tự hydrazol có tác dụng với vi khuẩn lao, phần dư thừa lại chuyển hóa gan tạo thành hợp chất khơng có tác dụng of với vi khuẩn lao Tại gan, 50% - 90% INH acetyl hóa enzym NAT2 ol Hình 1.5 tạo thành acetyl isoniazid, sản phẩm tiếp tục bị thủy phân tạo thành acetyl hydrazin Sc ho Một đường khác INH bị thủy phân trực tiếp tạo hydrazin [28] Sau NAT2 xúc tác q trình acetyl hóa hydrazin tạo acetyl hydrazin diacetyl hydrazin Acetyl hydrazin hydrazin bị oxi hóa Cytochrom P450 2E1 tạo @ thành hợp chất trung gian gây độc cho thể [53] Hydrazin chất độc với tế bào gan có khả gây hoại tử tế bào Vì vậy, trường hợp hoạt tính py rig ht NAT2 thấp, hydrazin tăng nồng độ máu đồng thời chuyển hóa chủ yếu theo đường CYP2E1, tạo sản phẩm trung gian gây độc với gan Các chất chuyển hóa INH thải trừ khỏi thể chủ yếu qua hệ tiết niệu (chiếm 80%) [28] Đặc tính dược động học thuốc bị ảnh hưởng yếu tố cụ thể Co người bệnh tình trạng di truyền, tuổi, cân nặng, bệnh kèm thuốc dùng đồng thời với INH 11 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U ac y, rm Ph a an d ed ici ne Hình Chuyển hóa isoniazid gan[61] (CYP2E1: Cytochrom P450 2E1; NAT2: N-Acetyltransferase 2; GST: Glutathion S-transferase) M Nồng độ ức chế tối thiểu huyết INH với vi khuẩn lao 0,04 µg/mL Nồng độ INH huyết người khác phụ thuộc vào kiểu hình acetyl hóa cá thể Khi uống INH liều mg/kg sau 1-2 đạt of nồng độ tối đa huyết tương trung bình 3-5 µg/mL [3] Liều chuẩn theo phác đồ Bộ y tế với INH mg (4-6 mg)/kg/ngày cho ol trẻ em người lớn, liều hàng ngày tối đa 300 mg, nên uống lần lúc đói Sc ho Liều cách quãng lần/tuần 10 mg/kg thể trọng (8-12 mg), liều cách quãng lần/tuần 15 mg/kg thể trọng (13-17 mg) [1] 1.3.3.2 Độc tính INH với thể @ Tương tác thuốc: Isoniazid ức chế chuyển hóa số thuốc Khi dùng kết hợp isoniazid với thuốc làm tăng nồng độ huyết làm tăng độc ht tính thuốc phối hợp, thuốc chữa động kinh Các thuốc phối hợp với py rig isoniazid phải điều chỉnh liều gồm có alfentanil, chất chống đông máu dẫn chất coumarin, dẫn chất indandion, benzodiazepin, carbamazepin, theophylin, phenytoin, enfluran, disulfiram cycloserin [21] Khi dùng đồng thời rifampicin, Co acetaminophen, rượu với isoniazid làm tăng độc tính với gan, đặc biệt người có tiền sử suy gan Isoniazid làm giảm nồng độ ketoconazole (thuốc điều trị nấm) huyết thanh, làm giảm tác dụng điều trị nấm thuốc Các corticoid làm tăng thải trừ isoniazid, làm giảm nồng độ tác dụng isoniazid, đặc 12 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ... cứu chúng tơi ti? ?n hành đề tài “X? ?y dựng quy trình ph? ?n tích số đa hình gen N- acetyltransferase li? ?n quan đ? ?n đáp ứng điều trị isoniazid rm người bệnh lao? ?? với mục tiêu n? ??i dung nghi? ?n cứu sau:...ac y, VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ N? ??I KHOA Y DƯỢC an d Ph a rm KIỀU HỒNG NHUNG X? ?Y DỰNG QUY TRÌNH PH? ?N TÍCH ed ici ne MỘT SỐ ĐA HÌNH GEN N- ACETYLTRANSFARASE LI? ?N QUAN Đ? ?N ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ ISONIAZID. .. tiêu nghi? ?n cứu: Ph a - X? ?y dựng quy trình ph? ?n tích số đa hình di truy? ?n gen NAT2 an d người bệnh mắc lao Việt Nam - Áp dụng quy trình tối ưu để bước đầu đánh giá mức độ đa hình di truy? ?n gen NAT2